孫強(qiáng) 趙軼男 王遠(yuǎn)瑞 張大偉

骨關(guān)節(jié)炎 ( osteoarthritis，OA ) 作為一種以關(guān)節(jié)基質(zhì)破壞和關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞減少為主要特點(diǎn)的退行性病變，導(dǎo)致患者關(guān)節(jié)畸形及運(yùn)動功能障礙[1]。近年來，OA 在中老年人中的發(fā)病率呈不斷上升趨勢[2]。目前，OA 尚無明確的有效根治手段，臨床治療上主要是控制疼痛、改善關(guān)節(jié)功能和提高患者生活質(zhì)量。在保守治療無效時(shí)，可通過軟骨移植、關(guān)節(jié)清理和關(guān)節(jié)置換等外科手術(shù)治療[3]。OA 發(fā)病是多因素、多步驟相互作用的復(fù)雜過程，其中基因的異常表達(dá)發(fā)揮著重要作用[4]。Long non-coding RNAs( lncRNAs ) 是非編碼 RNA 的一個(gè)亞類，長度超過200nt，較編碼 RNA 具有更強(qiáng)的組織特異性和細(xì)胞特異性，在不同細(xì)胞、組織及其不同發(fā)育階段，表達(dá)均有不同與多種疾病的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)[5]。LncRNAs 在發(fā)育、分化、細(xì)胞增殖凋亡、代謝等過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[6]。生物信息學(xué)預(yù)測，人類基因組中存在大量 LncRNAs，這使得其成為最大的一類基因表達(dá)調(diào)控因子，調(diào)控著人類 1 / 3 的基因[7]。研究顯示 lncRNA HOTAIR ( HOTAIR ) 在卵巢癌、靜脈曲張、糖尿病心肌病和冠心病中均發(fā)揮著重要作用[8-11]。同時(shí) lncRNAs 在介導(dǎo) OA 發(fā)病中具有重要調(diào)控作用，然而 HOTAIR 在 OA 中的作用機(jī)制尚未完全明確。因此，本研究采用 RT-PCR 檢測 OA患者和半月板損傷患者膝關(guān)節(jié)軟骨組織中 HOTAIR的表達(dá)水平，同時(shí)在 OA 軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)染 si-HOTAIR或 LV- HOTAIR 后檢測細(xì)胞增殖、分化和下游分子miR-130a-3p 表達(dá)情況，以探討 HOTAIR 在 OA 中的作用及機(jī)制。

材料與方法

一、納入標(biāo)準(zhǔn)與排除標(biāo)準(zhǔn)

1. 納入標(biāo)準(zhǔn)：( 1 ) 心肺功能及肝腎功能正常的患者；( 2 ) 所有 OA 患者診斷符合美國風(fēng)濕學(xué)院標(biāo)準(zhǔn)；( 3 ) 所有患者知情同意并簽署知情同意書。

2. 排除標(biāo)準(zhǔn)：( 1 ) 存在風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和繼發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎等患者；( 2 ) 不能耐受手術(shù)患者。

二、組織標(biāo)本

選取 2016 年 3 月至 2018 年 11 月，在我院住院的 40 例 OA 患者和 40 例單純半月板損傷患者，均來自外傷受損。OA 診斷標(biāo)準(zhǔn)采用美國風(fēng)濕學(xué)院標(biāo)準(zhǔn)，患者平均年齡 ( 62.5±10.2 ) 歲，其中男24 例，女 16 例，半月板損傷患者平均年齡 ( 43.7±9.6 ) 歲，其中男 28 例，女 12 例。所有患者均未患有風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和繼發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎等。在術(shù)中切除膝關(guān)節(jié)軟骨組織，所有組織標(biāo)本分成相同大小并保存于液氮中。術(shù)前所有患者簽署知情同意書。

三、主要試劑

DMEM / F12 細(xì)胞培養(yǎng)基 ( Gibco，Rockville，MD，USA )，CCK-8 試劑盒 ( Beyotime Institute of Biotechnology，Jiangsu，China )，TRIzol Reagent ( Life Technologies Corporation，Carlsbad，CA，USA )，RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒 ( TaKaRa，Otsu，Japan )，lipofectamine 2000 ( Invitrogen，Carlsbad，CA，USA )，兔抗人 BMP2、BMP4、BMP6、RUNX2、β-actin 抗體( Sigma-Aldrich，St. Louis，MO，USA )，HRP 標(biāo)記的羊抗兔 IgG ( Abcam，Cambridge，UK )。

