李小波，李臻，戴紹軍，潘教文，王慶國(guó)，管延安，丁國(guó)華，劉煒, 5

谷子類受體蛋白激酶基因在水稻中對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)

李小波1, 2，李臻2，戴紹軍3，潘教文2，王慶國(guó)2，管延安4, 5，丁國(guó)華1，劉煒2, 5

（1哈爾濱師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150025；2山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心/山東省作物遺傳改良與生理生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250100；3上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院/植物種質(zhì)資源開(kāi)發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心，上海 200234；4山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所/ 山東省特色作物工程實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250100；5山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，濟(jì)南 250014）

【】鹽脅迫影響作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，而作物的耐鹽性受特定基因的調(diào)控。在前期獲得谷子類受體蛋白激酶基因過(guò)表達(dá)水稻株系的基礎(chǔ)上，擬結(jié)合植株在鹽脅迫下的表型，對(duì)部分鹽脅迫指標(biāo)及響應(yīng)基因的表達(dá)模式進(jìn)行檢測(cè)和驗(yàn)證，解析谷子參與鹽害響應(yīng)的可能機(jī)制。選取谷子過(guò)表達(dá)水稻株系，分別為過(guò)表達(dá)株系（over-expression，OE）-1（OE-1）、OE-2和OE-3，以野生型中花11為對(duì)照，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）檢測(cè)各株系中的表達(dá)情況；分別用含0、150和200 mmol·L-1NaCl的MS培養(yǎng)液處理三葉期的對(duì)照及轉(zhuǎn)基因株系幼苗，觀察其表型，統(tǒng)計(jì)150 mmol·L-1NaCl處理3 d后苗長(zhǎng)及根長(zhǎng)；用150 mmol·L-1NaCl處理四葉期幼苗，統(tǒng)計(jì)處理14 d后材料干重、死亡率和死葉率，對(duì)各材料的耐鹽性進(jìn)行評(píng)價(jià)；進(jìn)一步挑選過(guò)表達(dá)程度高且耐鹽表型好的OE-1株系，利用3,3'-二氨基聯(lián)苯胺（3,3'-Diaminobenzidine，DAB)和氮藍(lán)四唑（nitrotetrazolium blue chloride，NBT）染色檢測(cè)其脅迫下過(guò)氧化物積累及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和過(guò)氧化物酶（peroxidase，POD）的活性；并對(duì)部分鹽害響應(yīng)基因的表達(dá)模式進(jìn)行檢測(cè)。谷子在株系OE-1中的相對(duì)表達(dá)量最高；150 mmol·L-1NaCl處理3 d幼苗后，中花11苗長(zhǎng)和根長(zhǎng)的生長(zhǎng)受抑制程度均大于過(guò)表達(dá)株系，其中OE-1的受抑制程度最小；四葉期幼苗經(jīng)150 mmol·L-1NaCl處理14 d后，轉(zhuǎn)基因株系地上部和地下部干重降低幅度均低于對(duì)照，且幼苗死亡率和死葉率均低于對(duì)照；鹽脅迫下對(duì)照過(guò)氧化染色反應(yīng)明顯，O2-和H2O2的積累均高于過(guò)表達(dá)植株，SOD和POD抗氧化酶活性均高于對(duì)照；部分鹽害響應(yīng)基因在過(guò)表達(dá)株系中表現(xiàn)為上調(diào)，其中，在鹽處理24 h的相對(duì)表達(dá)量是對(duì)照中的1.9倍。谷子異源轉(zhuǎn)化水稻獲得的過(guò)表達(dá)株系對(duì)鹽脅迫具有一定的抗性，可通過(guò)調(diào)控抗氧化酶活性及相關(guān)信號(hào)途徑，從而參與鹽害響應(yīng)。

