于 彬 王 梅 孫 艷 黃孔云

1.山東省棗莊市婦幼保健院(277102)；2.山東省安丘市婦幼保健院；3.山東中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院

避孕疫苗由于具有專屬特異性好、效果持久、作用可逆等特點, 在避孕藥具中具有廣闊的發(fā)展前景[1]。DNA 疫苗即基因疫苗，是指將編碼某種蛋白質(zhì)抗原的重組真核表達(dá)載體直接注射到動物體內(nèi)，使外源基因在體內(nèi)表達(dá)，產(chǎn)生抗原激活機體的免疫系統(tǒng)，從而誘導(dǎo)特異性的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，因其具有成本低廉、制備簡單、使用安全、免疫效果好等優(yōu)點已成為疫苗研究領(lǐng)域中一個重要的戰(zhàn)略方向[2]。在哺乳動物中，富含半胱氨酸分泌蛋白-1(Crisp-1)分布于附睪頭部上皮細(xì)胞，是一種雄激素依賴型糖蛋白[3]，在進(jìn)化上高度保守，參與哺乳動物精子獲能、精卵結(jié)合和融合過程，在生育抑制研究領(lǐng)域中是一種潛在靶點。本研究用制備的Crisp-1DNA疫苗免疫雌性和雄性BALB/c小鼠, 探討Crisp-1DNA疫苗免疫避孕抗原有效性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

本實驗在山東大學(xué)齊魯醫(yī)院完成。選取6～8周齡SPF級BALB/c小鼠40只，雌雄各半，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，室溫22～24℃，濕度50%～65%，自由攝食及飲水，晝夜交替12h。隨機將雌性小鼠分為觀察A組和對照A組，雄性小鼠分為觀察B組和對照B組，每組各10只。同時選取40只小鼠行避孕效果試驗。

1.2 實驗方法

1.2.1制備疫苗特異性酶切Crisp-1 TA克隆及真核表達(dá)載體pcDNA3.1, 并用T4 DNA連接酶連接上述2個酶切回收產(chǎn)物, 構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.1-Crisp-1, 進(jìn)而轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞。接種從菌落中挑取的 PCR 陽性重組克隆,用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞。

1.2.2免疫腹腔注射戊巴比妥鈉, 待實驗小鼠翻身反應(yīng)消失后, 暴露股四頭肌, 先注射高滲蔗糖溶液, 一定時間后在相同部位注射DNA疫苗,于每只動物兩側(cè)肢體輪流注射, 初次免疫后分別隔周進(jìn)行兩次加強免疫, 每次接種相同DNA疫苗量。實驗組給予pcDNA3.1-Crisp-1DNA疫苗免疫, 對照組給予pcDNA3.1空載體免疫。分別于每次免疫前一天及末次免疫后3周取血眼內(nèi)呲靜脈, 室溫靜置2 h后, 3000r/min離心 20 min, 取上清-70℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3血清Crisp-1檢測酶聯(lián)免疫吸附法(Invitrogen公司生產(chǎn)試劑盒)測定Crisp-1抗體水平: 將重組蛋白作為抗原包被于96孔酶標(biāo)反應(yīng)板中, 37℃ 孵育 1 h后 4℃過夜。每次免疫前和末次免疫后3周的血清1∶ 100稀釋后作為一抗，設(shè)置陰性對照。HRP 標(biāo)記的羊抗小鼠 IgG 作為二抗。加入底物 A、B 液[四甲基聯(lián)苯胺(TMB)-過氧化氫溶液]顯色，終止液終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測OD值，計算樣品濃度。

1.2.4免疫避孕試驗?zāi)┐蚊庖吆?周, 將各組小鼠分別與正常異性小鼠合籠。將次日晨見有陰道栓的雌鼠單獨喂養(yǎng), 隨后觀察各組小鼠的妊娠率和每窩產(chǎn)仔數(shù)。

1.2.5組織學(xué)觀察4組小鼠分別取雙側(cè)卵巢組織或睪丸附睪組織，石蠟切片，HE染色觀察卵巢組織學(xué)變化。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組血清Crisp-1水平比較

血清Crisp-1抗體OD值觀察A組(0.673±0.102)和觀察B組(0.680±0.101)高于對照A組(0.132±0.067)和對照B組(0.128±0.061)(F=43.382，P=0.000)。

2.2 各組小鼠妊娠率比較

小鼠妊娠率觀察A組(3/10，3例)和觀察B組(2/10，2例)低于對照A組(9/10，9例)和對照B組(10/10，10例)(F=21.181，P=0.000)。

2.3 各組小鼠每窩產(chǎn)仔數(shù)比較

每窩產(chǎn)仔數(shù)觀察A組(5.6±0.3只)和觀察B組(5.5±0.9只)低于對照A組(10.1±0.5只)和對照B組(10.0±0.6只)(F=74.033，P=0.000)。

