朱榮譽 向 俊 姚娜娜 吳幫林 葉 剛

(湖北省恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院麻醉科,恩施市 445000，電子郵箱：Liuzitong771702@163.com)

研究表明，異體輸血對受者的免疫功能具有抑制作用，可引起感染、原發(fā)疾病復發(fā)以及器官移植耐受性降低等，從而導致患者死亡率增高[1]。來源于骨髓干細胞的巨噬細胞作為非特異性免疫細胞，是機體抵御有害刺激的一道重要防線，其主要功能是以固定細胞或游離細胞的形式對細胞殘片及病原體發(fā)揮噬菌作用(即吞噬以及消化)，并激活淋巴細胞或其他免疫細胞使其對病原體做出反應[2-4]。而炎癥是機體對刺激的一種防御反應，巨噬細胞作為炎癥階段的主要吞噬細胞，在多種急慢性炎癥性疾病中發(fā)揮多種免疫作用，負責清除機體損傷處組織和細胞的壞死碎片以及病原體等，這些物質(zhì)對創(chuàng)傷愈合過程有重要的調(diào)控作用[3-5]。M1型巨噬細胞通過釋放抵抗素，促進肝臟、骨骼肌和脂肪組織慢性炎癥的形成。M2型巨噬細胞與M1型巨噬細胞存在拮抗作用，在生理情況下，脂肪細胞和肝細胞能夠通過生成白細胞介素(interleukin,IL)-4和IL-13誘導巨噬細胞向M2型巨噬細胞分化；但在病理情況下，M1型和M2型巨噬細胞失衡可引發(fā)組織炎癥和代謝功能障礙，從而促進胰島素抵抗。脂肪組織內(nèi)的M2型巨噬細胞與鐵代謝有關，而脂肪細胞鐵過載會加重全身性胰島素抵抗[6-8]。巨噬細胞作為傷口愈合的重要防線，在糖尿病患者的傷口愈合中發(fā)揮重要作用。然而，目前尚不清楚在異體輸血所致巨噬細胞分化失調(diào)的情況下，糖尿病患者傷口的愈合情況。因此，本研究建立糖尿病大鼠創(chuàng)面模型，模擬異體輸血引起的巨噬細胞分化失調(diào)，觀察其對糖尿病大鼠創(chuàng)面的愈合情況的影響，并初步探討可能的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 無感染C57BL/6野生型雄性小鼠購自北京大學動物試驗中心[動物許可證號：SCXK(京)2016-0001]，6～8周齡，體重(20.0±2.1)g;雄性SD大鼠購自北京大學動物試驗中心[動物許可證號：SCXK(京)2016-0001]，8～12周齡，體重(30.3±5.6)g。喂養(yǎng)要求：室溫，相對濕度控制于50%左右，12 h光照與12 h黑夜交替，每天正常自由飲水進食，所有大小鼠正常活動。本研究已獲得我院倫理委員會批準。