谷子；；耐鹽性；抗氧化酶；鹽脅迫響應(yīng)基因

0 引言

【研究意義】鹽脅迫是一種典型的非生物脅迫，是影響農(nóng)作物生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量的主要因素之一[1]。鹽脅迫能夠打亂植物體內(nèi)正常的離子分布和動(dòng)態(tài)平衡，破壞細(xì)胞內(nèi)代謝過(guò)程，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)活性氧積累、細(xì)胞膜過(guò)氧化、生物大分子破壞，最終抑制植物的生長(zhǎng)發(fā)育，甚至引起植物死亡[2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，世界鹽堿地面積已達(dá)9.54×108hm2，占可耕地面積的10%。中國(guó)擁有鹽堿地9 913×104hm2，占耕地面積的20%[3]。鹽堿地作為中國(guó)重要的后備土地資源，因其土壤質(zhì)量差、生產(chǎn)效率低而大面積荒蕪，導(dǎo)致這些地區(qū)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)不足，嚴(yán)重制約其區(qū)域經(jīng)濟(jì)發(fā)展[4]。因此，研究農(nóng)作物耐鹽機(jī)制、培育抗逆耐鹽新品種，是農(nóng)業(yè)研究者們的重大責(zé)任。谷子（L.）作為中國(guó)特色雜糧作物，具有C4光合途徑、耐貧瘠、抗逆性強(qiáng)等特點(diǎn)，近年來(lái)已逐漸成為研究C4和抗旱抗逆的模式作物[5]。鑒定谷子抗逆基因及其功能對(duì)于作物遺傳改良及抗逆品種培育具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】類受體蛋白激酶（lectin receptor-like protein kinase，LecRLKs）是植物中最大的基因家族，在調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育、抗逆及抗病等方面發(fā)揮重要作用[6]。其中，凝集素類受體蛋白激酶（LecRLKs）參與鹽脅迫響應(yīng)的報(bào)道較多[7]。位于質(zhì)膜系統(tǒng)中的豌豆凝集素類受體蛋白激酶基因在鹽脅迫條件下表達(dá)明顯上調(diào)，其可通過(guò)增強(qiáng)下游水通道蛋白基因表達(dá)來(lái)提高過(guò)表達(dá)株系的吸水能力，從而減少ROS的積累，提高過(guò)表達(dá)株系的抗鹽性[8]。水稻基因是一種主要在根表皮細(xì)胞中表達(dá)并介導(dǎo)鹽敏感的，參與鹽脅迫信號(hào)的感知和傳導(dǎo)。鹽脅迫激活表達(dá)，通過(guò)磷酸化MAPK3/ MAPK6，促進(jìn)乙烯的合成并增加了活性氧的積累，進(jìn)而導(dǎo)致植株在鹽脅迫下生長(zhǎng)受抑制甚至死亡[9]。通過(guò)抑制的表達(dá)和降低的活性，可明顯提高植物的耐鹽性。除LecRLKs外，其他類型的RLK基因也參與鹽脅迫響應(yīng)。是南極苔蘚中的一種細(xì)胞質(zhì)型類受體蛋白激酶，在鹽處理下，能夠上調(diào)一系列ROS清除基因如、和的表達(dá)，從而減少ROS積累，提高植物對(duì)鹽脅迫的耐受性[10]；是水稻中發(fā)現(xiàn)的富含半胱氨酸的類受體蛋白激酶，是水稻鹽脅迫應(yīng)答中的負(fù)調(diào)控因子，其轉(zhuǎn)錄受2個(gè)AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子OsEREBP1和OsEREBP2的負(fù)調(diào)控[11]。近年來(lái)，也有對(duì)谷子抗鹽基因的研究報(bào)道，如谷子液泡H+-ATPase E亞基基因可通過(guò)正向調(diào)控ABA信號(hào)途徑以及減少植株體內(nèi)Na+積累和水分散失，從而顯著提高擬南芥耐鹽性[12]；黃鎖等[13]發(fā)現(xiàn)谷子核轉(zhuǎn)錄因子基因能夠提高擬南芥中鹽脅迫應(yīng)答基因和的表達(dá)，且主要通過(guò)ABA非依賴途徑提高轉(zhuǎn)基因植物對(duì)鹽脅迫的耐性；秦玉海等[14]發(fā)現(xiàn)谷子轉(zhuǎn)基因擬南芥株系在種子萌發(fā)時(shí)期耐鹽性顯著提高，推測(cè)可能通過(guò)ABA信號(hào)途徑正向調(diào)控植物的耐鹽性；谷子基因在植物抵抗干旱和鹽脅迫中發(fā)揮著重要作用，其表達(dá)受DREB類轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，通過(guò)ABA信號(hào)通路參與植物對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)過(guò)程[15]。谷子（NCBI登錄號(hào)：XM_004956247.2）是作物逆境生物學(xué)研究組前期以谷子豫谷1號(hào)為材料，通過(guò)iTRAQ技術(shù)篩選到的一個(gè)干旱響應(yīng)的類受體蛋白激酶基因。該基因編碼蛋白含有392個(gè)氨基酸，包含一個(gè)S-TKc保守結(jié)構(gòu)域以及一個(gè)TFS2N結(jié)構(gòu)域，含3個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，N端有信號(hào)肽。通過(guò)構(gòu)建雙元植物表達(dá)載體pCAMBIA1301P-，已獲得基因過(guò)表達(dá)水稻株系，初步分析顯示該基因可提高轉(zhuǎn)基因水稻的抗鹽性[16-17]，參與植物的抗逆響應(yīng)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】近年來(lái)，谷子作為一種新型模式作物受到廣泛關(guān)注，但有關(guān)谷子耐鹽基因的鑒定及相關(guān)機(jī)制研究鮮有報(bào)道。開(kāi)展該方面研究對(duì)于解析谷子抗鹽、耐逆機(jī)制，開(kāi)展作物耐鹽品種的改良及選育具有重要意義?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究通過(guò)對(duì)鹽害下谷子異源轉(zhuǎn)化獲得的過(guò)表達(dá)水稻株系表型觀察及鑒定，明確在作物鹽脅迫響應(yīng)中的作用，并對(duì)其參與機(jī)制深入解析，為改良及培育作物耐鹽品種提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

作物逆境生物學(xué)研究組構(gòu)建并獲得谷子過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻株系OE-1、OE-2和OE-3[16-17]，其種子及水稻品種中花11種子均由作物逆境生物學(xué)研究組保存。分別挑選籽粒飽滿的種子于培養(yǎng)皿中浸泡至露白，再移至廣口玻璃瓶于28℃、相對(duì)濕度75%、光照周期（光照16 h/黑暗8 h）的人工氣候培養(yǎng)箱培養(yǎng)至三葉期。

1.2 過(guò)表達(dá)株系的鑒定及谷子SiRLK35的轉(zhuǎn)錄分析

取生長(zhǎng)至三葉期各株系水稻幼苗葉片，-80℃保存?zhèn)溆?。在DNA水平對(duì)過(guò)表達(dá)株系的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性進(jìn)行鑒定。參照全長(zhǎng)序列，利用Primer Premier 5設(shè)計(jì)引物，以水稻（LOC_ Os03g50885）為內(nèi)參，利用熒光定量PCR檢測(cè)在過(guò)表達(dá)株系中的相對(duì)表達(dá)量，引物序列見(jiàn)表1。使用2-ΔCt法計(jì)算在各過(guò)表達(dá)株系中的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因植株的表型分析及干重測(cè)定

前期研究顯示谷子為鹽誘導(dǎo)表達(dá)[16]。將生長(zhǎng)至三葉期的OE-1、OE-2、OE-3及中花11幼苗，分別置于含有0、150和200 mmol·L-1NaCl的MS培養(yǎng)液中進(jìn)行處理，每個(gè)處理20株，設(shè)3個(gè)重復(fù)，對(duì)各材料在不同鹽濃度下的生長(zhǎng)情況進(jìn)行觀察、測(cè)量及拍照記錄。取生長(zhǎng)至三葉期的OE-1、OE-2、OE-3及中花11幼苗在0和150 mmol·L-1NaCl處理3 d，分別測(cè)量苗長(zhǎng)及根長(zhǎng)，每組測(cè)量30株，重復(fù)3次，比較鹽處理前后植株的生長(zhǎng)狀況。

