夏清榮，單鋒，徐亞運(yùn)，梁俊，曹銀，柳楊，閆春宇

人細(xì)胞色素氧化酶2D6（Cytochrome P450 2D6，CYP2D6）作為細(xì)胞色素P450酶家族（CYP450）重要的一員，約25%經(jīng)CYP450酶系代謝的藥物受其影響，CYP2D6參與眾多藥物的體內(nèi)代謝過程，主要包括抗抑郁藥、抗精神病藥和阿片類藥物等［1-2］。相關(guān)研究表明，CYP2D6?2、CYP2D6?10和CYP2D6?14基因多態(tài)性對(duì)CYP2D6酶的活性及藥物代謝具有重要的影響［3-5］。限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）是一種經(jīng)典的基因型檢測(cè)方法，具有分型技術(shù)簡(jiǎn)單，結(jié)果穩(wěn)定，特異性好，靈敏度高，對(duì)檢材質(zhì)量要求低等優(yōu)點(diǎn)［6-7］，因此，本實(shí)驗(yàn)旨在通過PCR-RFLP法建立一種簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確和經(jīng)濟(jì)的CYP2D6基因型檢測(cè)方法，為臨床個(gè)體化用藥提供遺傳學(xué)的依據(jù)。

本研究起止時(shí)間為2017年8月至2018年6月。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 HC-2518型高速離心機(jī)（安徽中科中佳公司），C1000TMThermal型實(shí)時(shí)定量熒光PCR儀（美國(guó)BIO-RAD公司），DYY-6C型電泳儀（北京六一公司），GenoSens-1850型凝膠成像儀（上海勤翔公司）。

1.1.2 試劑 （1）DNA提取試劑盒：血液DNA小量提取試劑盒（HiPure Blood DNA Mini kit），型號(hào)D3111-03，Magen公司；（2）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)混合物（PCR Mix）：貨號(hào)P2012，廣州東盛生物科技有限公司；（3）DNA凝膠加樣緩沖液（DNA loading buffer 5）：上海遠(yuǎn)慕公司；（4）無(wú)水乙醇：江蘇強(qiáng)盛公司；（5）瓊脂糖：德國(guó)biofroxx公司；（6）引物：通用生物公司；（7）HphI限制性內(nèi)切酶：型號(hào)ER1101，Thermo scientific公司；（8）HhaI限制性內(nèi)切酶：型號(hào) ER1851，Thermo scientific公司；（9）MspI限制性內(nèi)切酶：型號(hào)ER0541，Thermo scientific公司。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集和處理 抽取靜脈血3 mL，置于乙二胺四乙酸·鉀離子（EDTA·K+）抗凝管中，4℃保存，長(zhǎng)期-80℃保存。

1.2.2 DNA的提取和PCR擴(kuò)增 外周血總DNA提取采用Magen公司血液DNA小量提取試劑盒，按照說明書操作。PCR擴(kuò)增采用普通PCR的方法，按照說明書操作，實(shí)驗(yàn)中所涉及到的引物序列見表1。

表1 PCR使用的引物

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：DNA模板5.0 μL，正向引物1.0 μL，反向引物1.0 μL，雙蒸水（ddH2O）18.0 μL，PCR Mix 25.0 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸45 s，40個(gè)循環(huán)，4℃保存，待酶切。

1.2.3 限制性內(nèi)切酶處理PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 取4 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用1.5%凝膠進(jìn)行凝膠電泳（80 V條件下30 min），凝膠成像儀下觀察PCR擴(kuò)增結(jié)果，確保DNA擴(kuò)增產(chǎn)物量達(dá)到酶切的條件。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，37℃水浴16 h，酶切反應(yīng)體系：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物8.0 μL，限制性內(nèi)切酶0.5 μL，10×New England Biolabs公司酶緩沖液（NE Buffer）2.0 μL，雙蒸水（ddH2O）9.5 μL。

