邱正明 嚴(yán)承歡* 黃 燕 劉志雄 朱鳳娟 吳金平 郭鳳領(lǐng)

（1 湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，湖北武漢 430064；2 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院，湖北武漢 430070；3 蔬菜種質(zhì)創(chuàng)新與遺傳改良湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430064）

萵苣（Lactuca sativa，2n=18）屬于菊科萵苣屬，在世界范圍內(nèi)廣泛種植（Coria-Cayupan &Pinto，2009）。全球的萵苣栽培面積已達(dá)122 萬hm2，總產(chǎn)量約2 678 萬t，其中超過50%的栽培面積和產(chǎn)量均來自中國(guó)（http：//www.fao.org/faostat/en/）。萵苣經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高，僅2015 年美國(guó)的葉用萵苣（生菜）產(chǎn)值已達(dá)30 億美元，且該數(shù)值逐年增加（Wells et al.，2016）。根據(jù)表型差異，可以將萵苣分為6 種栽培類型：結(jié)球生菜、奶油生菜、散葉生菜、羅馬生菜、萵筍以及油用萵苣（Zhang et al.，2017）；根據(jù)是否含有花青素，可以將萵苣分為紫色萵苣和綠色萵苣。除結(jié)球生菜以外，其他5 種萵苣栽培類型均含有紫色品種。紫色萵苣因其顏色艷麗，富含花青素，具有一定的抗氧化、降低血壓、預(yù)防癌癥等功效，逐漸受到人們的青睞，如紫冠、紫羅馬、紫翠等紫色萵苣品種。萵苣中花青素主要類型為矢車菊素，不同萵苣品種花青素含量差異顯著（Kim et al.，2016）。本文擬通過闡述近年來萵苣花青素生物合成與調(diào)控領(lǐng)域的重要研究進(jìn)展，闡明萵苣花青素的生物合成與調(diào)控途徑，以及影響萵苣花青素形成的主要環(huán)境因素，為開發(fā)富含花青素的萵苣功能性食品提供參考依據(jù)。

1 植物花青素的化學(xué)結(jié)構(gòu)及種類

花青素（anthocyanins）是植物中最大的一類水溶性類黃酮化合物，廣泛分布于植物界中（Tohge et al.，2013）?；ㄇ嗨氐幕竟羌転镃6-C3-C6 結(jié)構(gòu)，根據(jù)B 環(huán)上取代基的不同而產(chǎn)生不同類型的花青素（呂玲玲 等，2018）。自然界中常見的花青素類型主要有6 種（Zhang et al.，2014），包括矢車菊素（cyanidin）、飛燕草素（delphinidin）、天竺葵素（pelargonidin）、矮牽牛素（petunidin）、芍藥素（peonidin）以及錦葵花素（malvidin）（圖1）。以上花青素類型中的羥基可以與不同的糖類結(jié)合進(jìn)而產(chǎn)生不同類型的花色苷，萵苣中的花色苷主要是矢車菊素糖苷化后與有機(jī)酸結(jié)合的產(chǎn)物（Mulabagal et al.，2010）。自然界中已發(fā)現(xiàn)的花色苷種類超過600 種，不同類型的花色苷產(chǎn)生的顏色略有差異，矢車菊素及其衍生物主要呈紫色，天竺葵素及其衍生物呈紅色，飛燕草素及其衍生物呈藍(lán)色或者紫色（Grotewold，2006）。此外，植物液泡的pH 值也會(huì)影響花青素的顏色，當(dāng)pH 值為1.0～2.0 時(shí)，花青素呈紅色；當(dāng)pH 值為6.0～6.5 時(shí)，花青素呈藍(lán)色；當(dāng)pH＞7.0 時(shí)，花青素呈淺黃色（Zhang et al.，2014）。在萵苣中，花青素主要呈紫色，因其含量以及葉片背景顏色的差異而形成不同的紫色萵苣品種。不同紫色萵苣品種的葉片花青素含量差異較大，在3.665～1 496.934 nmol·g-1（FW）之間均有分布，一般情況下花青素含量與其組織顏色深淺呈正相關(guān)（郝敬虹 等，2014）。