將沙培生長(zhǎng)至四葉期的OE-1、OE-2、OE-3及中花11幼苗用0和150 mmol·L-1NaCl的MS培養(yǎng)液處理，每天補(bǔ)充1/2 MS培養(yǎng)液，每3天換一次溶液，處理14 d后，分別統(tǒng)計(jì)鹽處理后幼苗的死亡率（鹽處理后死苗數(shù)占總苗數(shù)的百分比）和死葉率（鹽處理后枯死葉片數(shù)占總?cè)~片數(shù)的百分比），并進(jìn)一步將材料的地上部和地下部在105℃殺青0.5 h，于80℃烘至恒重，測(cè)定鹽處理前后各株系幼苗及根部干重，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.4 過(guò)氧化物的檢測(cè)、抗氧化酶活性的測(cè)定

參照2014年Kumar等[18]的方法進(jìn)行過(guò)氧化物的染色測(cè)定。剪取150 mmol·L-1NaCl處理3 d后的OE-1和對(duì)照中花11幼苗葉片，分別用DAB和NBT染色液進(jìn)行染色，經(jīng)抽真空處理后染色過(guò)夜，之后加入95%乙醇煮沸10 min進(jìn)行脫色，觀察并拍照。

參照2011年Yu等[19]的方法進(jìn)行抗氧化酶活性測(cè)定。用150 mmol·L-1NaCl處理轉(zhuǎn)基因株系OE-1和中花11三葉期幼苗葉片，分別于處理后0、6、12和 24 h各取0.5 g，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，置于研缽中，加入5 ml 4℃預(yù)冷的提取液和少量石英砂研磨，然后轉(zhuǎn)移至10 ml離心管中，4℃ 12 000 r/min離心20 min，取上清測(cè)定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和過(guò)氧化物酶（peroxidase，POD）活性。

1.5 鹽脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)模式分析

用150 mmol·L-1NaCl處理轉(zhuǎn)基因株系OE-1和中花11三葉期幼苗，分別于處理后0、6、12和24 h取葉片，經(jīng)液氮速凍，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

通過(guò)NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）檢索水稻中鹽脅迫響應(yīng)基因、、、、和，并下載其全長(zhǎng)序列，設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行qRT-PCR分析（表1）。反應(yīng)在ABI PRISM7900HT（Applied Biosystem）熒光定量PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)體系為20 μl，反應(yīng)條件為95℃ 10 min；95℃ 10 s，56℃ 20 s，72℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)。使用2-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量，檢測(cè)基因在鹽處理前后各株系中的相對(duì)表達(dá)量。

表1 基因信息及特異性引物

2 結(jié)果

2.1 谷子SiRLK35陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因純合株系的獲得

通過(guò)進(jìn)一步對(duì)谷子過(guò)表達(dá)水稻株系OE-1、OE-2和OE-3的T4代材料進(jìn)行PCR檢測(cè)（圖1）。結(jié)果顯示，在各過(guò)表達(dá)株系中均獲得1 208 bp的特異性條帶，與谷子預(yù)期大小一致，而對(duì)照中未檢測(cè)到陽(yáng)性條帶，表明基因已整合入各水稻株系基因組中；且各株系種子在40%潮霉素下均可正常萌發(fā)并生長(zhǎng)，經(jīng)T1至T3多代篩選，植株表型不再發(fā)生分離，獲得純合轉(zhuǎn)基因株系。

M：Trans2K Plus DNA Marker；1：對(duì)照中花11；2—3：OE-1；4—5：OE-2；6—7：OE-3

2.2 SiRLK35在各轉(zhuǎn)基因株系中的表達(dá)分析

通過(guò)對(duì)在各轉(zhuǎn)基因株系中的表達(dá)進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)（圖2），結(jié)果顯示，在各轉(zhuǎn)基因株系中，的表達(dá)程度較高，且在OE-1株系的相對(duì)表達(dá)量最高，OE-3次之，OE-2中的表達(dá)最低，而在對(duì)照中幾乎檢測(cè)不到的表達(dá)，與對(duì)照相比，在各轉(zhuǎn)基因株系中的相對(duì)表達(dá)量差異顯著。

***：與水稻中花11相比，OE水稻各株系中SiRLK35的相對(duì)表達(dá)量在P<0.001水平上差異顯著（n=3）。下同

2.3 SiRLK35過(guò)表達(dá)株系的耐鹽性檢測(cè)

對(duì)照及過(guò)表達(dá)株系OE-1、OE-2、OE-3分別經(jīng)0、150和200 mmol·L-1NaCl處理2 d后，其幼苗的生長(zhǎng)均被不同程度地抑制（圖3-A）。但在相同NaCl濃度下，過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系的生長(zhǎng)狀況明顯優(yōu)于對(duì)照。在150 mmol·L-1NaCl處理2 d后，對(duì)照失水嚴(yán)重，出現(xiàn)葉片皺縮卷曲，莖部變細(xì)，葉片持綠程度降低并黃化，抗倒伏能力下降，表現(xiàn)出明顯受害癥狀，而過(guò)表達(dá)株系材料失水不明顯，莖部雖變細(xì)但仍具有一定的韌性，尤其是株系OE-1較為明顯；各材料在200 mmol·L-1NaCl處理2 d后，對(duì)照和過(guò)表達(dá)株系均受害嚴(yán)重，黃化程度高、失水明顯、植株整體細(xì)弱。對(duì)照及轉(zhuǎn)基因株系的地上部與地下部生長(zhǎng)均受鹽脅迫的抑制（圖3-B和圖3-C），其中，地上部分相對(duì)受抑制程度分別為19.78%（對(duì)照）、6.12%（OE-1）、9.36%（OE-2）和8.24%（OE-3）；地下部分相對(duì)受抑制程度分別為14.63%（對(duì)照）、3.09%（OE-1）、8.92%（OE-2）和3.98%（OE-3）；對(duì)照受抑制程度均明顯大于轉(zhuǎn)基因株系，但OE-1及OE-3的幼苗及根部在鹽處理前后長(zhǎng)度均差異不顯著。