四、方法

1. 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染：人軟骨細(xì)胞通過兩步酶消化法進(jìn)行分離，然后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。軟骨組織被剪碎后采用 PBS 沖洗，然后采用 0.25% 的胰蛋白酶消化，震蕩孵育 40 min 后使用 D-Hanks 緩沖液沖洗并以 2 mg / ml 的 II 型膠原酶消化，離心分離軟骨細(xì)胞 ( 半徑 13.5 cm，1200 r / min，離心 15 min )，將原代軟骨細(xì)胞采用含 10% 胎牛血清的 DMEM /F12 細(xì)胞培養(yǎng)基在 37 ℃、5% CO2平衡濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期軟骨細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。采用 INTERFERin 轉(zhuǎn)染試劑并按試劑說明書進(jìn)行 si-HOTAIR、LV- HOTAIR、miR-130a-3p mimics 和miR-130a-3p inhibitors 轉(zhuǎn)染。HOTAIR 干擾序列為5’-GGAGAACACUUAAAUAAGUTT-3’ ( sense ) and 5’-ACUUAUUUAAGUGUUCUCCTA-3’ ( antisense )。細(xì)胞轉(zhuǎn)染采用 Lipofectamine 2000 方法，其具體操作按照說明書進(jìn)行。每組重復(fù)設(shè)置 5 個(gè)孔。

2. qRT-PCR：按照 Trizol 試劑盒步驟提取組織和細(xì)胞中提取總 RNA。采用標(biāo)準(zhǔn)熒光定量 PCR 法檢測。以 β-actin 為內(nèi)參通過 260 nm 和 280 nm 吸光度，qRT-PCR 按照 SYBR Green 試劑盒說明書進(jìn)行反應(yīng)體系的配制，通過 Prime Script? RT 試劑盒檢測 RNA 的濃度，反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成 cDNA。采用比較 CT 值法對獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行相對定量分析。

3. CCK-8 方法檢測細(xì)胞增殖：取對數(shù)生長期的各組細(xì)胞，以 2×103個(gè)密度接種到 96 孔培養(yǎng)板中，常規(guī)培養(yǎng)。各組細(xì)胞分別培養(yǎng)后 24、48、72 和96 h，加人 10 μl 的 CCK-8 溶液，孵育 10 min，用酶標(biāo)儀測定在 405 nm 波長的吸光度進(jìn)行檢測。

4. Westrn blot 法：收集轉(zhuǎn)染后 24 h 的細(xì)胞，常規(guī)提取細(xì)胞總蛋白，BCA 試劑盒測定蛋白濃度，SDS-PAGE 凝膠每孔加入 40 μg 的待測蛋白，110 V電泳，250 mA 電轉(zhuǎn)至 PVDF 膜，5% 脫脂奶粉37 ℃ 封閉 1 h，分別加入 BMP2、BMP4、BMP6、RUNX2、β-actin 一抗 4 ℃ 孵育過夜，TBST 洗膜3×10 min，二抗 37 ℃ 孵育 1 h，TBST 洗膜 3×30 min，ECL 顯影。運(yùn)用 Quantity one 軟件分析蛋白條帶灰度值，以 β-actin 作內(nèi)參，計(jì)算相對表達(dá)量。

5. 雙熒光素酶報(bào)告：將野生型 ( WT ) 或突變型( MUT ) HOTAIR 克隆到 pmirGLO 質(zhì)粒受體中，同時(shí)將 miR-130a-3p mimics 或 miR-NC 導(dǎo)入 OA 軟骨細(xì)胞中，培養(yǎng)后 48 h 采用雙熒光素酶受體分析系統(tǒng)測量雙熒光素活性。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用 SPSS 22.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以±s表示，兩組間采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，Pearson 相關(guān)系分析 HOTAIR 和miR-130a-3p 在 OA 軟骨組織中表達(dá)的相關(guān)性，P＜0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、HOTAIR 在 OA 軟骨組織和細(xì)胞中的表達(dá)水平

