李夢，李亞男，劉欣，王香溢，郭巖，陳志武

缺血性腦血管疾病是一種普遍的臨床疾病，而且，目前對于全球，都是一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問題，可是它發(fā)病的病理、生理機(jī)制還不是很清楚。因此，對于醫(yī)學(xué)界，如果能夠明確缺血性腦損傷的機(jī)制是非常有價(jià)值的［1］。內(nèi)源性硫化氫（hydrogen sulfide，H2S）是由血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生和釋放，并且參與腦血管疾病的過程。內(nèi)源性硫化氫主要由胱硫醚-β-合成酶（l-cystathionine-β-synthetase，CBS）和胱硫醚-γ-裂解酶（L-cystathionine-γ-lyase，CSE）催化半胱氨酸（l-cysteine，L-Cys）生成［2］。線粒體酶3-巰基丙酮酸硫轉(zhuǎn)移酶（3-mercaptopyruvate sulfurtransferase，3-MST）是在各種細(xì)胞和組織中新發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性硫化氫來源之一［3］。據(jù)報(bào)道，3-MST主要存在于線粒體中，可催化線粒體中硫化氫的生成［4］，有研究表明外源性硫化氫供體硫氫化鈉對線粒體有明顯的保護(hù)作用，可減少線粒體的損傷［5］。還有研究表明低濃度的硫化氫以及內(nèi)源性線粒體內(nèi)產(chǎn)生的硫化氫有利于哺乳動物細(xì)胞中線粒體電子運(yùn)輸和ATP生成［6］。因此，硫化氫可能也是保護(hù)線粒體免于損傷的一個(gè)重要的因素。鑒于硫化氫是參與缺血性腦損傷的重要因子，而目前文獻(xiàn)資料對細(xì)胞質(zhì)中CSE或CBS產(chǎn)生的硫化氫研究較多，但對線粒體中3-MST生成的硫化氫研究較少，而后者也有大量的硫化氫生成，因此本研究于2017年10月至2018年12月探討內(nèi)源性硫化氫來源之一——3-MST產(chǎn)生的硫化氫對血管張力的影響以及對缺氧損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞是否具有保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料血栓素A2受體激動劑U46619（美國Sigma公司，批號0481065）；硫基丙酮酸二水合物（3-mercaptopyruvate，3MP）（美國Sigma公司，批號90374）；天門冬氨酸（L-aspartic acid，ASP）（北京Solarbio公司，批號506B041）；5-氨基-3-（4-嗎啉基）-1，2，3-惡二唑鎓鹽酸鹽（SIN-1）（阿拉丁，批號C1828094）；乙酰膽堿（acetylcholine）（源葉生物公司，批號M20A9K68269）；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）（西隴化工廠）；H2DCFH-DA檢測試劑盒（碧云天公司）；Krebs Henseleit緩沖液（分別含氯化鈉119 mmol/L，氯化鈣2.5 mmol/L，氯化鉀4.7 mmol/L，碳酸氫鈉15 mmol/L，硫酸鎂1.17 mmol/L，磷酸二氫鉀1.18 mmol/L，葡萄糖5.5 mmol/L，調(diào)節(jié)PH至7.4）。

1.2 方法

1.2.1 血管環(huán)的制備和內(nèi)皮完整性的檢測［7］SD大鼠60只，雌雄各半，7～8周齡，200～220 g，購于安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物合格證號與使用許可證號均為SCXK（皖）2017-001。本研究符合一般動物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)原則。稱重，記錄水合氯醛劑量（10%，0.3 mL/100 g）；腹腔注射，麻醉；麻醉后，取腦，放置于4℃的Krebs Henseleit緩沖液中，該液通入95%氧氣和5%二氧化碳；顯微鏡下，分離基底動脈，再制成3 mm的血管環(huán)，并且把血管固定在張力傳感器的浴槽內(nèi)；浴槽中有盛有5 mL Krebs Henseleit緩沖液（PH為7.4），37℃恒溫并且持續(xù)不斷的通入95%氧氣和5%二氧化碳的混合氣體。張力儀調(diào)零平衡后，再次調(diào)整，給予血管環(huán)預(yù)負(fù)荷張力2 mN，待血管穩(wěn)定，用100 nmol/L的U46619收縮血管環(huán)10 min，再用10 nmol/L乙酰膽堿舒張血管，檢測內(nèi)皮完整。如果血管舒張率高于80%，那么，認(rèn)為內(nèi)皮完整；如果血管舒張率低于20%，即認(rèn)為去除內(nèi)皮。

