趙俐婷，王乃寧，賀芳，張燕

CRISPR/Cas 9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats and CRISPR-Associated Proteins）系統(tǒng)是從原核生物中發(fā)現(xiàn)的一種防御外源性遺傳物質(zhì)入侵的自身免疫機(jī)制［1-2］，能夠識(shí)別自身和外源入侵DNA片段。它具有簡(jiǎn)單、方便、高效等特點(diǎn)［3-4］，這種新型基因組靶向修飾技術(shù)已被廣泛應(yīng)用［5-8］。通過(guò)人工設(shè)計(jì)tracrRNA/cRNA復(fù)合體，形成單鏈向?qū)NA（guide RNA，gRNA），使Cas 9蛋白對(duì)特定的DNA序列進(jìn)行靶向切割［4］。隨后DNA通過(guò)非同源性末端接合或同源性重組，對(duì)斷裂的DNA進(jìn)行修復(fù)，發(fā)生替換、移碼或缺失突變，達(dá)到基因敲除的目的［9-11］。

基質(zhì)Gla蛋白（matrix Gla protein，MGP），是最初從牛骨骼中分離出的分子量為14 kD的維生素K依賴(lài)性循環(huán)蛋白［12］。MGP廣泛存在于骨［13］、軟骨［14］、牙質(zhì)［15］等組織中，是調(diào)節(jié)骨形成和軟組織鈣化的重要基質(zhì)蛋白［16］。MGP基因敲除小鼠出生后由于大動(dòng)脈硬化破裂于6～8周內(nèi)死亡［17-18］。MGP基因敲除小鼠還表現(xiàn)為軟骨內(nèi)骨化缺陷，尤其是生長(zhǎng)板軟骨，導(dǎo)致體型短小、骨量減少，提示MGP對(duì)成骨細(xì)胞分化有一定作用［19］。但迄今為止，尚未見(jiàn)到MGP對(duì)破骨細(xì)胞分化產(chǎn)生作用的報(bào)道。本研究于2018年5月至2019年1月利用CRISPR/Cas 9技術(shù)構(gòu)建了MGP基因敲除的RAW264.7巨噬細(xì)胞系，為研究MGP在破骨細(xì)胞的功能提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 RAW264.7細(xì)胞系（購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)）用含10%胎牛血清（FBS）的α-MEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，293-T細(xì)胞用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃、5%二氧化碳，每隔2 d傳代1次。

1.1.2 試劑 質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)于北京TIANGEN公司（批號(hào)Q5517）、DNA純化試劑盒購(gòu)于北京TIANGEN公司（批號(hào)R6308）、限制性內(nèi)切酶BsmBI購(gòu)于美國(guó)NEB公司（批號(hào)201805028）、T4連接酶購(gòu)于西安海寧生物有限公司（批號(hào)AH70102A）、α-MEM培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Hyclone公司、FBS購(gòu)于美國(guó)GIBCO公司（批號(hào)42F9081K-2023-1）、巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF）購(gòu)于美國(guó)Pepro Tech公司（批號(hào)AF-315-03）、核因子κ B受體活化因子配體（RANKL）購(gòu)于美國(guó)Pepro Tech公司（批號(hào)315-11C）、Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher公司（批號(hào)11668027）。

1.2 方法

1.2.1 gRNA設(shè)計(jì)和寡核苷酸鏈合成 利用MIT在線軟件設(shè)計(jì)針對(duì)小鼠MGP基因的gRNA，在靶序列正義鏈的5’端添加??CACCG，反義鏈的5’端添加AAAC，3’端添加C。

1.2.2 gRNA表達(dá)載體構(gòu)建 使用BsmBI限制性內(nèi)切酶線性化質(zhì)粒LentiCRISPRv2，酶切體系為：BsmBI 1 μL，LentiCRISPRv2 5 μg，10×buffer 5 μL，補(bǔ)水至50 μL，55℃酶切過(guò)夜。1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)酶切質(zhì)粒進(jìn)行分離，利用DNA純化試劑盒回收需要的片段。gRNA寡核苷酸單鏈退火形成雙鏈，退火反應(yīng)體系為：gRNA Up（100 μM）1 μL，gRNA Down（100 μM）1 μL，10×Buffer 1 μL，補(bǔ)水至 10 μL。95℃反應(yīng)5 min后自然冷卻至室溫。將退火產(chǎn)物與線性化LentiCRISPRv2質(zhì)粒連接，連接反應(yīng)體系為：線性化LentiCRISPRv2質(zhì)粒200 ng，稀釋10倍的退火產(chǎn)物2 μL，10×Buffer 1 μL，T4連接酶1 μL，補(bǔ)水至10 μL，16℃反應(yīng)4 h。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。挑取陽(yáng)性克隆，搖菌，次日送公司測(cè)序鑒定。將含有正確序列的菌液保種，提取質(zhì)粒備用。