圖1 自然界中常見的6 種花青素結(jié)構(gòu)

2 萵苣花青素的生物合成

花青素生物合成途徑屬于類黃酮合成途徑的一個(gè)分支，該生物合成途徑非常保守，是植物中研究最深入的次生代謝途徑之一（Tanaka &Ohmiya，2008）。萵苣花青素的生物合成途徑與模式植物擬南芥類似（蘇文清，2018），主要分為3 個(gè)階段（圖2）。第一階段為類黃酮合成的共用途徑，以苯丙氨酸（phenylalanine）為底物，分別在苯丙氨酸裂解酶（PAL）、肉桂酸-4-羥化酶（C4H）、4-香豆酰CoA 連接酶（4CL）的作用下產(chǎn)生4-香豆酰CoA（4-coumaroyl CoA）。第二階段為類黃酮生物合成的關(guān)鍵階段，所涉及基因?yàn)樵缙谏锖铣赏緩交颍╡arly biosynthetic genes，EBGs）。在查耳酮合成酶（CHS）作用下，1 份4-香豆酰CoA 和3 份丙二酰CoA（malonyl-CoA）產(chǎn)生柚配基查爾酮（naringenin chalcone），在查耳酮異構(gòu)酶（CHI）作用下轉(zhuǎn)化為柚皮素（naringenin），進(jìn)一步在黃烷酮3-羥化酶（F3H）的催化下產(chǎn)生二氫山柰酚（dihydrokaempferol），而類黃酮3′-羥化酶（F3′H）和類黃酮3′，5′-羥化酶（F3′5′H）又分別催化二氫山柰酚產(chǎn)生二氫槲皮素（dihydroquercetin）和二氫楊梅素（dihydromyricetin）。第三階段為花青素合成與修飾階段，所涉及基因?yàn)橥砥谏锖铣赏緩交颍╨ate biosynthetic genes，LBGs）。在二氫黃酮醇4-還原酶（DFR）作用下，二氫黃酮醇產(chǎn)生對(duì)應(yīng)的無色花青素，之后在無色花青素雙加氧酶/花青素合成酶（LDOX/ANS）作用下分別轉(zhuǎn)化為矢車菊素、天竺葵素和飛燕草素等3 種顯色花青素。這些花青素的化學(xué)性質(zhì)并不穩(wěn)定，需要通過類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶（UFGT）、甲基轉(zhuǎn)移酶、?；D(zhuǎn)移酶等修飾后形成化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的花色苷產(chǎn)物。此外，在谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（GST）等基因的幫助下，修飾過的花色苷被運(yùn)輸?shù)揭号荽鎯?chǔ)（Cheng et al.，2015），在pH值、金屬離子等因素的共同作用下植物顯現(xiàn)出各種顏色。

圖2 萵苣花青素生物合成及調(diào)控途徑

紫色萵苣材料中，多個(gè)EBGs 和LBGs 上調(diào)表達(dá)，包括CHS、CHI、F3H、F3′H、DFR和ANS等基因（Zhang et al.，2016）。除上述基因外，在紫色散葉生菜材料中花青素酰基轉(zhuǎn)移酶AT基因顯著上調(diào)表達(dá)（岳貞，2014）?；ㄇ嗨乇磉_(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究結(jié)果顯示，兩個(gè)花青素合成途徑基因GST和ANS與萵苣花青素積累緊密相關(guān)（Zhang et al.，2017），其中LsANS負(fù)責(zé)無色花青素轉(zhuǎn)化為顯色花青素，LsGST控制花色苷向液泡的轉(zhuǎn)運(yùn)過程。在草莓中鑒定到1 個(gè)FaGST基因功能缺失的突變體，其葉柄和果實(shí)均不能變?yōu)榧t色（Luo et al.，2018）。類似的，在萵苣中LsANS和LsGST的功能缺失則不能形成紫色萵苣（Su et al.，2019）。花青素組分分析顯示，萵苣Cherokee 中花青素主要為矢車菊素-3-O-6′-丙二酰-β-吡喃葡萄糖苷，并且其可以快速轉(zhuǎn)化為矢車菊素-3-O-6′-丙二酰-β-吡喃葡萄糖苷甲酯和矢車菊素-3-O-β-吡喃葡萄糖苷（Mulabagal et al.，2010），該結(jié)果與Su 等（2019）的研究結(jié)果一致。以上研究結(jié)果表明，在萵苣中F3′5′H 花青素合成分支受到抑制，而F3′H 活性較強(qiáng)，因此萵苣花青素生物合成以矢車菊素分支為主要合成途徑。