A：0、150和200 mmol·L-1 NaCl處理2 d后各株系表型，標(biāo)尺=5 cm；B：0和150 mmol·L-1 NaCl處理3 d后各株系的株高；C：0和150 mmol·L-1 NaCl處理3 d后各株系的根長(zhǎng)；D：0和150 mmol·L-1 NaCl處理14 d后各株系地上部分單株干重相對(duì)減少量；E：0和150 mmol·L-1 NaCl處理14 d后各株系地下部分單株干重相對(duì)減少量；F：150 mmol·L-1 NaCl處理14 d后各株系的死亡率；G：150 mmol·L-1 NaCl處理14 d后各株系的死葉率；*在P＜0.05水平上差異顯著（n=3）；**在P＜0.01水平上差異顯著（n=3）。下同

將沙培長(zhǎng)至四葉期的對(duì)照及轉(zhuǎn)基因幼苗在150 mmol·L-1NaCl處理14 d后，對(duì)各株系地上部干重、地下部干重進(jìn)行測(cè)定及統(tǒng)計(jì)，并計(jì)算處理后對(duì)照組與處理組單株地上部干重的相對(duì)減少量（圖3-D）、地下部干重的相對(duì)減少量（圖3-E），顯示對(duì)照和各轉(zhuǎn)基因株系地上及地下部干重均減少，其中，地上部分干重相對(duì)減少量分別為55.45%（對(duì)照）、13.32%（OE-1）、41.08%（OE-2）和31.23%（OE-3）；而地下部分干重相對(duì)減少量分別為71.78%、13.29%、52.26%和49.27%（OE-3）；對(duì)照經(jīng)鹽處理后地上及地下部的干重減少最明顯，各轉(zhuǎn)基因株系經(jīng)鹽處理后地上及地下部的干重也均有不同程度的減少，但整體受影響程度均低于對(duì)照；統(tǒng)計(jì)150 mmol·L-1處理后各株系的死亡率（圖3-F）和死葉率（圖3-G），其中死亡率分別為39.56%（對(duì)照）、11.78%（OE-1）、25.49%（OE-2）和20.45%（OE-3）；死葉率分別為68.69%（對(duì)照）、42.86%（OE-1）、55.69%（OE-2）和47.53%（OE-3）；顯示中花11的死亡率和死葉率均比轉(zhuǎn)基因株系高，且轉(zhuǎn)基因株系中OE-1的死亡率和死葉率均低于其他轉(zhuǎn)基因株系，說(shuō)明轉(zhuǎn)基因株系中OE-1受鹽脅迫的影響最小。

2.4 活性氧含量和抗氧化酶活性分析

利用NBT和DAB染色法，對(duì)對(duì)照及150 mmol·L-1NaCl處理3 d后的OE-1株系中O2-和H2O2進(jìn)行染色，檢測(cè)各材料中過(guò)氧化物的積累情況。結(jié)果顯示，鹽脅迫下對(duì)照葉片經(jīng)NBT染色呈顯著的藍(lán)色，而在DAB染色下為深褐色，而OE-1株系葉片在不同染色下則表現(xiàn)為淡藍(lán)色或基本不著色，顯示對(duì)照中O2-和H2O2的積累量均高于OE-1株系（圖4-A）。而在正常生長(zhǎng)條件下，對(duì)照及轉(zhuǎn)基因材料中均檢測(cè)不到明顯的O2-和H2O2。

對(duì)鹽處理前后SOD和POD的活性測(cè)定（圖4-B和圖4-C），結(jié)果顯示，鹽處理后中花11的SOD活性下降，OE-1的SOD活性先上升后下降，且在鹽處理后6 h達(dá)到最高；鹽處理后POD的活性在中花11中先上升后下降，在OE-1中表現(xiàn)為鹽處理后6 h下降，之后上升，且處理24 h表現(xiàn)為顯著上升。

2.5 鹽處理下各響應(yīng)基因的表達(dá)模式

對(duì)鹽處理前后對(duì)照及過(guò)表達(dá)株系OE-1中部分已知鹽響應(yīng)基因如、、、、和的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)（圖5）。結(jié)果顯示，經(jīng)150 mmol·L-1NaCl處理后，、、、和在對(duì)照中花11和OE-1轉(zhuǎn)基因株系中表達(dá)均上調(diào)，其中，的表達(dá)上調(diào)明顯，在對(duì)照中該基因的表達(dá)上調(diào)約249倍，而在OE-1中該基因的表達(dá)在鹽處理24 h后上調(diào)約470倍，該基因表達(dá)上調(diào)程度明顯高于對(duì)照（圖5-B）；在鹽處理6 h后，在對(duì)照和OE-1中的表達(dá)量均有提高，之后隨鹽處理時(shí)間的延長(zhǎng)則表達(dá)量下降，在鹽處理24 h表達(dá)量降至最低，且在OE-1株系中該基因的相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照低（圖5-D）。