不同CYP2D6基因型對(duì)應(yīng)的限制性內(nèi)切酶見表2。

表2 限制性內(nèi)切酶的種類

1.2.4 酶切結(jié)果 取8 μL酶切產(chǎn)物用2%凝膠進(jìn)行凝膠電泳（80 V條件下15 min，然后120 V條件下15 min），凝膠成像儀下觀察酶切結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 CYP2D6?2 PCR-RFLP結(jié)果樣本PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為211 bp的特異性片段。CYP2D6?2野生型純合子CC產(chǎn)生128 bp+83 bp的片段，突變型純合子TT產(chǎn)生211 bp的片段，突變型雜合子CT產(chǎn)生211 bp+128 bp+83 bp的片段。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及經(jīng)HhaI酶切后所得產(chǎn)物結(jié)果見圖1。

圖1 CYP2D6?2擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切結(jié)果分析

2.2 CYP2D6?10 PCR-RFLP結(jié)果樣本PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為272 bp的特異性片段。CYP2D6?10野生型純合子CC產(chǎn)生213 bp+59 bp的片段，突變型純合子TT產(chǎn)生112 bp+101 bp+59 bp的片段，突變型雜合子CT產(chǎn)生213 bp+112 bp+101 bp+59 bp的片段。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及經(jīng)HphI酶切后所得產(chǎn)物結(jié)果見圖2。

圖2 CYP2D6?10擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切結(jié)果分析

2.3 CYP2D6?14 PCR-RFLP結(jié)果樣本PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為492 bp的特異性片段。CYP2D6?14野生型純合子CC產(chǎn)生285bp+207bp的片段，突變型純合子TT產(chǎn)生492bp的片段，突變型雜合子CT產(chǎn)生492bp+285bp+207bp的片段。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及經(jīng)MspI酶切后所得產(chǎn)物結(jié)果見圖3。

圖3 CYP2D6*14擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切結(jié)果分析

3 討論

藥物代謝主要依賴于肝微粒體中的各種酶系，其中最重要的是CYP450酶系。CYP2D6作為CYP450家族重要的一員，主要參與抗精神病藥物、抗抑郁藥物和抗心律失常藥物等的體內(nèi)代謝過程［8］。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CYP2D6存在100個(gè)以上的等位基因［9］，這些基因突變后往往引起酶活性和數(shù)量的改變［10］，進(jìn)而影響藥物在體內(nèi)的代謝速率，最終影響藥物的療效和導(dǎo)致不良反應(yīng)的發(fā)生。

研究表明，CYP2D6基因多態(tài)性與抗高血壓藥物療效及不良反應(yīng)發(fā)生率存在一定的相關(guān)性［11-14］。Yoshihiro等［11］對(duì)1 880例研究對(duì)象的非同質(zhì)單核苷酸多態(tài)性進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CYP2D6?10功能突變位點(diǎn)發(fā)生頻率最高，達(dá)到51%～70%，而CYP2D6?10位點(diǎn)的突變可降低酶的活性，對(duì)美托洛爾藥代動(dòng)力學(xué)的影響甚為明顯［12］。桑海強(qiáng)等［13］的研究證實(shí)了這一觀點(diǎn)，依據(jù)基因型確定給藥方案的治療組降壓總有效率顯著高于常規(guī)治療組，同時(shí)不良反應(yīng)發(fā)生率明顯降低。目前，臨床已推薦口服美托洛爾前檢測(cè)CYP2D6基因型，根據(jù)基因型調(diào)整給藥劑量，以保證病人獲得最大收益的同時(shí)降低發(fā)生不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)［14］。CYP2D6在某些常用的精神科藥物代謝過程中亦扮演了重要角色。國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果顯示，利培酮、奮乃靜、阿立哌唑、氯丙嗪等抗精神病藥物的代謝過程與CYP2D6基因多態(tài)性密切相關(guān)［15-17］，其中CYP2D6?2、?10、?14基因型對(duì)抗精神病藥物體內(nèi)代謝過程影響重大［3-5］，可影響血藥濃度、療效及不良反應(yīng)的發(fā)生，而精神科藥物往往不良反應(yīng)多且相對(duì)較為嚴(yán)重，因此，開展CYP2D6基因多態(tài)性的臨床檢測(cè)意義重大。

目前，在研究和檢測(cè)藥物基因組學(xué)方面，主要技術(shù)方法包括PCR-DNA測(cè)序技術(shù)、基因芯片技術(shù)、順序特異性寡核苷酸聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction-sequence specific oligonucleotide，PCRSSO）技術(shù)及等位基因特異性寡核苷酸探針（polymerase chain reaction-allele specific oligonucleotide，PCR-ASO）技術(shù)等，這些技術(shù)方法的特點(diǎn)為自動(dòng)化程度較高，人為操作影響小，但以上技術(shù)方法存在檢測(cè)成本高、實(shí)驗(yàn)室條件要求嚴(yán)苛和操作復(fù)雜等缺點(diǎn)。因此，我們希望建立一種簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)的等位基因檢測(cè)方法，用于鑒別CYP2D6的基因型，為臨床個(gè)體化用藥提供遺傳學(xué)依據(jù)。

PCR-RFLP是一種經(jīng)典的基因多態(tài)性檢測(cè)方法，技術(shù)方法成熟，具有操作簡(jiǎn)單、特異性高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，相對(duì)之前所述技術(shù)方法而言，儀器設(shè)備、實(shí)驗(yàn)條件等投入成本較低，較為適合條件一般的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用，可被廣泛使用于醫(yī)療機(jī)構(gòu)的臨床檢驗(yàn)。為此，我們查閱了相關(guān)文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)有研究者曾采用PCR-RFLP法檢測(cè)CYP2D6位點(diǎn)的基因多態(tài)性。由于CYP2D6在外周血中表達(dá)量不及肝臟細(xì)胞，故與文獻(xiàn)［17］中所采用的方法相比較，本實(shí)驗(yàn)通過增加PCR擴(kuò)增體系中DNA模板上樣體積確保擴(kuò)增效果，同時(shí)，本研究降低了引物濃度以減少PCR擴(kuò)增過程中引物二聚體對(duì)結(jié)果的影響。另外，我們通過降低退火溫度和增加循環(huán)數(shù)確保模板DNA得到有效擴(kuò)增的同時(shí)避免了雜帶擴(kuò)增帶來的不利影響。通過以上的優(yōu)化和改進(jìn)，使得模板DNA得到有效的擴(kuò)增，電泳條帶清晰明了，避免了二聚體和雜帶擴(kuò)增帶來的影響。

我們的實(shí)驗(yàn)方法亦具有經(jīng)濟(jì)節(jié)約、降低實(shí)驗(yàn)成本的優(yōu)點(diǎn)，相較于采用PCR-DNA測(cè)序技術(shù)、基因芯片技術(shù)等高新技術(shù)所需配備的諸如焦磷酸測(cè)序儀、基因芯片測(cè)序儀等上百萬(wàn)甚至數(shù)百萬(wàn)的昂貴設(shè)備，PCR-RFLP法僅需配備數(shù)千元的設(shè)備即可；同時(shí)由于限制性內(nèi)切酶價(jià)格較高，在保證酶切結(jié)果穩(wěn)定、可靠、滿意的前提下，與文獻(xiàn)［17］相比較，本實(shí)驗(yàn)酶切體系限制性內(nèi)切酶的用量減半，有效地降低了實(shí)驗(yàn)成本。另外，本研究的結(jié)果采用焦磷酸測(cè)序法進(jìn)行了驗(yàn)證（由安徽通用生物系統(tǒng)有限公司完成，測(cè)序號(hào)為s142585、s143294和s155376），進(jìn)一步證實(shí)了PCR-RFLP法的可靠性。然而，PCR-RFLP法亦有其明顯的缺點(diǎn)，主要是通量太低，大量分型時(shí)工作量大，并且只適用于部分單核苷酸多態(tài)性分型。值得注意的是，采用PCR-RFLP法檢測(cè)基因多態(tài)性時(shí)，需盡可能確保模板DNA擴(kuò)增的特異性，避免非特異性產(chǎn)物的出現(xiàn)從而競(jìng)爭(zhēng)酶活性，導(dǎo)致模板DNA剪切不完全及雜帶的出現(xiàn)；同時(shí)，酶切過程需盡可能充分、完全，避免假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。

綜上所述，本研究建立了以PCR-RFLP法為基礎(chǔ)的CYP2D6藥物代謝相關(guān)基因位點(diǎn)基因型檢測(cè)的方法，該方法具有簡(jiǎn)便、高效、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)，可在臨床及實(shí)驗(yàn)室推廣使用，以期為臨床個(gè)體化合理用藥和精準(zhǔn)醫(yī)療及相關(guān)基礎(chǔ)研究提供方法依據(jù)。