HOTAIR 在 OA 軟骨組織中的表達(dá)量明顯高于半月板損傷患者軟骨組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05，圖 1a )，同時(shí)在 OA 軟骨細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯高于正常軟骨細(xì)胞 (P＜0.05，圖 1b )。在進(jìn)一步研究中采用 si-HOTAIR 和 LV-HOTAIR 轉(zhuǎn)染 OA 軟骨細(xì)胞，結(jié)果顯示在 OA 軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)染 si-HOTAIR后 HOTAIR 的表達(dá)水平明顯降低 (P＜0.05，圖 1c )，轉(zhuǎn)染 LV-HOTAIR 后 HOTAIR 的表達(dá)水平明顯升高(P＜0.05，圖 1d )。

二、HOTAIR 對 OA 軟骨細(xì)胞增殖和分化的影響

在 OA 軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)染 si-HOTAIR 后，將 OA 軟骨細(xì)胞培養(yǎng) 3 天，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染 si-HOTAIR 后，OA 軟骨細(xì)胞增殖能力較轉(zhuǎn)染 si-NC 組明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05，圖 2a )；在轉(zhuǎn)染 LVHOTAIR 后，OA 軟骨細(xì)胞增殖能力較轉(zhuǎn)染 LV-NC 組明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05，圖 2b )。進(jìn)一步分析 HOTAIR 對 OA 軟骨細(xì)胞分化的影響，采用 RT-PCR 和 western blot 檢測軟骨分化相關(guān)分子BMP2、BMP4、BMP6 和 RUNX2 mRNA 和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)染 si-HOTAIR 后，OA 軟骨細(xì)胞 BMP2、BMP4、BMP6 和 RUNX2 mRNA 和蛋白表達(dá)水平較轉(zhuǎn)染 si-NC 組明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P均＜0.05，圖 2c、d )；在轉(zhuǎn)染 LV-HOTAIR后，OA 軟骨細(xì)胞 BMP2、BMP4、BMP6 和 RUNX2 mRNA 和蛋白表達(dá)水平較轉(zhuǎn)染 LV-NC 組明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P均＜0.05，圖 2e、f )。

三、HOTAIR 對 OA 軟骨細(xì)胞 miR-130a-3p 表達(dá)的影響

為進(jìn)一步分析 HOTAIR 對 OA 軟骨細(xì)胞增殖和分化影響的調(diào)控機(jī)制，在 OA 軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)染 si-HOTAIR后，miR-130a-3p 的表達(dá)水平明顯升高 (P＜0.05，圖 3a )；同時(shí)在轉(zhuǎn)染 LV-HOTAIR 后，miR-130a-3p的表達(dá)水平明顯降低 (P＜0.05，圖 3b )。miR-130a-3p 在 OA 軟骨細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯低于正常軟骨細(xì)胞 (P＜0.05，圖 3c )。采用 Pearson 相關(guān)系分析顯示 HOTAIR 和 miR-130a-3p 在 OA 軟骨組織中的表達(dá)水平呈明顯負(fù)相關(guān) (r＝-0.977，P＜0.05；圖 3d )。

四、HOTAIR 能夠靶向結(jié)合 miR-130a-3p

HOTAIR 和 miR-130a-3p 的靶點(diǎn)結(jié)合情況詳見圖 4a，進(jìn)一步采用雙熒光素酶報(bào)告分析顯示HOTAIR-WT 組中轉(zhuǎn)染 miR-130a-3p mimics 后雙熒光素活性明顯下降 (P＜0.05，圖 4b )，在 HOTAIRMUT 組中轉(zhuǎn)染 miR-130a-3p mimics 后雙熒光素活性未見明顯改變 (P＞0.05，圖 4c )。在進(jìn)一步研究中采用 miR-130a-3p mimics 和 miR-130a-3p inhibitors轉(zhuǎn)染 OA 軟骨細(xì)胞，結(jié)果顯示在 OA 軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)染 miR-130a-3p mimics 后 miR-130a-3p 的表達(dá)水平明顯升高 (P＜0.05，圖 4c )，轉(zhuǎn)染 miR-130a-3p inhibitors 后 miR-130a-3p 的表達(dá)水平明顯降低 (P＜0.05，圖 4d )。

五、HOTAIR 通過調(diào)控 miR-130a-3p 影響 OA軟骨細(xì)胞增殖和分化

圖 1 HOTAIR 在 OA 軟骨組織和細(xì)胞中的表達(dá)水平 a：半月板損傷軟骨組織和 OA 軟骨組織中 HOTAIR 表達(dá)水平；b：正常軟骨細(xì)胞和 OA 軟骨細(xì)胞中 HOTAIR 表達(dá)水平；c：OA 軟骨細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染 si-NC 和 si-HOTAIR；d：OA 軟骨細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染 LV-NC 和 LV-HOTAIRFig.1 Expressions of HOTAIR in cartilage tissues and cells of OA a: Expressions of HOTAIR in OA and meniscus injury tissues; b: Expressions of HOTAIR in normal chondrocytes and OA chondrocytes; c: OA chondrocyte transfection with si-NC and si- HOTAIR; d: OA chondrocyte transfection with LV-NC and LV-HOTAIR