1.2 試劑與儀器 鏈脲佐菌素(美國Sigma公司，批號：XT10265)，巨噬細胞集落刺激因子(美國Sigma公司，批號：AB44527)，脂多糖(美國Sigma公司，批號：L2880)，干擾素(interferon-γ,IFN-γ；美國Sigma公司，批號：170524)，IL-4抗體(美國Sigma公司，批號：170601)，IL-3抗體(美國Sigma公司，批號：170603)，生物素化山羊抗小鼠IgG(美國Santa Cruz公司，批號：SC81692)，完全培養(yǎng)基(美國Gibco公司，批號：12633-012)，Trizol試劑(日本Takara公司，批號：CD-10252)，PrimeScriptTMRT試劑盒(日本Takara公司，批號：DRR041A)，實時SYBR Green qPCR Master Mix(日本Takara公司，批號：AK3902B)，兔抗IL-12β抗體(美國Santa Cruz公司，批號：2017-AASTA152)，兔抗誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)抗體(美國Santa Cruz公司，批號：2018-01236950)，兔抗腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)抗體(美國Santa Cruz公司，批號：2018-AABGH5690)，β-肌動蛋白(美國Santa Cruz公司，批號：2017-AAAST863)，辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)結(jié)合二級抗體(美國Santa Cruz公司，批號：2018FGO56742)。Hyperfilm X光片(美國GE公司)，7500型實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)，Cx31型顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.3 糖尿病大鼠模型及大鼠創(chuàng)面模型的建立 (1)糖尿病大鼠模型：SD大鼠經(jīng)飼養(yǎng)1周后，檢測尾靜脈隨機血糖，去除血糖異常(空腹血糖>7.5 mmol/L)的大鼠。選取60只大鼠稱重后，一次性腹腔注射經(jīng)pH為4.2～4.5檸檬酸緩沖液稀釋的鏈脲佐菌素(5 mg/mL)，注射劑量為50 mg/kg。72 h后經(jīng)尾靜脈采血檢測血糖，血糖值>16.7 mmol/L的大鼠進入下一步實驗。分別于造模1、3及8周后再次檢測尾靜脈隨機血糖，血糖值持續(xù)>16.7 mmol/L達8周者視為糖尿病大鼠模型建模成功。建模期間，所有大鼠正常飲食，適當供給蛋白質(zhì)。除去造模過程中血糖恢復或因血糖波動死亡的大鼠，最終納入45只建模成功的大鼠(糖尿病組)以建立創(chuàng)面模型。另取45只血糖正常的健康SD大鼠作為健康組。(2)大鼠創(chuàng)面模型： 一次性腹腔注射5%水合氯醛(麻醉劑量為6 mL/kg)以麻醉兩組大鼠，消毒大鼠背部皮膚，在大鼠背部距顱后線3.5 cm正中處，用亞甲藍標記出面積為1 cm2的正方形手術區(qū)域，去皮并用紗布壓迫止血。數(shù)碼照相后貼膜覆蓋，膠布固定包扎。大鼠蘇醒并自主活動后進行單只單籠飼養(yǎng)。

1.4 異體紅細胞懸液的制備以及異體輸血 取10只SD大鼠，用手術鑷夾取大鼠眼球進行眼眶采血，取出全血約5 mL/只。用無菌注射器將收集到的全部大鼠血液(約50 mL)推入一次性去白細胞濾器血袋中。將去白細胞后的紅細胞懸液，以1 800 rpm離心10 min，去除上清液后，加入紅細胞保存液，全血與保存液體積比為4 ∶1，即制成紅細胞懸液。取20只C57BL/6野生型小鼠，腹腔注射異體濃縮紅細胞懸液(2 mL/只)。

1.5 髓源性巨噬細胞的培養(yǎng) 注射異體濃縮紅細胞懸液后3 d斷頸處死20只C57BL/6野生型小鼠，將雙側(cè)股骨和腔骨分離后清除殘留肌肉和關節(jié)，用含2%胎牛血清的磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS)收集骨髓，制成單細胞懸液，4℃下1 800 rpm離心15 min后棄去上清液；用含有10 ng/mL巨噬細胞集落刺激因子的完全培養(yǎng)基6 mL重懸小鼠骨髓細胞，接種至5 cm平皿中并于37℃的CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；4 d后，PBS清洗兩次，加入新的含有巨噬細胞集落刺激因子的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)7d后獲得髓源性巨噬細胞(bone marrow derived macrophage，BMDM)。

1.6 誘導巨噬細胞分化 向BMDM中加入10 ng/mL脂多糖和10 ng/mL IFN-γ各100 μL后將細胞移入CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～3 d，即可誘導巨噬細胞向M1型巨噬細胞分化，參考文獻[9]判斷細胞分化成功與否。向分化成熟的M1型巨噬細胞中加入10 ng/mL IL-4和10 ng/mL IL-3各100 μL后將細胞移入CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～3 d，即可誘導巨噬細胞向M2型巨噬細胞分化。于創(chuàng)面模型建造成功當天，通過尾靜脈向每只大鼠體內(nèi)注入1 mL向M1型巨噬細胞分化的BMDM懸液(含1×106個巨噬細胞)，隔天通過尾靜脈向每只大鼠體內(nèi)注入1 mL向M2型巨噬細胞分化的BMDM懸液(含1×106個巨噬細胞)。