3 討論

土壤中含鹽量過(guò)多、造成土壤溶液滲透壓過(guò)高引起植物生長(zhǎng)發(fā)育不良的現(xiàn)象稱為鹽害。鹽害可產(chǎn)生離子脅迫，滲透脅迫及過(guò)氧化脅迫，通過(guò)破壞細(xì)胞中離子平衡，從而抑制酶的活性以及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)，干擾細(xì)胞中離子代謝，造成過(guò)氧化物積累，并降低植物葉綠素含量，進(jìn)而影響光合作用的正常進(jìn)行，最終導(dǎo)致植物生長(zhǎng)發(fā)育受抑制甚至死亡[20-21]。植物具有固著生長(zhǎng)的特性，在進(jìn)化過(guò)程中必須形成適應(yīng)高鹽等極端環(huán)境的應(yīng)對(duì)機(jī)制才可以生存。植物通過(guò)感知環(huán)境變化，從而對(duì)相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控來(lái)響應(yīng)鹽脅迫。植物的耐鹽性受多基因控制，屬于數(shù)量性狀遺傳[22]。目前，已從擬南芥、煙草、水稻、玉米等植物中分離和鑒定出大量耐鹽相關(guān)基因，包括部分轉(zhuǎn)錄因子及功能基因，主要在滲透調(diào)節(jié)、離子轉(zhuǎn)運(yùn)等方面發(fā)揮作用，部分基因功能及鹽脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑也得到了解析和驗(yàn)證[23]。其中類受體蛋白激酶作為植物中最大的一類基因家族，主要參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、抗病及抗逆反應(yīng)，對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育具有重要意義[6,24]。作物逆境生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)檢索脅迫下谷子的蛋白表達(dá)譜，鑒定到一個(gè)脅迫響應(yīng)基因，其編碼S-類受體蛋白激酶，將其命名為[17]。前期研究中，對(duì)其在干旱、鹽脅迫、GA、ABA、MeJA等處理下的表達(dá)模式進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，脅迫及激素處理均可不同程度地誘導(dǎo)的表達(dá)，顯示該基因可能參與谷子的抗逆過(guò)程[16]。

A：150 mmol·L-1 NaCl處理3 d后對(duì)對(duì)照及OE-1葉片的DAB和NBT染色，標(biāo)尺=1cm；B：150 mmol·L-1 NaCl處理后對(duì)照及OE-1的SOD活性；C：150 mmol·L-1 NaCl處理后對(duì)照及OE-1的POD活性；不同小寫(xiě)字母表示差異顯著（P<0.05）（n=3）

3.1 SiRLK35過(guò)表達(dá)株系的耐鹽性分析

本研究以谷子異源轉(zhuǎn)化水稻獲得的過(guò)表達(dá)株系可響應(yīng)鹽脅迫的研究結(jié)果為基礎(chǔ)，從生理、生化結(jié)合分子生物學(xué)機(jī)制等多角度對(duì)基因如何調(diào)控作物耐鹽性進(jìn)行解析。前期研究顯示，在鹽脅迫下對(duì)照和的OE水稻幼苗生長(zhǎng)均受到抑制并表現(xiàn)出一系列如黃化、發(fā)育遲緩等受害癥狀[25]，但過(guò)表達(dá)株系受抑制程度較小，顯示異源轉(zhuǎn)化水稻幼苗具有一定的耐鹽性。本研究結(jié)合鹽處理前后株高、根長(zhǎng)、干重變化、死亡率及死葉率等各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定，顯示鹽害下轉(zhuǎn)基因株系生長(zhǎng)受抑制程度均低于對(duì)照，其中，OE-1受抑制的程度最小。鑒于基因表達(dá)程度與其功能呈正相關(guān)，結(jié)合3個(gè)過(guò)表達(dá)株系中在OE-1中表達(dá)最高，顯示OE-1抗鹽性高于其他2個(gè)株系。鹽害下過(guò)量的過(guò)氧化物積累導(dǎo)致過(guò)氧化脅迫，從而對(duì)植物造成傷害。為應(yīng)對(duì)鹽脅迫，植物通過(guò)啟動(dòng)自身的抗氧化酶系統(tǒng)來(lái)清除ROS，從而達(dá)到緩解傷害的目的。NBT和DAB染色、及SOD和POD活性均顯示抗性較強(qiáng)的OE-1株系在鹽害下O2-和H2O2積累程度低于對(duì)照、且對(duì)活性氧的清除能力較高，及其高表達(dá)可使植物產(chǎn)生并提高抗鹽能力[26]。