1.2.2 觀察3-MST底物3MP和抑制劑ASP對U46619預(yù)收縮的血管環(huán)的影響 將內(nèi)皮完整的SD大鼠腦基底動脈血管按隨機(jī)數(shù)字表法分為：Krebs Henseleit緩沖液對照組、3MP組、ASP組、SIN-1組、ASP＋SIN-1組及3MP＋SIN-1組，共6組。血管平衡后，用10-7mol/L U46619收縮血管穩(wěn)定后，觀察3MP和ASP在1×10-5.5～1×10-3mol/L范圍內(nèi)和SIN-1在1×10-7～1×10-3.5mol/L范圍內(nèi)對血管的舒張作用。以加入1×10-7mol/L U46619誘發(fā)的收縮張力為100%，按照下列各式計(jì)算ASP等的血管舒張百分率。舒張百分率＝（U46619誘導(dǎo)的收縮張力－加ASP等后收縮張力）/U46619誘導(dǎo)的收縮張力×100%。再制備一批去內(nèi)皮血管環(huán)，檢測SIN-1對U46619預(yù)收縮的去內(nèi)皮血管環(huán)的影響。

1.2.3 血管內(nèi)腔灌注液中硫化氫含量的測定 各組血管實(shí)驗(yàn)結(jié)束，收集灌注液。取0.1 mL灌注液，根據(jù)試劑盒說明操作，按順序加入各個(gè)試劑（蒸餾水、醋酸鋅、硫酸鐵銨等），室溫靜置20 min后，波長調(diào)為665 nm，用紫外分光光度計(jì)檢測，記錄各組的吸光度值（A665）。用硫氫化鈉制備硫化氫標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各組硫化氫的含量。

1.2.4 原代培養(yǎng)大鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞 取大鼠6只，麻醉，用75%乙醇消毒2 min。將大鼠放在無菌操作臺上，注射用0.9%氯化鈉溶液進(jìn)行心臟灌流，無菌狀態(tài)下斷頭取腦，置于顯微鏡下小心剝離腦血管，用無菌磷酸緩沖鹽溶液（PBS）涮洗2遍，將血管轉(zhuǎn)移至預(yù)先加有膠原酶Ⅱ（工作濃度為2 mg/mL）的EP管中，用眼科剪將腦血管反復(fù)剪碎后，37℃消化30 min，消化后離心，保留沉淀。給予培養(yǎng)液培養(yǎng)；1～3 h后換液，目的是把懸浮的細(xì)胞和組織碎塊去除，之后根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)，3～5 d再次換液。等到80%細(xì)胞融合，傳代，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 實(shí)驗(yàn)分組以及內(nèi)皮細(xì)胞缺氧損傷模型的建立 將鋪滿單層且生長狀態(tài)良好的內(nèi)皮細(xì)胞按隨機(jī)數(shù)字表法分為6組，對照組，模型組，3MP組，ASP組，SIN-1組，3MP＋SIN-1組；除對照組以外，其他5組進(jìn)行缺氧處理，即將細(xì)胞置于37℃，95%氮?dú)狻?%二氧化碳的厭氧室中，厭氧室中的氧氣濃度用氧傳感器監(jiān)測且維持在低于1%，急性缺氧4 h。

1.2.6 ASP、3MP及SIN-1對內(nèi)皮細(xì)胞活力的影響按照“1.2.5”分組，檢測細(xì)胞生存率。缺氧4 h后，每孔加入20 μL MTT（5 mg/mL），于37 ℃，5%二氧化碳避光孵育4 h，吸棄上清液，加入150 μL二甲基亞砜（DMSO），震搖10 min。于490 nm波長，用酶標(biāo)儀檢測吸光度，重復(fù)3次。

1.2.7 3-MST活性對內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)上清中乳酸脫氫酶（LDH）的影響 將細(xì)胞按照“1.2.5”分組，缺氧后，收集培養(yǎng)液上清，測定LDH水平。LDH含量用二硝基苯肼法測定，反應(yīng)完成后，溶液顯紅棕色，按照朗伯比爾定律（Lambert-Beer law），可比色得到酶活力。

