魏志敏，呂瑋，裴美燕，宋世佳，盧川，劉秋紅，李順國(guó)*

（1.河北省農(nóng)林科學(xué)院谷子研究所，河北省雜糧研究實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家谷子改良中心，河北 石家莊 050035；2.國(guó)家半干旱農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊 050051；3.邯鄲市邯山區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河北 邯鄲 560000；4.河北醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，河北石家莊 050000）

藜麥原產(chǎn)于安第斯山脈，有5 000 a以上的種植歷史，是印加土著居民的主要傳統(tǒng)食物，近年來(lái)藜麥葉的食用價(jià)值得到了人們?cè)絹?lái)越多的廣泛認(rèn)可。藜麥葉含有人體必需的氨基酸、維生素、微量元素等多種營(yíng)養(yǎng)成分，還富含黃酮等多種生物活性成分，因此，具有較高的食用價(jià)值和一定的藥用價(jià)值[1，2]。醫(yī)學(xué)研究表明，黃酮類化合物具有抗氧化，改善血管彈性，抗癌、抗菌、殺菌，治療冠心病、心絞病、高血壓，止咳、平喘、祛痰等功效[3]。當(dāng)前藜麥子粒已經(jīng)成為功能食品研究利用的熱點(diǎn)，受到各國(guó)消費(fèi)者的廣泛青睞，但對(duì)藜麥苗的保健成分研究還較少。

本項(xiàng)目以藜麥葉為試驗(yàn)原料，以總黃酮為研究對(duì)象，以乙醇作為提取溶劑，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Design-Expert分析對(duì)藜麥葉黃酮提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期獲得較高的提取率，為菜用藜麥在食品和藥品領(lǐng)域的應(yīng)用提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 藜麥苗 樣品于2019年5月6日采自河北省農(nóng)林科學(xué)院郄馬試驗(yàn)站，株高15 cm，冷凍烘干后粉碎、研磨，過50目篩，裝袋備用。

1.1.2 藥劑 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：光譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)；無(wú)水乙醇和氫氧化鈉：分析純，天津大茂化學(xué)試劑廠生產(chǎn)；亞硝酸鈉和硝酸鋁：分析純，上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。

1.1.3 儀器與設(shè)備 6202高速粉碎機(jī)：北京環(huán)亞天元機(jī)械有限公司生產(chǎn)；UV-3200PCS型紫外-可見分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司生產(chǎn)；電子天平：精度0.1mg，上海奧豪斯有限公司生產(chǎn)；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵：上海青浦滬西儀器廠生產(chǎn)；RE-522A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠生產(chǎn)；DK-S26型數(shù)顯恒溫水浴鍋：蘇州威爾實(shí)驗(yàn)用品有限公司生產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品5.0 mg置于25 mL容量瓶?jī)?nèi)，加入體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇溶液，充分溶解、搖勻后定容，得到0.2 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別準(zhǔn)確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL置于10 mL試管內(nèi)，依次加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的NaNO2溶液0.3 mL混勻，室溫下靜置6 min后加質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的Al（NO3）3溶液0.3 mL搖勻，靜置6 min后再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的NaOH溶液4.0 mL，再用體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇溶液定容10 mL搖勻，放置15 min，以不加蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液處理為空白對(duì)照，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定波長(zhǎng)510 nm處的吸光度。每個(gè)處理重復(fù)3次，每個(gè)重復(fù)在測(cè)定吸光度時(shí)再重復(fù)測(cè)定3次，以吸光度（Y） 為縱坐標(biāo)、濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 單因素試驗(yàn)（單因素對(duì)藜麥葉黃酮提取量的影響） 準(zhǔn)確稱取1.00 g藜麥苗粉6份，分別置于100 mL圓底燒瓶中；然后，固定乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時(shí)間和液料比中的3個(gè)因素，進(jìn)行不同單因素對(duì)黃酮提取量的影響試驗(yàn)。回流提取后，將提取液濃縮至近干，加體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇溶解并定容至50 mL，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定波長(zhǎng)510 nm處的吸光度。每個(gè)處理重復(fù)3次，每個(gè)重復(fù)在測(cè)定吸光度時(shí)再重復(fù)測(cè)定3次。

1.2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮提取量的影響。固定液料比（mL/g，下同） 25∶1，分別加入體積分?jǐn)?shù)40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液25 mL，在溫度60℃條件下回流提取100 min。

1.2.2.2 提取溫度對(duì)黃酮提取量的影響。固定液料比25∶1，用體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇溶液25mL，分別在溫度30、40、50、60、70、80℃條件下回流提取100 min。

1.2.2.3 提取時(shí)間對(duì)黃酮提取量的影響。固定液料比25∶1，用體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇溶液25 mL，在溫度60℃條件下分別回流提取60、80、100、120、140、160 min。

1.2.2.4 液料比對(duì)黃酮提取量的影響。液料比分別設(shè)定為 10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1，用體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇溶液25 mL，在溫度60℃條件下回流提取100 min。

1.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)（響應(yīng)面法對(duì)藜麥葉黃酮提取工藝的優(yōu)化分析） 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，應(yīng)用Design-Exper 10軟件的中心組合設(shè)計(jì)方法，設(shè)計(jì)乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、提取溫度（B）、提取時(shí)間（C） 和液料比（D）4個(gè)因素的響應(yīng)面試驗(yàn)。根據(jù)建立的數(shù)學(xué)模型，得到較優(yōu)后的藜麥葉黃酮提取工藝。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 單因素試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Office Excel 7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并制圖。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，應(yīng)用Design-Exper 10軟件的中心組合設(shè)計(jì)方法，進(jìn)行乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、提取溫度（B）、提取時(shí)間（C） 和液料比（D） 四因素三水平（表1） 的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，得到2個(gè)不同因素互作的立體三維圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

依據(jù)不同濃度蘆丁溶液的吸光度結(jié)果，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）。對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到蘆丁濃度-吸光度線性回歸方程為Y=0.292x+0.014 781（R2=0.999 6）?？梢钥闯?，在蘆丁濃度0.01～0.1 mg/mL范圍內(nèi)，吸光度與濃度呈正比。

圖1 蘆丁濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve between concentration and absorbance of rutin

2.2 藜麥葉黃酮提取方法的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮提取量的影響 在液料比25∶1、提取溫度60℃、提取時(shí)間100 min條件下，藜麥葉片黃酮提取量隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的提高呈先增加后降低的變化，其中乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)黃酮提取量最高（圖2）。因此認(rèn)為，最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮提取量的影響Fig.2 Effect of ethanol volume fraction on the extraction amount of flavonoid

2.2.2 提取溫度對(duì)黃酮提取量的影響 在乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、液料比25∶1、提取時(shí)間60 min條件下，藜麥葉片黃酮提取量隨著提取溫度的升高呈先增加后降低的變化，其中提取溫度為60℃時(shí)黃酮提取量最高（圖3）。因此認(rèn)為，最佳提取溫度為60℃。

圖3 提取溫度對(duì)黃酮提取量的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on the extraction amount of flavonoid

2.2.3 提取時(shí)間對(duì)黃酮提取量的影響 在乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、液料比25∶1、提取溫度60℃條件下，藜麥葉片黃酮提取量隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)呈先增加后降低的變化，其中提取時(shí)間為100 min時(shí)黃酮提取量最高（圖4）。因此認(rèn)為，最佳提取時(shí)間為100 min。

圖4 提取時(shí)間對(duì)黃酮提取量的影響Fig.4 Effect of extraction time on the extraction amount of flavonoid

2.2.4 液料比對(duì)黃酮提取量的影響 在乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、提取溫度為60℃、提取時(shí)間100 min條件下，黃酮提取量隨著液料比的增大呈先增加后降低的變化，其中液料比為30∶1時(shí)黃酮提取量最高（圖5）。因此認(rèn)為，最佳液料比為30∶1。

2.3 藜麥葉黃酮提取方法的響應(yīng)面優(yōu)化分析結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，應(yīng)用Design-Exper 10軟件的中心組合設(shè)計(jì)方法，進(jìn)行乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、提取溫度（B）、提取時(shí)間（C） 和液料比（D） 四因素三水平（表1）的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共設(shè)計(jì)出29個(gè)組合（表2）。利用Design-Exper 10軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，得到黃酮提取量（Y）對(duì)4個(gè)因素的二次多項(xiàng)回歸方程：

Y=11.951 81+0.915 00A+0.511 667B+0.186 67C+0.86857D+0.04000AB-0.22000AC+0.43000AD+0.25500BC－0.88000BD+0.09500CD-1.84614A2-1.996 14B2-1.473 64C2-2.267 27D2

圖5 液料比對(duì)黃酮提取量的影響Fig.5 Effect of liquid material ratio on the extraction amount of flavonoid

表1 響應(yīng)面分析因素水平表Table 1 Factors and levels in response surface design

表2 藜麥葉黃酮提取量的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Response surface test design and results of extraction amount of flavonoid from quinoa

對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果（表3）顯示，模型P（0.0004） ＜0.05，同時(shí)失擬項(xiàng) P（0.2176） ＞0.1000，表示正交試驗(yàn)結(jié)果可以與數(shù)學(xué)模型擬合良好。各因素對(duì)黃酮提取量的影響程度順序?yàn)樘崛r(shí)間＜提取溫度＜乙醇體積＜液料比，其中乙醇體積和液料比對(duì)黃酮提取量的影響達(dá)到了極顯著水平。