1.7 創(chuàng)面取材 在創(chuàng)面形成后5、10、15 d，每組采用隨機數(shù)字表法隨機選取15只大鼠進行麻醉并切取部分創(chuàng)面組織，用10%福爾馬林固定組織，用于后續(xù)形態(tài)學觀察及免疫學檢測，切取其余創(chuàng)面組織置于-80℃凍存行分子生物學檢測。

1.8 觀察指標

1.8.1 創(chuàng)面愈合率：在創(chuàng)面形成后5、10、15 d，處死大鼠前，采用透明膜描記法觀測創(chuàng)面面積，記錄兩組大鼠創(chuàng)面愈合情況，計算創(chuàng)面愈合率。創(chuàng)面愈合率=(原始創(chuàng)面面積-未愈合創(chuàng)面面積)/原始創(chuàng)面面積×100%。

1.8.2 創(chuàng)面組織炎癥細胞浸潤情況：組織切片脫蠟水化后烘烤1～2 h，蘇木精染色5 min，自來水沖洗后伊紅染色40 s，自來水繼續(xù)沖洗5 min后脫水、透明、中性樹膠封片。在顯微鏡下觀察創(chuàng)面組織中炎癥細胞浸潤情況，每張切片隨機計數(shù)5個高倍視野下炎癥浸潤細胞(將染色為褐色的細胞判定為陽性細胞)數(shù)量，取平均值。

1.8.3 巨噬細胞表型標志物CD68+的檢測：組織切片脫蠟水化后烘烤1～2 h，將切片浸入pH為6.0的枸櫞酸鹽緩沖液，微波加熱冷卻后，PBS洗滌并滴加生物素化山羊抗小鼠IgG，蘇木素輕度復染，脫水、透明并封片，光學顯微鏡下每張切片隨機計數(shù)5個高倍視野下CD68+細胞(將染色為褐色的細胞判定為陽性細胞)數(shù)目，取平均值。

1.8.4 創(chuàng)面組織中炎癥因子mRNA的檢測：采用Trizol法提取創(chuàng)面組織總RNA。用分光光度法和1%瓊脂糖凝膠電泳測定RNA的濃度和純度。利用PrimeScriptTMRT試劑盒和寡核苷酸引物將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)為內(nèi)參，采用實時SYBR Green qPCR Master Mix進行實時定量PCR。引物序列見表1。反應體系為20 μL，包括10 μL SYBR預混物Ex Taq、上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL、2 μL cDNA和7.2 μL的無核酸酶水。在95℃反應30 s后，進行40個PCR循環(huán)，每個循環(huán)包括變性(95℃，5 s)和退火(60℃，30 s)。采用2-△△CT法分析IL-12β、iNOS、TNF-α mRNA的表達量。

表1 引物序列

1.8.5 創(chuàng)面組織中炎癥因子蛋白含量的測定：取創(chuàng)面組織，加入細胞裂解液勻漿25 min，8℃下以10 000 rpm/min離心20 min，取上清液，并采用二喹啉甲酸法測定蛋白質(zhì)濃度。在12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠上加載等量(每道40 μg)蛋白質(zhì)，在70 V的恒定電壓下電泳30 min，然后在120 V下電泳90 min，最后在300 mA下將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜。用5%脫脂乳在20℃封閉膜2 h，然后加入兔抗IL-12β抗體(1 ∶500)、兔抗iNOS抗體(1 ∶500)、兔抗TNF-α抗體(1 ∶2 000)和β-肌動蛋白(1 ∶4 000)抗體，37℃孵育過夜。在TBS中清洗3次，并在室溫下用適當?shù)腍RP結(jié)合二級抗體(1 ∶5 000)孵育2 h后，在X光片上用ECL檢測觀察條帶。

1.9 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料采用(x±s)表示，兩組均數(shù)比較采用t檢驗或t′檢驗，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數(shù)資料采用例數(shù)(百分比)表示，組間比較采用χ2分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同時點兩組大鼠傷口愈合情況比較 隨著觀察時間的延長，兩組大鼠的創(chuàng)面愈合率均有升高趨勢(均P<0.05)；在不同時間點，糖尿病組大鼠的創(chuàng)面愈合率均低于健康組大鼠(均P<0.05)。見表2及圖1。

表2 不同時間點兩組大鼠創(chuàng)面愈合率比較(x±s，%)

注：與同組5 d比較，*P<0.05；與同組10 d比較，#P<0.05。

圖1 不同時間點大鼠創(chuàng)面愈合情況

2.2 不同時間點兩組大鼠創(chuàng)面組織炎癥浸潤情況比較 創(chuàng)面形成后5 d時，糖尿病組創(chuàng)面組織中炎癥浸潤細胞計數(shù)少于健康組，而在創(chuàng)面形成后10、15 d，其創(chuàng)面組織中炎癥浸潤細胞計數(shù)多于健康組(均P<0.05)。隨著時間延長，健康組創(chuàng)面組織中炎癥浸潤細胞計數(shù)逐漸減少，而糖尿病組的計數(shù)逐漸升高(均P<0.05)。見表3及圖2。

表3 不同時間點兩組大鼠創(chuàng)面組織炎癥浸潤細胞計數(shù)比較(x±s，個/高倍鏡視野)

注：與同組5 d比較，*P<0.05；與同組10 d比較，#P<0.05。

圖2 不同時間點兩組大鼠創(chuàng)面炎癥細胞浸潤情況(蘇木精-伊紅染色，×200)

2.3 兩組大鼠創(chuàng)面組織CD68+染色結(jié)果 創(chuàng)面形成后5 d，糖尿病組大鼠創(chuàng)面組織CD68+細胞數(shù)量少于健康組；創(chuàng)面形成后10 d，兩組大鼠創(chuàng)面內(nèi)均可見大量CD68+細胞浸潤，其中糖尿病組的細胞浸潤數(shù)量多于健康組；創(chuàng)面形成后15 d，兩組創(chuàng)面組織CD68+細胞數(shù)量較建模后5 d時有所下降，但糖尿病組的細胞浸潤數(shù)量仍多于健康組。見圖3。

圖3 不同時間點兩組大鼠創(chuàng)面組織CD68+免疫組織化學染色結(jié)果(×400)

2.4 兩組創(chuàng)面組織中IL-12β、iNOS、TNF-α mRNA表達水平比較 創(chuàng)面形成后5 d時，糖尿病組IL-12β、iNOS、TNF-α的mRNA表達量均低于健康組(均P<0.05)；創(chuàng)面形成后10 d，糖尿病組IL-12β、iNOS的mRNA表達量均高于健康組(均P<0.05)，而TNF-α的mRNA表達量低于健康組(均P<0.05)；創(chuàng)面形成后15 d，糖尿病組的IL-12β、iNOS、TNF-α的mRNA表達量均高于健康組(均P<0.05)。見表4。

表4 兩組創(chuàng)面組織IL-12β、iNOS、TNF-α的mRNA相對表達量比較(x±s)

組別nTNF-α5 d10 d15 d糖尿病組151.754±0.2250.548±0.0261.879±0.112健康組152.245±0.2460.756±0.1120.835±0.106 t(t′)值5.7047.00626.221P值<0.001<0.05<0.001

2.5 兩組大鼠創(chuàng)面組織中IL-12β、iNOS、TNF-α蛋白表達水平比較 創(chuàng)面形成后5 d時，糖尿病組IL-12β、iNOS、TNF-α的蛋白表達量均低于健康組(均P<0.05)；創(chuàng)面形成后10 d，糖尿病組IL-12β、iNOS的蛋白表達量均高于健康組(均P<0.05)，而TNF-α的蛋白表達量低于健康組(均P<0.05)；創(chuàng)面形成后15 d，糖尿病組的IL-12β、iNOS、TNF-α的蛋白表達量均高于健康組(均P<0.05)。見圖4及表5。

表5 兩組創(chuàng)面組織IL-12β、iNOS、TNF-α蛋白表達水平的比較(x±s)

組別nTNF-α5 d10 d15 d糖尿病組15952.62±55.29112.89±12.63529.15±48.75健康組151 220.26±91.36558.63±82.37459.68±67.52 t(t′)值 9.70720.7163.231P值<0.0010.0010.003

圖4 各時間點兩組大鼠創(chuàng)面組織中IL-12β、iNOS、TNF-α蛋白表達水平

3 討 論

隨著生活節(jié)奏日益加快，糖尿病患者數(shù)量逐年增多[9]。糖尿病患者一旦出現(xiàn)傷口，則容易導致感染等并發(fā)癥，嚴重者會導致組織壞死甚至死亡[10-12]。研究表明，糖尿病患者發(fā)生皮膚潰瘍與免疫系統(tǒng)有關[13-16]，在該過程中，炎癥因子增加，抗炎癥因子減少[17]。巨噬細胞作為傷口愈合的重要防線，既可清除異物，又可促進傷口的愈合。巨噬細胞在某些刺激物如抗原等的刺激下，會出現(xiàn)分化失調(diào)，從而導致傷口愈合緩慢。而異體輸血則會引起巨噬細胞分化失調(diào)[18-20]。本研究中，兩組大鼠輸注分化失調(diào)的BMDM懸液后，創(chuàng)面愈合率均隨著觀察時間的延長而升高，其中在創(chuàng)面形成15 d時健康組大鼠的平均愈合率已達93.23%，提示異體輸血發(fā)生巨噬細胞分化失調(diào)后正常大鼠創(chuàng)面的愈合仍屬正常；但在不同時間點糖尿病組大鼠的創(chuàng)面愈合率均低于健康組大鼠(均P<0.05)，這提示異體輸血造成的巨噬細胞分化失調(diào)會對糖尿病大鼠傷口的愈合造成不利影響。

研究表明，巨噬細胞與中性粒細胞相互作用后導致中性粒細胞凋亡，巨噬細胞吞噬凋亡的中性粒細胞后發(fā)揮相應的抗炎作用，促進創(chuàng)面組織愈合，其中腺苷單磷酸活化蛋白激酶α1在該過程中發(fā)揮重要作用[21]。然而，當炎癥處于低氧環(huán)境時，能使單核細胞發(fā)生經(jīng)典型活化而成為M型巨噬細胞[22]，從而影響創(chuàng)面的愈合。另外，巨噬細胞和炎癥因子的比例也會因為外界環(huán)境的刺激而發(fā)生變化，而促炎癥反應介質(zhì)的釋放可影響巨噬細胞對炎癥反應的調(diào)節(jié)作用。本研究結(jié)果顯示，隨著時間延長，健康組創(chuàng)面組織中炎癥浸潤細胞計數(shù)逐漸減少，而糖尿病組逐漸升高，且與健康組大鼠相比，糖尿病組大鼠創(chuàng)面組織中炎癥浸潤細胞數(shù)量、炎癥因子IL-12β、TNF-α及iNOS的水平均呈早期(創(chuàng)面形成后5 d)減少晚期(創(chuàng)面形成后15 d)增多趨勢。這提示異體輸血造成的巨噬細胞分化失調(diào)，可導致糖尿病大鼠創(chuàng)面持續(xù)存在炎癥反應。正常創(chuàng)面的愈合過程主要包括炎癥反應期、細胞增殖期以及組織修復期。而糖尿病大鼠由于受到病理影響而導致創(chuàng)面愈合過程減緩甚至停滯，通常表現(xiàn)為創(chuàng)面炎癥反應的發(fā)生而導致細胞增殖異常，進而影響組織修復。此外，在創(chuàng)面愈合過程中，糖尿病組大鼠CD68+細胞早期(創(chuàng)面形成第5天時)進入創(chuàng)面的數(shù)量少于健康組大鼠，但在第10、15天時其CD68+細胞數(shù)量均多于健康組大鼠，提示在創(chuàng)面愈合晚期巨噬細胞持續(xù)停留于糖尿病大鼠創(chuàng)面。巨噬細胞是創(chuàng)面愈合主要防線，但異體輸血時可發(fā)生M1型和M2型細胞分化失調(diào)，引起腺苷單磷酸活化蛋白激酶α1分泌發(fā)生異常，進一步加大了創(chuàng)面愈合的難度。

綜上所述，異體輸血誘發(fā)巨噬細胞分化失調(diào)時，對正常大鼠創(chuàng)面的愈合無影響，但會對糖尿病大鼠傷口的愈合造成不利影響，這可能與其創(chuàng)面持續(xù)存在炎癥反應及巨噬細胞功能異常有關。因此，對于糖尿病患者進行異體輸血時臨床應嚴格把握輸血指征，避免不必要的輸血，同時提倡成分輸血，避免全血輸注。