2.4 組織學(xué)觀察

觀察A組和對照組A組小鼠卵巢組織結(jié)構(gòu)正常，無萎縮，無炎性細(xì)胞浸潤，卵泡形態(tài)正常；觀察B組和對照組B組小鼠睪丸、附睪基底膜完整，曲細(xì)精管直徑正常，睪丸內(nèi)有豐富的精子和各級精細(xì)胞，附睪有大量成熟精子。見圖1。

A：觀察A組卵巢 B：對照A組卵巢 C：觀察B組睪丸D：對照B組睪丸 E：觀察B組附睪 F：對照B組附睪圖1 各組小鼠性器官組織HE染色 (200×)

3 討論

雖然醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域發(fā)展為全球育齡男女提供了多種避孕方法,但臨床使用受限[4]。目前研制中有很多種避孕疫苗,國內(nèi)外已發(fā)展的避孕疫苗有抗卵泡生成素疫苗、抗黃體生成激素疫苗、抗促性腺素釋放激素疫苗、抗精抗原、抗卵抗原以及抗人絨毛膜促性腺激素避孕疫苗[5]。抗卵泡生成素疫苗和抗黃體生成激素疫苗因其副作用大在臨床使用并不廣泛[6]。抗黃體生成激素疫苗的制作過程簡便、容易生產(chǎn),但對人體的影響比較廣泛故評價不高[7]?？勾傩韵偎蒯尫偶に匾呙珉m作用顯著,但作用器官較多,不良反應(yīng)較嚴(yán)重,是否有毒副作用以及作用機制尚未闡明,故有很大爭議[8]。在哺乳動物中Crisp-1的發(fā)現(xiàn)推動了男性免疫避孕藥的發(fā)展。

目前研究發(fā)現(xiàn)CRISP-1在哺乳動物體內(nèi)參與精子成熟、獲能、精卵結(jié)合與融合等：①CRISP-1 最初結(jié)合于精子的頂體區(qū), 伴隨頂體反應(yīng)之后遷移到與卵子融合的精子頭部赤道板部位[9]； ②卵細(xì)胞表面可能存在Crisp-1的受體，Crisp-1的多克隆抗體可通過與卵子表面的互補位點相互作用,抑制精子與去透明帶的卵細(xì)胞融合[10]； ③附睪蛋白Crisp-1在蛋白水平上特異性表達(dá)并在功能上物種之間具有同源性,推斷Crisp-1為一個較好的避孕疫苗靶蛋白, 尤其是Crisp-1基因在附睪上的特異性表達(dá)[11]；④CRISP-1可抑制大鼠精子獲能過程中的蛋白酪氨酸磷酸化和孕酮誘導(dǎo)的精子頂體反應(yīng)[12]；⑤DNA疫苗在機體表達(dá)相應(yīng)的抗原蛋白,刺激機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng),成本低廉且使用方便, 比傳統(tǒng)的減毒疫苗和基因工程疫苗更具有優(yōu)勢和應(yīng)用前景[13]。

本研究用以真核表達(dá)質(zhì)粒為載體構(gòu)建Crisp-1 并應(yīng)用PCR技術(shù)克隆出鼠Crisp-1 cDNA疫苗免疫小鼠，結(jié)果顯示其血清Crisp-1抗體值明顯提高。說明Crisp-1 cDNA疫苗可抑制妊娠，降低生育率。雌鼠卵巢組織結(jié)構(gòu)均正常、無萎縮；雄鼠睪丸、附睪基底膜和曲細(xì)精管直徑均完整和正常，睪丸內(nèi)有豐富的精子和各級精細(xì)胞，附睪有大量成熟精子。與對照小鼠未見明顯差異，說明Crisp-1 cDNA疫苗不影響小鼠卵巢和睪丸的正常生理功能和組織結(jié)構(gòu)，安全有效。實驗鼠妊娠率及每窩產(chǎn)仔量均降低,說明該DNA疫苗具有抗生育潛能, 但避孕效果并不理想, 其原因可能是由于載體帶負(fù)電荷, 難以通過雙磷脂細(xì)胞膜, 在體內(nèi)易被酶降解清除[14-15]。因此,要成功開發(fā)基因免疫避孕疫苗, 還需選擇更合適的給藥載體,提高DNA疫苗在體內(nèi)主動免疫避孕效果。

總之, DNA 疫苗pcDNA3.1-Crisp-1可以誘導(dǎo)雌、雄性BALB/c 小鼠產(chǎn)生特異性抗mCrisp-1 抗體,在一定程度上抑制了小鼠的生育能力,是研究基因免疫避孕疫苗的理想靶點，值得深入研究。