響應(yīng)面圖形是響應(yīng)值對(duì)應(yīng)于試驗(yàn)因子A、B、C、D所構(gòu)成的三維空間的曲面圖，從響應(yīng)面分析圖上可以直觀形象地看出響應(yīng)值與各參數(shù)之間相互作用產(chǎn)生的影響。根據(jù)回歸方程得出不同因子的響應(yīng)面分析圖（圖6～11），可以較直觀地看出兩因素交互作用對(duì)藜麥葉中總黃酮得率的影響。若彎曲程度大，則表明該因素對(duì)總黃酮提取量的影響越大，相應(yīng)表現(xiàn)為響應(yīng)值變化的大小。通過軟件Design-Expert分析，確定最佳黃酮提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、液料比30∶1、提取時(shí)間100 min、提取溫度61℃，黃酮提取量最大值為12.41 mg/g。測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定，與理論預(yù)測(cè)值吻合。

表3 回歸模型的方差分析結(jié)果Table 3 Variance analysis results of regression model

3 結(jié)論與討論

本研究中，首先分別考察了乙醇體積分?jǐn)?shù)、浸提時(shí)間、浸提溫度和液料比對(duì)藜麥葉黃酮提取量的影響，結(jié)果顯示，隨著4個(gè)因素水平的升高，黃酮類物質(zhì)含量呈先增加后降低的變化。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，藜麥葉黃酮得量呈先增加后減少的趨勢(shì)，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)，總黃酮得量最大。說(shuō)明當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)大于70%時(shí)，溶劑的極性降低，導(dǎo)致黃酮類物質(zhì)的溶解度降低。隨著提取溫度的升高，黃酮類物質(zhì)的溶解和擴(kuò)散速度加快，從而有利于物質(zhì)的提??；同時(shí)，黃酮類物質(zhì)氧化反應(yīng)速度也加快，不利于提取。確定恰當(dāng)?shù)臏囟仁侵匾獏?shù)，本研究中最佳提取溫度為60℃。提取時(shí)間過短，不能充分提取黃酮類物質(zhì)；提取時(shí)間過長(zhǎng)，氧化反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致黃酮類物質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞，也不利于提取。本研究條件下，提取時(shí)間為100 min時(shí)得到的黃酮量最多。液料比增大可促進(jìn)藜麥葉粉的溶解和擴(kuò)散，但是達(dá)到平衡后，繼續(xù)增加液料比反而不利于黃酮的提取，當(dāng)液料比為30∶1時(shí)提取的黃酮量最多。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，結(jié)果顯示，在乙醇體積分?jǐn)?shù)65%、液料比35∶1、提取時(shí)間100 min、提取溫度60℃條件下，黃酮提取量可以達(dá)到12.36 mg/g。

圖6 乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取溫度交互作用對(duì)黃酮提取量的等高線（A）和響應(yīng)面圖（B）Fig.6 Interaction effect of ethanol volume fraction and extraction temperature on the contour and response surface diagram of extraction amount of flavonoid

圖7 乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取時(shí)間交互作用對(duì)黃酮提取量的等高線（A）和響應(yīng)面圖（B）Fig.7 Interaction effect of ethanol volume fraction and extraction time on the contour and response surface diagram of the extraction amount of flavonoids

圖8 提取溫度與提取時(shí)間交互作用對(duì)黃酮提取量的等高線（A）和響應(yīng)面圖（B）Fig.8 Interaction effect of extraction temperature and extraction time on the contour and response surface diagram of extraction amount of flavonoid

圖9 乙醇體積分?jǐn)?shù)與液料比交互作用對(duì)黃酮提取量的等高線（A）和響應(yīng)面圖（B）Fig.9 Interaction effect of ethanol volume fraction and liquid material ratio on the contour and response surface diagram of extraction amount of flavonoid

圖10 液料比與提取溫度交互作用對(duì)黃酮提取量的等高線（A）和響應(yīng)面圖（B）Fig.10 Interaction effect of liquid material ratio and extraction temperature on the contour and response surface diagram of extraction amount of flavonoid

圖11 液料比與提取時(shí)間交互作用對(duì)黃酮提取量的等高線（A）和響應(yīng)面圖（B）Fig.11 Interaction effect of liquid material ratio and extraction time on the contour and response surface diagram of extraction amount of flavonoid

采用Design-Expert軟件的中心組合設(shè)計(jì)方法設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，建立數(shù)學(xué)模型，得到了較優(yōu)的提取工藝條件。并結(jié)合響應(yīng)面分析得到的數(shù)學(xué)模型，預(yù)測(cè)更優(yōu)的工藝條件，并進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，最后得到了從藜麥葉提取黃酮的最佳工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)68%、液料比32∶1、提取時(shí)間100 min、提取溫度61℃，該條件下黃酮提取量可以達(dá)到（12.41±0.03） mg/g。預(yù)測(cè)值與實(shí)際測(cè)定值接近，說(shuō)明此響應(yīng)面法得到的回歸模型具有一定的可靠性。