圖5 鹽處理下各響應(yīng)基因在對(duì)照及OE-1中的相對(duì)表達(dá)量

3.2 SiRLK35參與水稻耐鹽性的響應(yīng)機(jī)制

基因功能的行使是通過(guò)對(duì)其上下游基因的表達(dá)進(jìn)行響應(yīng)或調(diào)控來(lái)完成的。本研究選取了部分鹽害響應(yīng)基因，如、、及進(jìn)行了表達(dá)模式的測(cè)定。其中是一個(gè)雙功能基因，編碼γ-谷氨酰激酶（γ-GK）和谷氨酸-5-半醛脫氫酶（GSA）2種酶，催化谷氨酸合成脯氨酸，過(guò)表達(dá)植株表現(xiàn)為較好的根生長(zhǎng)和較高的生物量[27-28]；在鹽和ABA誘導(dǎo)下表達(dá)上調(diào)，其過(guò)表達(dá)水稻株系耐干旱和耐鹽性顯著提高[29-30]；及作為轉(zhuǎn)錄因子，其表達(dá)受低溫、高鹽、干旱脅迫的誘導(dǎo)，超表達(dá)該基因能增強(qiáng)水稻對(duì)高鹽、干旱脅迫的耐受性[31]；超表達(dá)能提高轉(zhuǎn)基因水稻在鹽脅迫下的存活率[32]。本研究中，各基因在鹽脅迫下OE-1中均表現(xiàn)出不同程度的響應(yīng)。其中在鹽脅迫前期響應(yīng)不明顯，但在鹽處理24 h表現(xiàn)出較高的表達(dá)量。已知編碼的蛋白是一種晚期胚胎發(fā)育豐富蛋白，是典型的功能基因，作為一類低分子量蛋白，其在細(xì)胞中可作為滲透調(diào)節(jié)劑穩(wěn)定細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，結(jié)合離子和防止過(guò)氧化，該基因的表達(dá)受鹽、ABA、PEG及環(huán)境脅迫等因素誘導(dǎo)，且隨脅迫程度的提高而表達(dá)增強(qiáng)，在擬南芥、水稻中的高表達(dá)可提高植株對(duì)鹽脅迫的耐受性[33-35]。作為具有滲透調(diào)節(jié)功能的典型基因，其在鹽脅迫下過(guò)表達(dá)株系中的高表達(dá)在提高受體材料耐鹽性的同時(shí)，也顯示對(duì)的表達(dá)具有調(diào)控作用本研究中編碼高親和Na+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的的表達(dá)雖然在鹽處理6 h表現(xiàn)為上調(diào)，但之后隨鹽處理時(shí)間的延長(zhǎng)而表達(dá)降低，甚至恢復(fù)至鹽處理前水平[36]。已知表達(dá)受K+饑餓誘導(dǎo)，而Na+的過(guò)量積累可迅速下調(diào)其表達(dá)，故在K+缺乏的條件下，可特異的介導(dǎo)根吸收Na+作為營(yíng)養(yǎng)元素供植物生長(zhǎng)所需[37-38]。過(guò)表達(dá)株系和對(duì)照在鹽處理后表達(dá)模式的變化，推測(cè)其在鹽處理初期將Na+轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)Na+濃度在細(xì)胞中積累至毒害水平時(shí)其表達(dá)迅速下調(diào)來(lái)減少Na+向細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而維持細(xì)胞內(nèi)Na+/K+平衡，降低鹽脅迫造成的離子毒害，提高植物對(duì)鹽脅迫的耐受性。綜上，谷子可提高受體材料的耐鹽性，其主要通過(guò)影響過(guò)氧化物的清除機(jī)制、調(diào)控下游脅迫響應(yīng)基因如及等的表達(dá)及信號(hào)途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的。本研究為培育谷子抗鹽新品種提供了候選基因資源。

4 結(jié)論

谷子可參與鹽脅迫響應(yīng)過(guò)程，其過(guò)表達(dá)株系可通過(guò)調(diào)控鹽脅迫下抗氧化酶活性的變化，降低過(guò)氧化物的積累，及調(diào)控鹽害響應(yīng)基因如及等的表達(dá)及相關(guān)信號(hào)途徑，從而提高受體植株的耐鹽性。

[1] YANG Y Q, GUO Y. Unraveling salt stress signaling in plants., 2018, 60(9): 796-804.

[2] ROZEMA J, FLOWERS T. Crops for a salinized world., 2008, 322(5907): 1478-1480.

[3] 張建鋒, 張旭東, 周金星, 劉國(guó)華, 李冬雪. 世界鹽堿地資源及其改良利用的基本措施. 水土保持研究, 2006, 12(6): 28-30.

ZHANG J F, ZHANG X D, ZHOU J X, LIU G H, LI D X. World resources of saline soil and main amelioration measures., 2006, 12(6): 28-30. (in Chinese)

[4] LIU Z X, ZHANG H X, YANG X Y. Effects of soil salinity on growth, ion relations, and compatible solute accumulation of two sumac species:and., 2013, 44(21): 3187-3204．

[5] 賈冠清, 刁現(xiàn)民. 谷子(( L.) P. Beauv. )作為功能基因組研究模式植物的發(fā)展現(xiàn)狀及趨勢(shì). 生命科學(xué), 2017, 29(3): 292-301.

JIA G Q, DIAO X M. Current status and perspectives of researches on foxtail millet ((L.) P. Beauv.): A potential model of plant functional genomics studies., 2017, 29(3): 292-301. (in Chinese)

[6] YE Y Y, DING Y F, JIANG Q, WANG F J, SUN J W, ZHU C. The role of receptor-like protein kinases (RLKs) in abiotic stress response in plants., 2017, 36: 235-242.

[7] LIM C W, YANG S H, SHIN K H, LEE S C, KIM S H. The,, ortholog of wheat, is involved in ABA-mediated signaling and drought resistance., 2015, 34(3): 447-455.

[8] VAID N, PANDEY P, SRIVASTAVA V K, TUTEJA N. Pea lectin receptor-like kinase functions in salinity adaptation without yield penalty, by alleviating osmotic and ionic stresses and upregulating stress-responsive genes., 2015, 88(1/2): 1-14.

[9] LI C H, SUN Y. The receptor-like kinasemediates salt sensitivity by activating MAPK3/6 and regulating ethylene homeostasis in rice., 2014, 26(6): 2538-2553.

[10] ZHANG P Y, ZHANG Z H, WANG J, CONG B L, CHEN K S, LIU S H. A novel receptor-like kinase (PnRLK-1) from the Antarctic Moss Pohlia nutans enhances salt and oxidative stress tolerance., 2014, 33: 1156-1170.

[11] SERRA T S, FIGUEIREDO D D, CORDEIRO A M, ALMEIDA D M, LOURENC T, ABREU I A, SEBASTIAN A, FERNANDES L, CONTRERAS M B, OLIVEIRA M M, SAIBO N J M., a negative regulator of salt stress response in rice, is regulated by two AP2/ERF transcription factors., 2013, 82(4/5): 439-455.

[12] 馮露, 鐘理, 陳丹丹, 馬有志, 徐兆師, 李連城, 周永斌, 陳明, 張小紅. 過(guò)表達(dá)谷子液泡 H+-ATPase E亞基基因在擬南芥中的耐鹽性. 作物學(xué)報(bào), 2015, 41(11): 1682-1691.