1.2.8 3-MST對內(nèi)皮細(xì)胞活性氧的影響 采用H2DCFH-DA熒光探針，檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧，細(xì)胞種板后，細(xì)胞生長至70%時(shí)用無血清的DMEM饑餓24 h，處于同一生長周期后，按照“1.2.5”分組給藥，缺氧4 h，加入H2DCFH-DA熒光探針后，37℃避光孵育30 min后，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)活性氧情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Graphpad 6軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)均以xˉ±s表示。兩組間比較采用成組t檢驗(yàn)；多組之間比較用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較用SNK法。P＜0.05時(shí)，認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ASP、3MP對U46619預(yù)收縮的血管環(huán)的影響如表1所示，與對照組相比，3-MST抑制劑ASP對U46619預(yù)收縮的血管環(huán)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；3-MST底物3MP（1×10-5.5～1×10-3mol/L）可使U46619預(yù)收縮的血管環(huán)舒張，最大效應(yīng)（Emax）為（25.36±0.81）%。與對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 梯度濃度的ASP、3MP對血管張力的影響（n＝6）

2.2 SIN-1對U46619預(yù)收縮內(nèi)皮完整和去內(nèi)皮血管環(huán)的影響如表2所示，3-MST激動劑SIN-1（1×10-4.5～1×10-3.5mol/L）能夠舒張大鼠腦基底動脈環(huán)（P＜0.05），并且具有濃度依賴性，其引起50%最大效應(yīng)濃度（EC50）為（10-4.63±100.058）mol/L，Emax為（94.67±3.99）%；與內(nèi)皮完整動脈環(huán)（+Endo）相比，SIN-1在1×10-4.5，1×10-4mol/L濃度下，去內(nèi)皮動脈環(huán)（-Endo）對SIN-1的敏感度降低，但與對照組比較依然差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），EC50為（10-4.073±100.059）mol/L，Emax為（102.50±5.51）%，甚至超過在內(nèi)皮完整動脈環(huán)上的Emax。

表2 梯度濃度的SIN-1對內(nèi)皮完整/去內(nèi)皮血管環(huán)的影響（n＝6）

2.3 ASP、3MP對SIN-1舒張血管的影響如表3所示，SIN-1的 EC50為（10-4.63± 100.058）mol/L，Emax為（99.49±6.46）%。與單用SIN-1組比較，ASP+SIN-1組能夠減弱SIN-1舒張血管作用，EC50升高至（10-3.886±100.622）mol/L，Emax為（95.56±9.62）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而3MP+SIN-1組能夠增強(qiáng)SIN-1舒張血管的作用，EC50降至（10-5.586±100.1003）mol/L，Emax為（111.49±9.62）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 ASP、3MP對SIN-1舒張血管的影響（n＝6）

2.4 3MP、SIN-1及ASP等對血管內(nèi)腔灌注液中硫化氫含量的影響結(jié)果如圖1，大鼠基底動脈在用U46619收縮后（對照組）就有（40.87±4.83）μmol硫化氫的產(chǎn)生，與對照組比較，3MP（1×10-5mol/L）組硫化氫的含量（51.19±2.45）μmol增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），SIN-1（1×10-3.5mol/L）組硫化氫的含量（80.39±3.09）μmol增加（P＜0.01），而單獨(dú)用ASP（1×10-3mol/L）組硫化氫的含量（36.77±1.88）μmol沒有影響（P＞0.05）。與單用SIN-1組比較，ASP＋SIN-1組硫化氫含量（69.25±2.26）μmol降低（P＜0.01），3MP＋SIN-1組硫化氫含量（90.09±5.36）μmol升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.5 3MP、SIN-1及ASP對內(nèi)皮細(xì)胞活力的影響結(jié)果如圖2所示，與對照組比較，模型組MTT染色可見細(xì)胞活力（56.75±1.59）%降低（P＜0.01）。與模型組相比，3MP組細(xì)胞活力（66.05±3.07）%增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），SIN-1組細(xì)胞的活力（66.89±4.46）%也增加（P＜0.05），3MP＋SIN-1組更加提高了細(xì)胞活力（75.41±6.81）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而ASP組細(xì)胞活力（48.40±3.13）%下降（P＜0.05）。

2.6 3MP、SIN-1及ASP對內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH的影響如表4所示，與對照組比較，模型組培養(yǎng)液中LDH升高（P＜0.01），表明缺氧所致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷引起LDH漏出增多；與模型組相比，單獨(dú)使用3MP和SIN-1，能使內(nèi)皮細(xì)胞上清液中LDH下降（P＜0.01）；3MP＋SIN-1組，LDH水平下降（P＜0.01）；使用ASP，上清液中LDH有所升高（P＜0.01）。