3 萵苣花青素的轉(zhuǎn)錄調(diào)控

花青素的生物合成主要受MBW 三元復(fù)合體調(diào) 控，包 括MYB、bHLH 以 及WD40 等3 類 轉(zhuǎn)錄因子（Ramsay &Glover，2005），其中MYB 和bHLH 轉(zhuǎn)錄因子與DNA 結(jié)合激活目的基因表達(dá)，而WD40 主要作為載體穩(wěn)定復(fù)合體結(jié)構(gòu)（圖2）。根據(jù)MYB 轉(zhuǎn)錄因子上R 基序的不同可以將其分為多種類型，其中參與花青素激活的MYB 轉(zhuǎn)錄因子主要為R2R3-MYB，如PAP1、PAP2 和MYB12 等（Stracke et al.，2001），而抑制花青素生物合成的MYB 轉(zhuǎn)錄因子為R3-MYB 和部分R2R3-MYB，如CPC（Zhu et al.，2009）、MYB27（Albert et al.，2014）等。在擬南芥中，GL3 和EGL3 兩個(gè)bHLH轉(zhuǎn)錄因子均涉及花青素的調(diào)控，且存在功能冗余（Zhang et al.，2003）。此外，WD40 作為MBW 三元復(fù)合體的載體，也是花青素合成的重要調(diào)控因子，如TTG1（Walker et al.，1999）等。

轉(zhuǎn)錄組分析顯示，在萵苣中MBW 三元復(fù)合體轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)花青素積累，如MYB12、MYB75、MYB90、EGL1、TTG1 等（Zhang et al.，2016）。與通常的R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子激活花青素生物合成不同，1 個(gè)R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子AtMYB60 可以抑制萵苣花青素的積累（Park et al.，2008）。Zhang等（2017）利用RNA-seq 測(cè)序技術(shù)，對(duì)全世界范圍內(nèi)的240 份萵苣栽培種及野生材料進(jìn)行測(cè)序，采用GWAS（genome-wide association study）分析發(fā)現(xiàn)多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控萵苣花青素的積累，包括MYB113（LG5_426271）、bHLH42（LG5_467062）等。Su 等（2019）研究表明，萵苣花青素生物合成受多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子（≥4 個(gè)）控制（圖3），包括RLL1（bHLH）、RLL2（R2R3-MYB）、RLL3（R3-MYB）和RLL4（WD40）。這些轉(zhuǎn)錄因子中，bHLH 和R2R3-MYB 為正調(diào)控因子，而R3-MYB和WD40 為負(fù)調(diào)控因子。當(dāng)R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子處于激活狀態(tài)，則促進(jìn)花青素積累，產(chǎn)生紫葉萵苣；而bHLH 功能缺失時(shí)，導(dǎo)致花青素生物合成途徑被阻斷，產(chǎn)生綠葉萵苣。此外，當(dāng)R3-MYB 和WD40 發(fā)生變異時(shí)，其對(duì)花青素生物合成途徑的抑制作用解除，進(jìn)而產(chǎn)生淺紫/紫葉萵苣（圖3）。值得注意的是，該研究中RLL4（WD40）雖然為AtRUP1/AtRUP2 的同源體，但其并不通過MBW三元復(fù)合體途徑對(duì)花青素的積累產(chǎn)生影響，因此在萵苣中RLL4 可能存在一個(gè)與擬南芥不同的調(diào)控花青素生物合成的機(jī)制。