FENG L, ZHONG L, CHEN D D, MA Y Z, XU Z S, LI L C, ZHOU Y B, CHEN M, ZHANG X H. Overexpression of vacuole H+-ATPase E subunit genefrom Foxtail Millet enhances salt resistance in transgenic., 2015, 41(11): 1682-1691. (in Chinese)

[13] 黃鎖, 胡利芹, 徐東北, 李微微, 徐兆師, 李連城, 周永斌, 刁現(xiàn)民, 賈冠清, 馬有志, 陳明. 谷子轉(zhuǎn)錄因子 SiNF-YA5 通過(guò)ABA非依賴途徑提高轉(zhuǎn)基因擬南芥耐鹽性. 作物學(xué)報(bào), 2016, 42(12): 1787-1797.

HUANG S, HU L Q, XU D B, LI W W, XU Z S, LI L C, ZHOU Y B, DIAO X M, JIA G Q, MA Y Z, CHEN M. Transcription factor SiNF-YA5 from Foxtail Millet () conferred tolerance to high-salt stress through ABA-independent pathway in transgenic, 2016, 42(12): 1787-1797. (in Chinese)

[14] 秦玉海, 張小紅, 馮露, 李微微, 徐兆師, 李連城, 周永斌, 馬有志, 刁現(xiàn)民, 賈冠清, 陳明, 閔東紅. 谷子轉(zhuǎn)錄因子基因在擬南芥中對(duì)高鹽和ABA的響應(yīng). 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2016, 49(17): 3276-3286.

QIN Y H, ZHANG X H, FENG L, LI W W, XU Z S, LI L C, ZHOU Y B, MA Y Z, DIAO X M, JIA G Q, CHEN M, MIN D H. Response of Millet transcription factor geneto high salt and ABA treatment in transgenic., 2016, 49(17): 3276-3286. (in Chinese)

[15] 李建銳. 谷子基因參與植物響應(yīng)干旱和鹽脅迫的功能研究[D]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué), 2018.

LI J R. Function analysis of the foxtail millet () gene,, in response to drought and salt stresses of plants[D]. Beijing: China Agricultural University, 2018. (in Chinese)

[16] 王一帆, 李臻, 潘教文, 李穎秀, 王慶國(guó), 管延安, 劉煒. 谷子基因克隆及功能分析. 遺傳, 2017, 39(5): 413-422.

WANG Y F, LI Z, PAN J W, LI Y X, WANG Q G, GUAN Y A, LIU W. Cloning and functional analysis of thegene inL..,2017, 39(5): 413-422. (in Chinese)

[17] 王一帆, 李臻, 潘教文, 王慶國(guó), 劉煒. 谷子類受體蛋白激酶基因的克隆及原核表達(dá). 山東農(nóng)業(yè)科學(xué), 2016, 48( 9) : 1-5.

WANG Y F, LI Z, PAN J W, WANG Q G, LIU W. Cloning of receptor-like protein kinase genefrom Foxtail Millet and its prokaryotic expression., 2016, 48(9): 1-5. (in Chinese)

[18] KUMAR D, YUSUF M A, SINGH P, SARDAR M, SARIN N B. Modulation of antioxidant machinery in alpha-tocopherol-enriched transgenicplants tolerant to abiotic stress conditions., 2013, 250(5): 1079-1089.

[19] YU J, CHEN S, ZHAO Q, WANG T, YANG C, DIAZ C, SUN G, DAI S. Physiological and proteomic analysis of salinity tolerance in., 2011, 10: 3852-3870.

[20] 巖學(xué)斌, 袁金海. 鹽脅迫對(duì)植物生長(zhǎng)的影響. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2019, 47(4): 30-33.

YAN X B, YUAN J H. Effects of salt stress on plant growth.,2019, 47(4): 30-33. (in Chinese)

[21] 李小波, 潘教文, 丁國(guó)華, 李臻, 王慶國(guó), 劉煒. 鹽脅迫下谷子根部細(xì)胞內(nèi)pH值測(cè)定.山東農(nóng)業(yè)科學(xué), 2019, 51(2): 40-44.

LI X B, PAN J W, DING G H, LI Z, WANG Q G, LIU W. Determination of pH value in root cells of Foxtail Millet under salt stress., 2019, 51(2): 40-44. (in Chinese)

[22] 封功能, 張雪梅, 仇明, 駱愛(ài)蘭. 水稻數(shù)量性狀研究進(jìn)展. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2004, 32(6): 1231-1234.

FENG G N, ZHANG X M, QIU M, LUO A L. Advance in rice quantitative trait loci., 2004, 32(6): 1231-1234. (in Chinese)

[23] 鄭崇珂, 竇玉慧, 解麗霞, 謝先芝. 水稻耐鹽相關(guān)基因的研究進(jìn)展. 分子植物育種, 2017, 15(11): 4411-4422.

ZHENG C K, DOU Y H, XIE L X, XIE X Z. Research progress on the genes related to salt tolerance in rice., 2017, 15(11): 4411-4422. (in Chinese)

[24] 朱巍巍, 馬天意, 張梅娟, 沙偉. 類受體蛋白激酶在植物中的研究進(jìn)展. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué), 2018, 37(1): 451-458.

ZHU W W, MA T Y, ZHANG M J, SHA W. Research progress of receptor-like protein kinases in plants., 2018, 37(1): 451-458. (in Chinese)

[25] KUIPER D, SCHUIT J, KUIPER P J C. Actual cytokinin concentration in plant tissue as an indicator for salt resistance in cereals., 1990, 123(2): 243-250.

[26] 李金亭, 趙萍萍, 邱宗波. 外源H2O2對(duì)鹽脅迫下小麥幼苗生理指標(biāo)的影響. 西北植物學(xué)報(bào), 2012, 32(9):1796-1801.

LI J T, ZHAO P P, QIU Z B. Effects of exogenous H2O2on physiological indexes of wheat seedlings under salt stress., 2012, 32(9): 1796-1801. (in Chinese)

[27] MANIMARAN P, VENKATA R S, MAZAHAR M, RAGHURAMI M, POLI Y, MOHANRAJ S S, BALACHANDRAN S M, KIRTI P B. Activation-tagging inrice identifies a novel transcription factor subunit, NF-YC13 associated with salt tolerance., 2017, 24(4): 1-16.

[28] ANOOP N, GUPTA K. Transgenicrice CV IR-50 over expressing vigna aconitifolia-pyrroline-5-carboxylatelate synthetase cDNA shows tolerance to high salt., 2003, 12(2): 109-116.

[29] FUKUDA A, NAKAMURA A, HARA N, TOKI S, TANAKA Y. Molecular and functional analyses of rice NHX-type Na+/H+antiporter genes., 2011, 233(1): 175-188.

[30] LIU S P, ZHENG L Q, XUE Y H, ZHANG Q, WANG L, SHOU H X. Overexpression of OsVP1 andincreases tolerance to drought and salinity in rice.,2010, 53(6): 444-452.

[31] NAKASHIMA K, TRAN L S, VAN N D, FUJITA M, MARUYANA K, TODAKA D, HAYASHI N, SHINOZAKI K, YAM S K. Functional analysis of a NAC type transcription factorinvolved in abiotic and biotic stress-responsive gene expression in rice., 2007, 51(4): 617-630.

[32] CUI M, ZHANG W J, ZHANG Q, XU Z Q, ZHU Z G, DUAN F P, WU R. Induced over-expression of the transcription factor OsDREB2Aimproves drought tolerance in rice., 2011, 49(12): 1384-1391.

[33] MOONS A, BAUW G, PRINSEN E, VAN M M, VAN D S D. Molecular and physiology responses to abscisic acid and salts in roots of salt-sensitive and salt-tolerantrice varieties., 1995, 107(1): 177-186.

[34] DUAN J L, CAI W M., an abiotic stress induced gene of rice plays a key role in salt and drought tolerance,, 2012, 7(9): e45117.

[35] HU T Z., a late embryogenesis abundant protein gene from rice, confers tolerance to water deficit and salt stress to transgenic rice.,2008, 55(4): 530-537.

[36] KADER M A, SEIDEL T, GOLLDACK D, LINDBERG S. Expressions of,, andare differentially regulated under NaCl stress in salt-sensitive and salt-tolerant riceL.) cultivars., 2006, 57(15): 4257-4268.

[37] NATSUKO I K, NAOKI Y, HIROKI Y, KAORU O, HIROKI U, ALEX C, KEITARO T, HIDEO M, MIHO F K, TOMOKI H.mediates Na+exclusion in the vasculature to protect leaf blades and reproductive tissues from salt toxicity in rice., 2017, 91: 657-670.

[38] WANG R, JING W, XIAO L, JIN Y, SHEN L, ZHANG W. Thetransporter is involved in salt tolerance and regulated by an MYB-Type transcription factor., 2015, 168(3): 1076-1090.

Response of receptor-like protein kinase geneof foxtail millet to salt in heterologous transgenic rice

LI XiaoBo1,2, LI Zhen2, DAI ShaoJun3, PAN JiaoWen2, WANG QingGuo2, Guan YanAn4,5, DING GuoHua1, LIU Wei2,5

(1School of Life Sciences and Technology, Harbin Normal University, Harbin 150025;2Biotechnology Research Center, Shandong Academy of Agricultural Sciences/Shandong Provincial Key Laboratory of Crop Genetic Improvement, Ecology and Physiology, Jinan 250100;3College of Life and Environmental Sciences, Shanghai Normal University/Development Center of Plant Germplasm Resources, Shanghai 200234;4Crop Research Institute, Shandong Academy of Agricultural Sciences/Shandong engineering laboratory for featured crops, Jinan 250100;5College of Life Sciences, Shandong Normal University, Jinan 250014)

Salt stress affects the crop yield and quality, while the crop salt tolerance is regulated by specific genes. Using heterogeneous over-expressed rice lines (OE-1, OE-2, and OE-3) of foxtail millet receptor-like protein kinase gene, the possible mechanisms ofunder salinity will be dissected on phenotypic, physiological and molecular levels.The expressions ofOE-1, OE-2, and OE-3 were analyzed by qRT-PCR. The phenotypes of three-leaf stage seedlings treated with 0, 150 and 200 mmol·L-1NaCl were observed, and the lengths of seedlings and roots were measured after treated with 150 mmol·L-1NaCl for 3 days. The dry weights, death rate and dead leaf rate of four-leaf stage seedlings that treated with 150 mmol·L-1NaCl for 14 days were also measured. OE-1with the highestexpression was further used for DAB and NBT dyeing analysis. The activities of partial antioxidases, and expression patterns of marker genes were detected.There was the highestexpression level in OE-1. The growth of control and OE seedlings were all inhibited under 150 mmol·L-1NaCl. The decreased levels of dry weight, the death rate and dead leaf rate of OE rice were all lower than those of the control, together with the less accumulation of O2-and H2O2, and the higher activities of antioxidases under salinity. Partial of salt responsive genes were up-regulated inOE lines, especially thewas induced about 1.9 times higher after treated with NaCl for 24 h.OE rice lines have tolerance under salinity, and the geneof foxtail millet could participate in salt response by regulation the activities of antioxidases and related signal pathways.

foxtail millet (L.);; salt tolerance; antioxidase; salt responsive genes

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.22.004

2019-07-02；

2019-09-19

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（CARS-06-13.5-A19）、山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程（CXGC2018E13）、山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年英才計(jì)劃（2016—2018）

李小波，E-mail：1670065759@qq.com。通信作者劉煒，E-mail：wheiliu@163.com。通信作者丁國(guó)華，E-mail：hsddgh@hrbnu.edu.cn

（責(zé)任編輯 李莉）