1.2.3 包裝重組慢病毒 293-T細(xì)胞接種于6孔板中，次日當(dāng)達(dá)到70%密度時(shí)，利用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑，分別將800 ng LentiCRISPRv2-MGP-gRNA1，2，3，ctrl與600 ng psPAX2質(zhì)粒、200 ng VSVG質(zhì)粒一同轉(zhuǎn)染入293-T細(xì)胞中。8 h后換新鮮培養(yǎng)基。再過(guò)24 h后收集病毒上清備用。

1.2.4 感染RAW264.7細(xì)胞及篩選穩(wěn)定細(xì)胞株RAW264.7細(xì)胞接種于6孔板中，次日當(dāng)達(dá)到50%密度時(shí)，加入含有50%病毒、8 μg/mL聚凝胺（polybrene）的新鮮培養(yǎng)基進(jìn)行感染。24 h后換含有1 μg/μL嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基進(jìn)行篩選（感染成功的RAW264.7細(xì)胞具有嘌呤霉素抗性），3 d后收取細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量多聚核苷酸鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR）檢測(cè)MGP基因敲除效率 提取細(xì)胞總RNA，取1 μg進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，cDNA稀釋10倍后使用TaKaRa實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒，進(jìn)行qPCR，反應(yīng)體系為：2×mix 10μL、正/反向引物（10 μM）0.5 μL、cDNA 模板 5 μL，補(bǔ)水至20 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性10 min，95℃變性10 s，60℃退火10 s，72℃延伸20 s，40個(gè)循環(huán)。使用甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）基因?yàn)閮?nèi)參，2-△△CT法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）檢測(cè)MGP基因敲除效率 收集細(xì)胞，用RIPA細(xì)胞裂解液提取蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量。取20 μg蛋白進(jìn)行凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后用脫脂奶粉室溫封閉1 h，一抗（1∶1 000）4℃孵育過(guò)夜，二抗（1∶1 000）孵育1 h，隨后曝光分析灰度值。

1.2.7 qPCR檢測(cè)破骨細(xì)胞分化標(biāo)志分子的表達(dá)情況 對(duì)不同細(xì)胞克隆用破骨細(xì)胞誘導(dǎo)液（含有30 ng/mL M-CSF、100 ng/mL RANKL的10%FBS α-MEM完全培養(yǎng)基）進(jìn)行誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，每2天換液1次，5 d后待細(xì)胞出現(xiàn)明顯的破骨細(xì)胞形態(tài)特征（多核、巨大），收集細(xì)胞，提取總RNA，具體操作見(jiàn)1.2.5所述，檢測(cè)破骨分化標(biāo)志分子Itgb3、Acp5、Ctsk的mRNA水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以xˉ±s表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LentiCRISPRv2-MGP-gRNA重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定根據(jù)小鼠MGP基因序列，利用網(wǎng)站評(píng)分選擇3種gRNA，合成的序列如下。gRNA1：5′-CACCGTTGCCACGGCCAGCGCAGCC-3′，5′-AAACGGCTGCGCTGGCCGTGGCAAC-3′；gRNA2：5′-CACCGAAAGAGGTACTGGAACTCGA-3′，5′-AAACTCGAGTTCCAGTACCTCTTTC-3′；gRNA3：5′-CACCGGCTGTGTGAGCGCTACGCCA-3′，5′-AAACTGGCGTAGCGCTCACACAGCC-3′；對(duì)照序列：5′-CACCGCGCTTCCGCGGCCCGTTCAA-3′，5′-AAACTTGAACGGGCCGCGGAAGCGC-3′。將上述寡核苷酸退火后與LentiCRISPRv2質(zhì)粒連接，構(gòu)建成LentiCRISPRv2-MGP-gRNA重組質(zhì)粒，測(cè)序鑒定結(jié)果如圖1所示，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 LentiCRISPRv2-MGP-gRNA重組質(zhì)粒測(cè)序鑒定結(jié)果

2.2 MGP基因敲除效果鑒定

2.2.1 MGP基因敲除效果qPCR鑒定 包裝重組慢病毒并感染RAW264.7細(xì)胞，篩選后得到穩(wěn)定MGP基因敲除細(xì)胞克隆，qPCR驗(yàn)證敲除效率。如圖2所示，以ctrl組作為對(duì)照，LentiCRISPRv2-MGP-gRNA1細(xì)胞的MGP表達(dá)水平為對(duì)照細(xì)胞的（18±4）%，敲除了82%，其敲除效率最佳；LentiCRISPRv2-MGP-gRNA2細(xì)胞的MGP表達(dá)水平為對(duì)照細(xì)胞的（36±10）%，敲除效率為64%；LentiCRISPRv2-MGP-gRNA3細(xì)胞的MGP表達(dá)水平為對(duì)照細(xì)胞的（26±7）%，敲除效率為74%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2 不同RAW264.7細(xì)胞克隆MGP的mRNA水平

2.2.2 MGP基因敲除效果蛋白質(zhì)印跡法鑒定 利用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)MGP蛋白表達(dá)情況，驗(yàn)證不同gRNA敲除效果。如圖3顯示，以β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）為內(nèi)參，與對(duì)照細(xì)胞（ctrl）相比，LentiCRISPRv2-MGP-gRNA1、2、3細(xì)胞克隆的MGP蛋白水平均明顯降低，MGP基因表達(dá)被有效地人為干預(yù)。

圖3 不同RAW264.7細(xì)胞克隆MGP的蛋白水平

2.2.3 MGP基因敲除后對(duì)破骨細(xì)胞分化的影響對(duì)不同細(xì)胞克隆用含30 ng/mL M-CSF、100 ng/mL RANKL的10%FBS α-MEM培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)分化，每2天換液1次，5 d后收集細(xì)胞，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，qPCR檢測(cè)破骨細(xì)胞分化標(biāo)志分子Itgb3、Acp5、Ctsk的mRNA水平。結(jié)果如圖4所示，3種敲除MGP的不同細(xì)胞克隆經(jīng)誘導(dǎo)分化后，與對(duì)照細(xì)胞（ctrl）［（1.10 ± 0.11）、（1.02 ±0.09）、（1.12± 0.04）］相比，LentiCRISPRv2-MGP-gRNA1細(xì)胞的破骨標(biāo)志分子Itgb3、Acp5、Ctsk mRNA水平分別為（2.29±0.17）、（2.86±0.15）、（2.07±0.13），均顯著增加（P＜0.05）；LentiCRISPRv2-MGP-gRNA2、LentiCRISPRv2-MGP-gRNA3細(xì)胞的破骨標(biāo)志分子的mRNA水平也均顯著增高［（1.79±0.12）、（1.75±0.17）、（1.69±0.09）；（1.62±0.19）、（2.21±0.13）、（1.91±0.15），P＜0.05］。以上結(jié)果提示敲除MGP后破骨細(xì)胞分化加速，表明MGP抑制破骨細(xì)胞分化。

3 討論

CRISPR/Cas 9是一種在基因組水平上由RNA指導(dǎo)Cas 9蛋白選擇性編輯目的基因的方法。由于操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)少，應(yīng)用日益廣泛［1-4］。在基因敲除、調(diào)控基因的表達(dá)水平、疾病的基因編輯治療等方面發(fā)揮重要作用。相較于其他基因編輯技術(shù)，CRISPR中Cas 9蛋白具有不需要形成二聚體來(lái)發(fā)揮作用，可通過(guò)構(gòu)建多個(gè)gRNA實(shí)現(xiàn)多重編輯并同時(shí)沉默任意數(shù)量的單個(gè)基因等優(yōu)勢(shì)。

本實(shí)驗(yàn)利用CRISPR/Cas 9技術(shù)，在gRNA介導(dǎo)下使含有核酸酶、解旋酶等生物活性的Cas 9酶對(duì)MGP基因外顯子特定的DNA序列進(jìn)行特異性切割，通過(guò)非同源性末端接合或同源性重組，在細(xì)胞DNA修復(fù)作用下，達(dá)到敲除基因的目的［9-11］。本研究利用CRISPR/Cas 9技術(shù)將RAW264.7細(xì)胞中的MGP基因表達(dá)水平敲低82%，該穩(wěn)定RAW264.7細(xì)胞系可用于進(jìn)一步研究MGP功能。

圖4 不同RAW264.7細(xì)胞克隆破骨分化標(biāo)志分子的mRNA水平：A為Itgb3，B為Acp5，C為Ctsk

MGP廣泛存在于軟骨、骨髓、動(dòng)脈壁等組織中，是一種由84個(gè)氨基酸組成的維生素K依賴(lài)蛋白，調(diào)節(jié)骨形成和軟組織鈣化［20］。在骨骼中MGP參與了骨鈣化調(diào)節(jié)［12］。有研究證實(shí)MGP是血管和軟骨組織鈣化的抑制劑，在血管鈣化病變中MGP調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的分化［17-18］。MGP可抑制核因子-κB（NF-κB）活性，可能通過(guò)抑制RANKL促進(jìn)成骨細(xì)胞分泌骨保護(hù)素OPG，促進(jìn)成骨細(xì)胞存活［19］。以上研究揭示了MGP在成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞中的作用，而MGP是否參與了破骨細(xì)胞分化成熟尚未見(jiàn)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)CRISPR/Cas 9技術(shù)，建立了穩(wěn)定低表達(dá)MGP的RAW264.7細(xì)胞系，利用蛋白質(zhì)印跡法、qPCR對(duì)其MGP表達(dá)情況進(jìn)行鑒定。相比于對(duì)照組，MGP基因的表達(dá)均明顯降低。進(jìn)一步對(duì)不同細(xì)胞克隆進(jìn)行破骨誘導(dǎo)分化，并通過(guò)qPCR檢測(cè)其破骨標(biāo)志分子表達(dá)量，結(jié)果顯示穩(wěn)定低表達(dá)MGP的細(xì)胞克隆，其破骨標(biāo)志分子的表達(dá)水平增高，證實(shí)MGP可抑制破骨細(xì)胞分化。但MGP參與破骨細(xì)胞分化的機(jī)制還有待深入研究，我們推測(cè)，MGP作為一種胞外基質(zhì)蛋白，可能通過(guò)結(jié)合某些蛋白抑制破骨細(xì)胞分化。這需要更多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，將是我們近期工作的主要方向。