圖 2 HOTAIROA 軟骨細(xì)胞增殖和分化的影響 a～b：轉(zhuǎn)染 si-HOTAIR 和 LV-HOTAIR 后 OA 軟骨細(xì)胞增殖情況；c、e：轉(zhuǎn)染 si-HOTAIR 后 OA 軟骨細(xì)胞 BMP2、BMP4、BMP6 和 RUNX2 mRNA 表達(dá)水平；d、f：轉(zhuǎn)染 LV-HOTAIR 后 OA 軟骨細(xì)胞 BMP2、BMP4、BMP6 和 RUNX2 蛋白表達(dá)水平Fig.2 Effects of HOTAIR on the proliferation and differentiation of OA chondrocytes a - b: The proliferation of OA chondrocytes after transfection with si- HOTAIR and LV-HOTAIR; c, e: mRNA expressions of BMP2, BMP4, BMP6 and RUNX2 in OA chondrocytes after transfection with si-HOTAIR and LV-HOTAIR; d, f: Protein expressions of BMP2, BMP4, BMP6 and RUNX2 in OA chondrocytes after transfection with si-HOTAIR and LV-HOTAIR

圖 3 HOTAIR 對 OA 軟骨細(xì)胞 miR-130a-3p 表達(dá)的影響 a～b：轉(zhuǎn)染 si-HOTAIR 和 LV-HOTAIR 后 OA 軟骨細(xì)胞 miR-130a-3p 表達(dá)水平；c：正常軟骨細(xì)胞和 OA 軟骨細(xì)胞中 miR-130a-3p 表達(dá)水平；d：HOTAIR 和 miR-130a-3p 在 OA 軟骨組織中表達(dá)相關(guān)性Fig.3 Effects of HOTAIR on the miR-130a-3p expressions of OA chondrocytes a - b: miR-130a-3p expressions of OA chondrocytes after transfection with si- HOTAIR and LV- HOTAIR; c: Expressions of miR-130a-3p in normal chondrocytes and OA chondrocytes; d: Expression correlation of HOTAIR and miR-130a-3p in OA cartilage

圖 4 HOTAIR 能夠靶向結(jié)合 miR-130a-3p a：HOTAIR 和 miR-130a-3p 的靶點(diǎn)結(jié)合情況；b：HOTAIR-WT 和 HOTAIR-MUT 組中雙熒光素酶活性；c：OA 軟骨細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染 miR-NC 和 miR-130a-3p mimics；d：OA 軟骨細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染 miR-NC 和 miR-130a-3p inhibitorsFig.4 HOTAIR targeted miR-130a-3p a: Target binding of HOTAIR and miR-130a-3p; b: Double luciferase activity in HOTAIR -WT and HOTAIR -MUT group; c: Expressions of miR-130a-3p in OA chondrocytes after transfection with miR-NC and miR-130a-3p mimics; d:Expressions of miR-130a-3p in OA chondrocytes after transfection with miR-NC and miR-130a-3p inhibitors

進(jìn)一步驗(yàn)證 HOTAIR 是通過靶向結(jié)合 miR-130a-3p 調(diào)控 OA 軟骨細(xì)胞增殖和分化，在 OA 軟骨細(xì)胞共轉(zhuǎn)染 si-HOTAIR 和 miR-130a-3p inhibitors后，OA 軟骨細(xì)胞增殖能力和單獨(dú)轉(zhuǎn)染 si-NC 組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05，圖 5a )，在 OA 軟骨細(xì)胞共轉(zhuǎn)染 si-HOTAIR 和 miR-130a-3p mimics 后，OA 軟骨細(xì)胞增殖能力較單獨(dú)轉(zhuǎn)染 si-HOTAIR 和si-NC 組均明顯增加 (P均＜0.05，圖 5b )。同時(shí)在 OA 軟骨細(xì)胞共轉(zhuǎn)染 si-HOTAIR 和 miR-130a-3p inhibitors 后，OA 軟骨細(xì)胞 BMP2、BMP4、BMP6 和RUNX2 mRNA 和蛋白表達(dá)水平與單獨(dú)轉(zhuǎn)染 si-NC 組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05，圖 5c、d )，在共轉(zhuǎn)染si-HOTAIR 和 miR-130a-3p mimics 后，OA 軟骨細(xì)胞 BMP2、BMP4、BMP6、RUNX2 mRNA 和蛋白表達(dá)水平較單獨(dú)轉(zhuǎn)染 si-HOTAIR、si-NC 組均明顯增加 (P均＜0.05，圖 5e、f )。

討 論

在 OA 的研究過程中，骨代謝、基質(zhì)降解、免疫炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、干細(xì)胞等方面的治療已經(jīng)投入臨床應(yīng)用，但尚未達(dá)到預(yù)期的治療效果[12]。已有研究證實(shí) lncRNA 與多種疾病相關(guān)，包括骨關(guān)節(jié)病[13]。一些學(xué)者指出 lncRNAs 在介導(dǎo) OA 發(fā)病中具有重要調(diào)控作用，并通過基因芯片與高通量 DNA 測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)在軟骨分化過程中有 2166 個(gè) lncRNAs 表達(dá)上調(diào)，1472 個(gè) lncRNAs 表達(dá)下調(diào)，這為 OA 的治療提供新希望[14]。lncRNA 在 OA 的發(fā)展中表現(xiàn)出類似網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控模式，并且每種 lncRNA 不僅起著它們各自的作用，而且在 OA 中也相互聯(lián)系[15]。因此，lncRNAs 在 OA 的發(fā)生發(fā)展，診斷和預(yù)后中起重要作用。然而，體內(nèi) lncRNAs 對 OA 的調(diào)控仍有待進(jìn)一步研究。

在本研究中，通過檢測 OA 軟骨組織和軟骨細(xì)胞中 HOTAIR 的表達(dá)水平，結(jié)果顯示 HOTAIR 在OA 軟骨組織和軟骨細(xì)胞中均存在明顯高表達(dá)。進(jìn)一步采用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證 HOTAIR 對 OA 軟骨細(xì)胞的影響，采用 si-HOTAIR 和 LV-HOTAIR 轉(zhuǎn)染至 OA軟骨細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染 si-HOTAIR 后 OA 軟骨細(xì)胞中HOTAIR 表達(dá)水平明顯下降，在轉(zhuǎn)染 LV-HOTAIR 后OA 軟骨細(xì)胞中 HOTAIR 表達(dá)水平明顯升高。同時(shí)在低表達(dá) HOTAIR 后 OA 軟骨細(xì)胞的增殖能力明顯增加，分化相關(guān)分子 BMP2、BMP4、BMP6 和 RUNX2的表達(dá)明顯升高，在過表達(dá) HOTAIR 后 OA 軟骨細(xì)胞的增殖和分化明顯下降。這說明 HOTAIR 在 OA中高表達(dá)，并能抑制 OA 軟骨細(xì)胞的增殖和分化。Wei 等研究顯示 HOTAIR 在非創(chuàng)傷性股骨頭壞死中明顯高表達(dá)，并能夠通過調(diào)控 miR-17-5p / SMAD7通路抑制間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和分化[16]。同時(shí) Hu等就顯示 HOTAIR 在 OA 軟骨組織中高表達(dá)，并能調(diào)控 miR-17-5p / FUT2 / β-catenin 軸抑制 OA 軟骨細(xì)胞的增殖、分化和促進(jìn) OA 軟骨細(xì)胞的凋亡[17]。這均提示 HOTAIR 參與了 OA 的發(fā)生發(fā)展，但其具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步明確。

圖 5 HOTAIR 調(diào)控 miR-130a-3p 對 OA 軟骨細(xì)胞增殖和分化的影響 a：轉(zhuǎn)染 si-HOTAIR 和共轉(zhuǎn)染 si-HOTAIR 與 miR-130a-3p inhibitors后 OA 軟骨細(xì)胞增殖情況；b：轉(zhuǎn)染 si-HOTAIR 和共轉(zhuǎn)染 si-HOTAIR 與 miR-130a-3p mimics 后 OA 軟骨細(xì)胞增殖情況；c～d：轉(zhuǎn)染si-HOTAIR 和共轉(zhuǎn)染 si-HOTAIR 與 miR-130a-3p inhibitors 后 OA 軟骨細(xì)胞 BMP2、BMP4、BMP6、RUNX2 mRNA 和蛋白表達(dá)水平；e～f：轉(zhuǎn)染 si-HOTAIR 和共轉(zhuǎn)染 si-HOTAIR 與 miR-130a-3p mimics 后 OA 軟骨細(xì)胞 BMP2、BMP4、BMP6、RUNX2 mRNA 和蛋白表達(dá)水平Fig.5 Effects of HOTAIR on the proliferation and differentiation of OA chondrocytes by regulating expressions of miRNA-130a-3p a: The proliferation of OA chondrocytes after transfection with si-HOTAIR or co- transfection with si-HOTAIR and miR-130a-3p inhibitors; b: The proliferation of OA chondrocytes after transfection with si-HOTAIR or co- transfection with si-HOTAIR and miR-130a-3p mimics; c - d: mRNA and protein expressions of BMP2, BMP4, BMP6 and RUNX2 in OA chondrocytes after transfection with si-HOTAIR or co- transfection with si-HOTAIR and miR-130a-3p inhibitors; e - f: mRNA and protein expressions of BMP2, BMP4, BMP6 and RUNX2 in OA chondrocytes after transfection with si-HOTAIR or co- transfection with si-HOTAIR and miR-130a-3p mimics

miRNAs 是一類普遍存在于生物體基因組，長度僅為 20～24 nt 的非編碼小分子 RNA[18]。同時(shí)LncRNA 具有能夠識別互補(bǔ)序列，可以與 miRNAs 進(jìn)行靶向結(jié)合。隨著人們對 miRNAs 的深入研究，越來越多的證據(jù)表明其與骨關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松癥、骨腫瘤等多種骨疾病的發(fā)病與病情進(jìn)展密切相關(guān)。研究顯示 miR-130a 能夠調(diào)控骨再生、骨髓脂肪細(xì)胞分化等[19-21]。在本研究顯示 miR-130a-3p 在 OA 軟骨細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯降低，同時(shí) HOTAIR 和 miR-130a-3p 在 OA 軟骨組織中的表達(dá)水平呈明顯負(fù)相關(guān)。這提示 HOTAIR 可能調(diào)控 miR-130a-3p 影響OA 軟骨細(xì)胞的增殖和分化。在進(jìn)一步研究中，雙熒光素酶報(bào)告分析顯示 HOTAIR 能夠靶向結(jié)合 miR-130a-3p，這證實(shí)了 HOTAIR 對 miR-130a-3p 的直接調(diào)控作用。同時(shí) Lu 等研究顯示 lncRNA-CIR 能夠靶向結(jié)合 miR-130a-3p 影響 OA 軟骨細(xì)胞炎癥因子釋放和細(xì)胞凋亡[22]。同時(shí) Ma 等研究顯示 HOTAIR能夠靶向結(jié)合 miR-130a-3p 調(diào)控膽囊癌的發(fā)生發(fā)展[23]。這均提示 HOTAIR 靶向調(diào)節(jié) miR-130a-3p 參與了 OA 軟骨細(xì)胞的增殖和分化。

為了進(jìn)一步反向驗(yàn)證 HOTAIR 通過 miR-130a-3p 調(diào)控 OA 的發(fā)生發(fā)展。在本研究中，OA 軟骨細(xì)胞共轉(zhuǎn)染 si-HOTAIR 和 miR-130a-3p inhibitors 后，OA 軟骨細(xì)胞增殖和分化能力與單獨(dú)轉(zhuǎn)染 si-NC 組未見明顯差異，同時(shí)共轉(zhuǎn)染 si-HOTAIR 和 miR-130a-3p mimics 后，OA 軟骨細(xì)胞增殖和分化能力較單獨(dú)轉(zhuǎn)染 si-HOTAIR 和 si-NC 組均明顯增加。這提示 HOTAIR 通過靶向結(jié)合 miR-130a-3p，從而抑制miR-130a-3p 的表達(dá)，進(jìn)而抑制 OA 軟骨細(xì)胞的增殖和分化。

綜上所述，HOTAIR 在 OA 軟骨組織和細(xì)胞中明顯高表達(dá)，并能夠通過靶向結(jié)合 miR-130a-3p 抑制 OA 軟骨細(xì)胞的增殖和分化。HOTAIR 可能成為OA 治療的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。