張艷 李瑩 張雪松

在我國，一些慢性病如糖尿病的發(fā)病率越來越高。而由糖尿病引起的并發(fā)癥對人類的危害也越來越嚴(yán)重。糖尿病病人高位截骨術(shù)后難愈合的問題一直困擾著病人。骨愈合是骨組織的自我修復(fù)過程，機(jī)制復(fù)雜，雖然骨再生能力強(qiáng)，但是臨床上骨折不愈合率仍很高［1］。骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic proteins, BMPs）屬于轉(zhuǎn)化生長因子-β超家族成員，主要參與骨折愈合過程的因子有BMP（s，e，g，2,7），其中BMP-2 是成骨作用最強(qiáng)的因子。BMP-2 不僅可以促進(jìn)成骨細(xì)胞及其前體細(xì)胞的增殖、促進(jìn)骨細(xì)胞鈣化，并且能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，進(jìn)而發(fā)揮成骨細(xì)胞的成骨作用，增加骨量，修復(fù)骨損傷，在骨愈合機(jī)制中起到重要作用。血管生成是傷口愈合、癌癥以及各種局部缺血和炎癥疾病的標(biāo)志。血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）是一種促使血管生長的因子，能與血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性地結(jié)合，促使新血管生成［2-4］。本研究主要探討了糖尿病病人骨組織中VEGF、BMP-2的表達(dá)水平，為后續(xù)臨床治療提供理論基礎(chǔ)。

資料與方法

一、病例選擇

選擇2017 年1 月至12 月于我院骨科進(jìn)行高位截骨術(shù)治療的病人，分為糖尿病組和非糖尿病組。糖尿病組選擇條件為：①年齡在40～70 歲；②2 型糖尿病病史2～20年；③無高血壓、高血脂、嚴(yán)重肝腎功能不全、惡性腫瘤。非糖尿病組選擇條件為：①年齡在40～70歲；②無糖尿病病史；③無高血壓、高血脂、嚴(yán)重肝腎功能不全、惡性腫瘤。

經(jīng)過以上標(biāo)準(zhǔn)共篩選出8 例糖尿病病人，平均年齡為51.78 歲，其中病史2～5 年共計2 例，6～20 年共計6例；非糖尿病病人8例，平均年齡為55.43歲。本研究經(jīng)唐山市第二醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（2017-0134），獲取骨組織經(jīng)過病人本人及家屬知情并簽署同意書，在不影響手術(shù)效果的前提下獲取部分骨組織開展研究，對病人無任何傷害。兩組病人間性別、年齡、身體質(zhì)量指數(shù)（body mass index,BMI）、空腹血糖（fasting plasma glucose,FPG）的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，表1）。

二、試劑和儀器

一抗VEGF、BMP-2、β-actin（Proteintech公司，美國），辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG和辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，中國），蛋白提取及定量試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，中國），Trizol、氯仿（重慶化學(xué)試廠，中國），ECL 發(fā)光液（北京普利萊基因技術(shù)有限公司，中國）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、轉(zhuǎn)染試劑盒（TRANS公司，美國），收集的組織均保存于-75 ℃冰箱（海爾公司，中國）。Western blot 分析儀C400 曝光儀（AZURE公司，美國），Western blot電泳、轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)（Bio-Rod公司，美國），冷凍高速離心機(jī)（HERMLE公司，德國）。

三、方法

（一）骨組織總蛋白提取

將獲取的骨組織用PBS 沖洗干凈，再用錫紙包裹骨組織，先將骨組織置于-75 ℃冰箱中放置12 h，再放入液氮中保存，待收集的骨組織達(dá)到一定數(shù)量后開始提取蛋白。采用單純研磨法將骨組織磨成粉末狀，將粉末狀骨組織收集到1.5 ml的EP管中，隨后向EP管中加入蛋白裂解液，4 ℃放置30 min，其中每隔10 min 震蕩30 s，移至新的EP 管中，12 000 r/min 4 ℃離心15 min，將上清液吸到新的EP 管中放置4 ℃暫存。用BCA法測定蛋白濃度并進(jìn)行定量分裝保存至液氮中待用。

（二）Western blot檢測VEGF、BMP-2蛋白表達(dá)

配置12%的分離膠和5%濃縮膠，加入100 μg蛋白，80 mV 電泳一段時間后，120 mV 電泳至結(jié)束。300 mA轉(zhuǎn)模30～60 min，用5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h，封閉結(jié)束后放入一抗孵育盒，室溫孵育3～4 h，用PBST洗膜液洗膜3次，每次10 min，放入二抗孵育盒室溫孵育1 h，用PBST洗膜液洗膜3次，每次10 min，吸干膜上液體加入ECL發(fā)光液，放入曝光儀檢測結(jié)果保存數(shù)據(jù)。