圖1 ASP、3MP及SIN-1對灌注液中硫化氫含量的影響

圖2 MP、SIN-1及ASP對內(nèi)皮細(xì)胞活力的影響

表4 各組細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH含量比較

圖3 3MP、SIN-1及ASP對細(xì)胞內(nèi)活性氧的影響（H2DCFH-DA熒光探針×200）（n＝3）：A為對照組，B為模型組，C為3MP組，D為ASP組，E為SIN-1組，F(xiàn)為3MP+SIN-1組，G為量化圖

2.7 3MP、SIN-1及ASP對細(xì)胞內(nèi)活性氧含量的影響如圖3所示，與對照組相比，模型組活性氧水平（487.5±19.48）%明顯升高（F＝21.54，P＜0.01）；與模型組比較，SIN-1組活性氧水平（310.18±42.80）%降低（P＜0.05），3MP＋SIN-1組活性氧水平（300.18±40.01）%降低（P＜0.05）；但是 3MP組（390.30±92.72）%和ASP組（520.87±14.82）%對活性氧水平影響小，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

腦血管疾病是致死的重要原因之一［7］。對于腦缺血疾病，腦血管的自我調(diào)節(jié)對于保護(hù)大腦是具有重要意義的［8］。有研究表明，外源性新型硫化氫供體GYY4137能夠減輕大鼠腎缺血損傷［9］。近年來，證實(shí)了硫化氫是一種重要的內(nèi)源性的氣體［9］，并具有廣泛的生理功能，如硫化氫參與調(diào)解血管舒張與收縮［10-12］、細(xì)胞的增殖和凋亡、腦保護(hù)等［13］。而在冠狀動脈中，3-MST依賴3-MP產(chǎn)生內(nèi)源性的硫化氫，進(jìn)一步支持了3-MST是硫化氫的重要來源的觀點(diǎn)［14］。而且，據(jù)報(bào)道，3-MST在血管內(nèi)皮細(xì)胞［15］，星形膠質(zhì)細(xì)胞［16］和神經(jīng)元［17］等都有表達(dá)。

在此基礎(chǔ)上，本研究通過運(yùn)用3-MST的抑制劑ASP，底物3MP和激動劑SIN-1探討3-MST生成的硫化氫對血管舒張是否有作用以及能否保護(hù)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞，結(jié)果提示對于血管舒縮來說，3-MST底物3MP能夠促進(jìn)血管舒張，3-MST激動劑SIN-1對大鼠基底動脈有濃度依賴性的舒張作用，而ASP雖然有引起血管收縮的趨向，可是差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；ASP能夠減弱SIN-1舒血管作用，3MP能夠增強(qiáng)SIN-1舒血管作用。血管環(huán)灌注液中硫化氫含量同樣表明，3MP和SIN-1能夠增加硫化氫的生成量，并且3MP和SIN-1有協(xié)同作用，而ASP能夠抑制SIN-1的作用，這與上述血管舒張作用的結(jié)果是一致的，進(jìn)一步說明了3-MST生成的硫化氫參與了舒張腦基底動脈血管作用。

本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，SIN-1對內(nèi)皮完整血管的舒張效應(yīng)勝過去內(nèi)皮血管，提示3-MST產(chǎn)生的硫化氫介導(dǎo)的舒血管作用有內(nèi)皮依賴性機(jī)制的參與，也就是說，內(nèi)皮細(xì)胞可以通過3-MST來產(chǎn)生釋放硫化氫，舒張大鼠腦血管。因此，我們檢測了3-MST的活性對內(nèi)皮細(xì)胞的影響。內(nèi)皮細(xì)胞缺氧損傷后，通過測定細(xì)胞活性、LDH漏出和活性氧的含量來反應(yīng)細(xì)胞損傷程度。結(jié)果提示，3-MST的活性能夠明顯影響到內(nèi)皮細(xì)胞的活力，加入ASP能夠降低細(xì)胞活力，而使用3MP，SIN-1能夠增加細(xì)胞活力，減少LDH漏出，減少細(xì)胞中活性氧的水平，保護(hù)線粒體。結(jié)果表明，3-MST產(chǎn)生的硫化氫對于缺氧的內(nèi)皮細(xì)胞具有保護(hù)作用。

綜上所述，3-MST可催化硫化氫的生成，對腦基底動脈有舒張作用而且能夠保護(hù)缺氧損傷的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞。