苗竹林 鐘興明 崔 蓉 黃密瓊 鐘文瑤 王永霞 趙文忠 張碧云

廣東省計劃生育?？漆t(yī)院，廣東省計劃生育科學(xué)技術(shù)研究所(廣州，510600)

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(RSA)病因復(fù)雜，有研究表明，妊娠期免疫細(xì)胞及免疫因子在母體全身及子宮局部-胎盤-胎兒之間發(fā)生了很大的變化，免疫因素在生理與病理妊娠中起重要作用[1]。目前，針對妊娠后免疫及免疫效應(yīng)細(xì)胞已進行了大量基礎(chǔ)研究[2]，一些學(xué)者將T輔助細(xì)胞及其產(chǎn)生的細(xì)胞因子在疾病中的變化描述為：正常妊娠狀態(tài)下為Th2優(yōu)勢狀態(tài)[3]，一些病理妊娠如復(fù)發(fā)性流產(chǎn)等是Th1/Th2失衡，或者向Th1偏移的狀態(tài)[4]。盡管文獻報道Th1、Th2偏移是判斷妊娠結(jié)局的可靠指標(biāo)，但在臨床一直未得到有效利用，尤其在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)方面缺乏可靠的臨床資料。本研究采用流式細(xì)胞檢測技術(shù)檢測血清中Th1、Th2，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2012年1月—2018年5月本院就診患者。非妊娠期復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者310例為RSA組，同期無復(fù)發(fā)性流產(chǎn)病史的健康婦女220例為對照組；早孕期，有復(fù)發(fā)性流產(chǎn)史140例為早孕RSA組，無自然流產(chǎn)史102例為早孕對照組；稽留流產(chǎn)患者19例。

1.2 流式細(xì)胞檢測

取外周血進行檢測。FACS Calibur流式細(xì)胞儀(美國Becton Dickinson公司)，鼠抗人熒光單克隆抗體(美國BD公司)，佛波酯 (PMA)、離子霉素(Ion)、蛋白轉(zhuǎn)運阻滯劑(BFA)、裂解液及破膜劑(Beyotime公司)，4℃避光保存。FCM檢測胞內(nèi)細(xì)胞因子實驗：取150μl全血標(biāo)本于流式管中，加入150μl RPMI1640(不含小牛血清-FBS)，10μl 1μg/ml PMA，10μl 50μg/ml Ionomycin以及10μl 0.5mg/ml BFA工作液，混勻；37℃，5%CO2培養(yǎng)3～6h。加入10μl CD3PerCP和2μl CD8APC，室溫避光孵育15min；裂解，破膜后加入IFN-γ/IL-4抗體室溫避光孵育20min，離心后棄除上清，上機檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 一般情況

RSA和對照組年齡(19～43)歲，早孕RSA組與早孕對照組年齡(20～43)歲及孕(6～12)周。

2.2 Th1與Th2細(xì)胞檢測

細(xì)胞經(jīng)過刺激之后，流式細(xì)胞術(shù)檢測中在前散射(FSC)和側(cè)散射(SSC)的二維Dot-plot圖中區(qū)分淋巴細(xì)胞群，對CD3+細(xì)胞設(shè)門，獲得CD3+CD8+和CD3+CD8-兩群細(xì)胞，以CD3和CD8陰性細(xì)胞反向設(shè)門來代替CD4細(xì)胞，Th1(CD4+/IFN-γ+)和Th2細(xì)胞(CD4+/IL-4+)穩(wěn)定表達，見圖1。

圖1 Th1(CD4+/IFN-γ+)和Th2細(xì)胞(CD4+/IL-4+)流式細(xì)胞圖

2.3 RSA組與對照組Th1、Th2值比較

兩組比較無差異(P>0.05)，均為Th1優(yōu)勢狀態(tài)，見表1。

2.4 早孕RSA組與早孕對照組Th1、Th2值比較

早孕RSA組與早孕對照組比較無差異(P>0.05)，均為Th1優(yōu)勢狀態(tài)，見表2。

2.5 稽留流產(chǎn)患者Th1、Th2值變化

19例稽留流產(chǎn)患者 Th1為26.66±18.65，Th2為4.21±2.27，處于Th1優(yōu)勢狀態(tài)，Th1/Th2>1，未見向Th2優(yōu)勢狀態(tài)偏移，與對照組比較無差異(P>0.05)。

表1 兩組Th1、Th2值比較

表2 兩組Th1、Th2值比較

3 討論

3.1 T淋巴細(xì)胞亞群及其細(xì)胞因子臨床作用

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)病因復(fù)雜，近年來有研究表明免疫因素在妊娠中起重要作用。淋巴細(xì)胞作為主要的免疫細(xì)胞， T淋巴細(xì)胞通過分泌細(xì)胞因子調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的生長、分化和功能，調(diào)節(jié)正常與病理狀態(tài)下的免疫應(yīng)答，因此，細(xì)胞因子的變化是判斷疾病病因與免疫狀態(tài)的重要依據(jù)[5]。T輔助細(xì)胞根據(jù)自身分泌的細(xì)胞因子分成Th1、Th2兩個亞群，Th1細(xì)胞主要分泌IL-2、IFN-γ和TNF-β等細(xì)胞因子，其作用主要是介導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)，在誘發(fā)器官特異性自身免疫病、器官移植排斥反應(yīng)和抗感染免疫中起重要免疫調(diào)節(jié)作用。Th2細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL-13等細(xì)胞因子，主要是調(diào)節(jié)體液免疫反應(yīng)，在誘發(fā)過敏等反應(yīng)中起著決定性的作用[6]。

3.2 Th1、Th2、Th1/Th2平衡與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)

20世紀(jì)90年代，Wegmann[7]等首次通過動物實驗研究報道，哺乳類的正常妊娠是一種Th2優(yōu)勢現(xiàn)象，蛻膜表達以IL-4為主的Th2型細(xì)胞因子，母體處于免疫耐受狀態(tài)；但如果表達以IFN-γ、TNF-α為主的Th1型細(xì)胞因子，就會被母體免疫系統(tǒng)所排斥導(dǎo)致流產(chǎn)[8]。也有研究對RSA患者和正常妊娠婦女體內(nèi)T淋巴細(xì)胞及其亞群的生物學(xué)特點進行比較分析，發(fā)現(xiàn)隨著妊娠進展，胎盤產(chǎn)生細(xì)胞因子和激素通過影響Th1/Th2的平衡參與調(diào)節(jié)母體的免疫反應(yīng)來維持正常妊娠[9]。目前普遍認(rèn)為正常妊娠中T輔助細(xì)胞向Th2偏移是一種特殊的Th2優(yōu)勢現(xiàn)象，Th1細(xì)胞因子過度表達可導(dǎo)致妊娠丟失，Th1/Th2平衡偏移與RSA密切相關(guān)。目前免疫對妊娠影響的基礎(chǔ)研究已經(jīng)由Th1/Th2模式逐漸發(fā)展為Th1/Th2/Th17/Treg模式，但對臨床的指導(dǎo)價值仍有限[10]。針對Th1、Th2、Th1/Th2平衡的研究多集中于動物實驗或子宮局部[11]，而女性外周血Th1、Th2變化及其意義尚不明確，缺乏臨床大樣本的研究資料。本研究結(jié)果，妊娠前后生理與病理妊娠狀態(tài)兩組女性均處于Th1優(yōu)勢狀態(tài)，未發(fā)現(xiàn)Th1/Th2偏移現(xiàn)象，稽留流產(chǎn)患者同樣未見Th1/Th2失衡。

3.3 流式細(xì)胞檢測Th1/Th2影響因素分析

流式細(xì)胞檢測主要用于檢測T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞及其亞群[12]，而在檢測Th1、Th2等細(xì)胞變化時一般通過檢測其產(chǎn)生的特異性細(xì)胞因子的分泌來間接判斷細(xì)胞亞群的變化[13]。本實驗同時標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子IFN-γ和IL-4來檢測Th1細(xì)胞(CD4+/IFN-γ+)和Th2細(xì)胞(CD4+/IL-4+)。但是，靜止的淋巴細(xì)胞進行特異性免疫應(yīng)答時分泌的細(xì)胞因子很少，難以準(zhǔn)確檢測到。為了評估其功能，需要通過T細(xì)胞活化刺激劑誘導(dǎo)細(xì)胞活化使其分泌大量細(xì)胞因子，提高流式細(xì)胞術(shù)檢測的敏感度和效率[14]。本研究中，PMA+Ion刺激后CD8陰性細(xì)胞反向設(shè)門可以獲得穩(wěn)定的細(xì)胞因子，實驗方法及結(jié)果穩(wěn)定可靠。復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者妊娠前Th1、Th2、Th1/Th2值與對照組比較、妊娠期有復(fù)發(fā)性流產(chǎn)史者與對照組比較均未見差異，未發(fā)現(xiàn)有Th2優(yōu)勢狀態(tài)。

由于本研究檢測Th1、Th2時操作程序復(fù)雜，時間長，使用抗體及試劑種類多，影響因素多，任何一個環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題都會影響檢測結(jié)果。因此，在評估復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的免疫因素時，研究人員需做好實驗操作質(zhì)量控制。本研究結(jié)果是否與刺激劑選擇有關(guān)還需進一步研究。而檢測Th1、Th2細(xì)胞亞群時，只有在檢測方法學(xué)上保持一致才能判斷其臨床應(yīng)用價值。流式微球陣列術(shù)對不同熒光強度的捕獲微球表面分別包被IL-2、IL-4、IL-6、IL-10和腫瘤壞死因子α(TNF-α)特異性抗體，可定量樣本中IL2、IL4、IL6、IL10、和TNF-α的含量，并同時檢測幾種細(xì)胞因子，該方法是否可替代刺激法檢測Th1、Th2、Th1/Th2值得研究。