（三）RT-PCR 檢測骨組織中VEGF、BMP-2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)

將獲取的骨組織研磨至粉末狀后加入Trizol，隨后加入氯仿，混勻后室溫放5 min。12 000 r/min 4 ℃離心15 min，轉(zhuǎn)移上層水相并加入異丙醇，混勻靜置后12 000 r/min 4 ℃離心10 min，用無水乙醇洗3次，干燥后加入焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate,DEPC）水，測其濃度后儲存。引物序列：BMP-2上下游引物序列分別為5′-CTTCTAGCGTTGCTGCT-3′和5′-AGTGCCTGCGATACAGGTCT-3′；VEGF 上游引物：5′-GGCAGCTTGTAAACGAAC-3′；下游引物：5′-TGGTGACATGGTTAATCGGTC-3′，均由美國Invitrogene 公司合成提供。通過RT-PCR 檢測其mRNA 表達(dá)水平，進(jìn)行相對定量，實(shí)驗結(jié)果重復(fù)3次以上。

四、統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)使用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件（IBM公司，美國）分析，計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。數(shù)據(jù)滿足正態(tài)分布且方差齊性，兩組間計量資料比較用獨(dú)立樣本t檢驗，不滿足則作非參數(shù)秩和檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、Western blot檢測BMP-2、VEGF蛋白的表達(dá)

如圖1、2 所示，與非糖尿病組比較，糖尿病組BMP-2 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），VEGF 蛋白表達(dá)量也明顯減少（P＜0.05）。實(shí)驗結(jié)果提示，糖尿病病人脛骨骨組織中BMP-2、VEGF 蛋白表達(dá)水平較非糖尿病病人明顯降低。

表1 兩組病人基線資料比較

圖1 Western blot檢測骨組織中蛋白表達(dá)水平（D1～D8為糖尿病組，N1～N8為非糖尿病組）

二、RT-PCR檢測骨組織中VEGF、BMP-2 mRNA的表達(dá)水平

以糖尿病高位截骨術(shù)病人和非糖尿病高位截骨術(shù)病人的cDNA為模板，通過RT-PCR檢測骨組織中VEGF、BMP-2 mRNA 表達(dá)水平，結(jié)果如圖3、4 所示，與非糖尿病組比較，糖尿病組BMP-2 mRNA 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），VEGF mRNA 表達(dá)量明顯減少（P＜0.05）。結(jié)果提示，糖尿病病人脛骨骨組織中BMP-2、VEGF mRNA 表達(dá)水平較非糖尿病病人明顯降低，結(jié)果與蛋白檢測一致。

三、X線檢查

通過Western blot、RT-PCR 實(shí)驗結(jié)果，我們篩選出結(jié)果較為明顯的4 例病人，調(diào)出X 線片，如圖5 所示，糖尿病組骨質(zhì)疏松程度明顯高于非糖尿病組。

討 論

糖尿病是一類由遺傳、環(huán)境、社會壓力、肥胖、胰島素不足、腸道菌群異常等多種因素相互作用引起的一種慢性疾?。?，6］。近年來研究表明，糖尿病不僅能夠引起人體內(nèi)各臟器的異常、骨代謝異常、增加創(chuàng)傷引發(fā)感染的風(fēng)險，而且還普遍存在骨愈合困難、創(chuàng)面愈合困難等問題。以往的治療方法集中在控制血糖水平、加強(qiáng)創(chuàng)面外科處理及抗感染等方面，不能徹底解決骨愈合困難、創(chuàng)面愈合困難的問題［7-9］。隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，一些生長因子對骨折后愈合、創(chuàng)面愈合的影響受到了國內(nèi)外眾多學(xué)者的關(guān)注。因此，從生長因子的角度研究骨愈合困難、創(chuàng)面愈合困難的作用機(jī)制，為如何防治、解決骨愈合困難及創(chuàng)面愈合困難奠定基礎(chǔ)，也為如何防治、解決骨愈合困難及創(chuàng)面愈合困難提供了新的思路，與此同時也為后續(xù)臨床治療提供理論基礎(chǔ)。

圖2 Western blot檢測骨組織中BMP-2、VEGF蛋白表達(dá)水平

圖3 RT-PCR檢測骨組織中BMP-2和VEGF mRNA表達(dá)（D1～D8為糖尿病組，N1～N8為非糖尿病組）

圖4 RT-PCR檢測骨組織中BMP-2和VEGF mRNA的表達(dá)水平

圖5 兩組病人手術(shù)前后X線片資料，糖尿病組脛骨平臺骨小梁較非糖尿病組稀疏 a、b：糖尿病病人（女）；c、d：糖尿病病人（男）；e、f：非糖尿病病人（女）；g、h：非糖尿病病人（男）

目前研究較多的生長因子主要有VEGF、成纖維細(xì)胞生長因子-β（fibroblast growth factor-β,FGF-β）、轉(zhuǎn)化生長因子、BMP-2 等。VEGF 是促血管生長因子，也是內(nèi)皮細(xì)胞的高度特異性促分裂原。研究表明，VEGF與多種血管形成性疾病有關(guān)，在增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病性黃斑水腫、微血管病變、糖尿病腎病、血管合并癥中均起到重要作用［10-13］。Neufeld等［14］研究發(fā)現(xiàn)VEGF的7個家族成員（VEGFA，VEGF-B，VEGF-C，VEGF-D，VEGF-E，VEGF-F 和PLGF）中所共有的結(jié)構(gòu)是VEGF 同源性結(jié)構(gòu)域，這些VEGF與其相應(yīng)的受體結(jié)合后發(fā)揮增加血管通透性，刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和體內(nèi)血管生成等生物學(xué)功能。VEGF通過結(jié)合其受體后能夠激活多種信號通路，如促分裂原活化蛋白激酶、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B，Rac 信號通路等參與成骨分化及骨修復(fù)［15］。骨折后血管再生對骨折的愈合起到重要作用，創(chuàng)傷后血管生成可有多種生長因子誘導(dǎo)，但只有VEGF 特異作用于內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)其增殖和血管生成，并可增加血管通透性。微血管在骨折的愈合過程中不僅提供了必要的營養(yǎng)和生物學(xué)環(huán)境，而且直接參與成骨作用［16］。BMP蛋白是多功能蛋白，在機(jī)體生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用，研究報道BMPs通過結(jié)合BMP 受體Ⅰ和Ⅱ從而激活下游Smad1/5/8，激活狀態(tài)的Smad1/5/8 通過與Smad4 結(jié)合形成共聚體，繼而與下游轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合從而啟動信號傳導(dǎo)，從而調(diào)控細(xì)胞的增殖和分化［17］。BMP-2是成骨作用最強(qiáng)的因子，BMP-2 能夠誘導(dǎo)未分化的間充質(zhì)細(xì)胞不可逆地分化為成軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞，促進(jìn)新骨形成。BMP-2不僅可以促進(jìn)成骨細(xì)胞及其前體細(xì)胞的增殖、促進(jìn)骨細(xì)胞鈣化，并且能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，進(jìn)而發(fā)揮成骨細(xì)胞強(qiáng)大的成骨作用，增加骨量，修復(fù)骨微損傷，在骨愈合機(jī)制中起到重要作用［18，19］。但是對于VEGF、BMP與骨愈合、創(chuàng)面愈合之間的關(guān)系及分子機(jī)制目前還有待進(jìn)一步研究［20，21］。

本研究通過獲取糖尿病和非糖尿病高位截骨術(shù)病人的骨組織，提取蛋白和RNA 通過Western blot以 及RT-PCR 分 別 測 定BMP-2、VEGF 的 蛋 白 和mRNA 的表達(dá)水平，研究結(jié)果（圖1～4）顯示糖尿病組與非糖尿病組相比，BMP-2、VEGF 在蛋白和mRNA 水平的表達(dá)量均明顯降低，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，說明BMP-2、VEGF 因子影響骨愈合。同時，我們選取年齡相近（均低于55歲）的糖尿病病人以及非糖尿病病人，查閱病歷獲取其X線片，結(jié)果顯示糖尿病病人骨質(zhì)疏松較為明顯，非糖尿病病人無明顯的骨質(zhì)疏松癥狀。我們分析認(rèn)為糖尿病引起的高血糖狀態(tài)能激活堿性磷酸酶，導(dǎo)致氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的發(fā)生，從而使炎癥因子如白細(xì)胞介素-6及腫瘤壞死生長因子-α表達(dá)增加，使血管內(nèi)皮細(xì)胞功能發(fā)生紊亂，VEGF、BMP 表達(dá)降低，最終影響微血管的形成，不能為局部組織提供必需物質(zhì)，影響骨折愈合［22-24］。糖尿病病人長期低表達(dá)BMP-2、VEGF，影響骨質(zhì)，導(dǎo)致病人出現(xiàn)骨質(zhì)疏松，易出現(xiàn)骨折。與此同時本研究也存在不足之處，不能連續(xù)性檢測在骨愈合過程中BMP-2、VEGF 在不同時期變化水平，待后續(xù)繼續(xù)深入研究。

綜上所述，糖尿病病人骨組織內(nèi)BMP-2、VEGF因子含量較正常人群表達(dá)量明顯減少。我們推斷糖尿病病人脛骨高位截骨術(shù)術(shù)后骨愈合及創(chuàng)面愈合緩慢一定程度上受BMP-2、VEGF 因子表達(dá)量的影響，具體機(jī)制有待后續(xù)深入研究。