4 萵苣花青素合成的影響因素

除遺傳因素外，多種環(huán)境因子均影響花青素的生物合成，如光照、溫度、土壤pH、肥力等（Winkel-Shirley，2001；Gould，2004）。對(duì)萵苣而言，光照和溫度是影響其花青素生物合成最重要的環(huán)境因子。

4.1 光照

光照是影響萵苣花青素生物合成最重要的環(huán)境因子，有無光照直接影響花青素的合成與否。Zhang 等（2018）研究表明，光密度增加可以顯著增加萵苣花青素的積累。除光強(qiáng)對(duì)花青素的有無起決定作用外，光質(zhì)也是萵苣花青素生物合成的重要影響因素。萵苣花青素積累依賴UV-B（280～315 nm）途徑，通過照射UV-B 可使花青素生物合成基因CHS、F3H、DFR等上調(diào)表達(dá)，進(jìn)而產(chǎn)生紫色萵苣（Park et al.，2007）。此外，藍(lán)光（440 nm）也可以極大地促進(jìn)花青素的生物合成，進(jìn)而形成紫色萵苣（Stutte et al.，2009）。研究表明，光照對(duì)花青素生物合成的影響主要存在兩種方式：一是通過泛素化降解途徑，COP1 蛋白與MYB基因互作，調(diào)控MYB基因?qū)庹盏母兄欢侵苯幼饔糜谵D(zhuǎn)錄因子，如HY5、MYB等基因啟動(dòng)子上的光響應(yīng)元件，進(jìn)而調(diào)控花青素的生物合成（黃鼎，2018）。

圖3 萵苣花青素調(diào)控示意圖及其對(duì)應(yīng)表型

4.2 溫度

一般認(rèn)為，溫度是影響萵苣花青素生物合成的另一個(gè)重要環(huán)境因子。一定范圍內(nèi)的低溫可以促進(jìn)萵苣花青素的生物合成，溫度過低或者過高均不利于花青素的積累，并且夜間低溫可以減緩高溫對(duì)萵苣花青素積累的影響（Gazula et al.，2005）。在較低溫度〔20 ℃/13 ℃（晝/夜），下同〕條件下，萵苣花青素積累量較高，但隨著溫度升高（30 ℃/25℃）花青素含量顯著降低（Boo et al.，2011）。低溫是如何誘導(dǎo)萵苣花青素積累的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

4.3 其他

除光照和溫度外，水分、CO2濃度等因素均影響萵苣花青素的生物合成。水分缺乏有利于促進(jìn)萵苣花青素的積累，增強(qiáng)萵苣的抗氧化能力（Baslam &Goicoechea，2012）。高濃度的CO2（1 000 μmol·mol-1）可顯著增加萵苣花青素的生物合成，促進(jìn)花青素的積累（Park et al.，2013）。此外，有報(bào)道顯示外源噴施一定濃度的硒（0～8 μmol·L-1），可顯著增加萵苣花青素的積累（Liu et al.，2017），其作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

5 展望

隨著2017 年萵苣全基因組數(shù)據(jù)的公布，表明萵苣的研究已進(jìn)入功能基因組學(xué)時(shí)代（Reyes-Chin-Wo et al.，2017）。高質(zhì)量的基因組圖譜為深入解析萵苣花青素積累的分子機(jī)制奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。目前，雖然萵苣花青素的遺傳學(xué)及功能研究取得了長(zhǎng)足進(jìn)步，但還有多個(gè)問題值得深入研究：①鑒定新的調(diào)控萵苣花青素積累的轉(zhuǎn)錄因子；②萵苣花青素依賴UV-B 途徑積累的分子機(jī)制；③光質(zhì)影響萵苣花青素積累的分子機(jī)制；④萵苣花青素的修飾、轉(zhuǎn)運(yùn)和降解機(jī)制等。萵苣花青素積累的遺傳與分子機(jī)制的解析，有助于深入了解萵苣中花青素的代謝過程，有利于未來通過聚合育種、人工定向誘變和基因編輯等技術(shù)培育富含花青素的紫色萵苣新材料。將紫色萵苣開發(fā)為富含花青素的功能性食品，結(jié)合植物工廠生產(chǎn)模式（賀冬仙，2018），可為萵苣未來的產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供新路徑。