于 靜，谷 潔，王小娟，郭紅宏，王 佳，張凱煜，代曉霞，趙文雅

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 資源環(huán)境學(xué)院，陜西楊凌 712100)

作為畜禽養(yǎng)殖大國(guó)，2016年中國(guó)養(yǎng)殖業(yè)產(chǎn)生的畜禽糞便已達(dá)38億t[1]，對(duì)其合理的處置利用已成為亟待解決的問題。好氧堆肥作為農(nóng)業(yè)廢棄物無害化處理和資源利用的重要方式，其本質(zhì)是微生物對(duì)有機(jī)物進(jìn)行礦質(zhì)化和腐殖化，形成穩(wěn)定的腐殖質(zhì)類物質(zhì)的過程[2]。然而，當(dāng)前的堆肥過程中存在腐熟周期過長(zhǎng)，處理不徹底等問題[3]，更為重要的是，堆制過程中會(huì)產(chǎn)生大量臭氣，尤其是NH3的排放，這不僅造成堆肥產(chǎn)品中氮素的大量損失，而且嚴(yán)重污染環(huán)境[4]。

也有學(xué)者研究了微生物菌劑對(duì)堆肥過程微生物群落的影響，史龍翔等[11]在果樹枝條堆肥中接種了復(fù)合菌劑，通過Biolog微平板法測(cè)定發(fā)現(xiàn)接種復(fù)合菌劑主要在高溫期發(fā)揮作用，是通過改變微生物對(duì)6大類碳源的利用。解開治等[12]研究了由幾種菌株復(fù)合的菌劑對(duì)豬糞堆肥過程中細(xì)菌群落的影響，用PCR-DGGE技術(shù)分析表明外源菌劑極大影響了各階段細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。目前對(duì)微生物菌劑的研究側(cè)重于探究其在堆肥進(jìn)程中的作用，對(duì)于微生物群落多樣性影響的研究方法大多采用傳統(tǒng)分子學(xué)生物手段。本試驗(yàn)接種了2種不同微生物菌劑于雞糞好氧堆肥中，測(cè)定堆肥參數(shù)和NH3排放量的變化，利用高通量測(cè)序技術(shù)分析微生物群落結(jié)構(gòu)，探究微生物菌劑的接種對(duì)堆肥過程中NH3排放的影響，揭示影響微生物群落變化的驅(qū)動(dòng)因子，闡明微生物菌劑影響堆肥進(jìn)程的生物學(xué)機(jī)制，提供了畜禽糞便無害化處理的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 堆肥材料與裝置

本試驗(yàn)的堆肥材料為雞糞，選自陜西楊凌某小型養(yǎng)雞場(chǎng)，小麥秸稈采自農(nóng)戶小麥地，晾干粉碎均勻至1～2 cm長(zhǎng)度用于調(diào)節(jié)堆體的C/N。堆肥物料的基本性質(zhì)如表1。

試驗(yàn)所用2種菌劑，Tx菌劑為西北農(nóng)林科技大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院環(huán)境微生物研究團(tuán)隊(duì)自行篩選獲得的WSD-5纖維素降解復(fù)合菌系，采用Mandels培養(yǎng)基[(NH4)2SO41.4 g/L， MgSO4·7H2O 0.3 g/L，KH2PO42.0 g/L，蛋白胨 2.5 g/L， CaCO32.0 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 5.0 mg/L， MnSO41.6 mg/L，ZnCl21.7 mg/L，CoCl 1.7 mg/L；1%(m/v)干燥的麥稈作為唯一碳源；pH 7.0]在30 ℃下以150 r/min的搖床培養(yǎng)7 d，使其菌液活菌數(shù)達(dá)到108CFU/mL用于接種。Tc菌劑選擇了2種具有保氮功能的單菌，購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，分別為松鼠葡萄球菌(Staphylococcussciuri)和巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)，CGMCC菌株編號(hào)分別為1.108 76、1.187 0，將單菌活化后進(jìn)行拮抗實(shí)驗(yàn)，然后分別選取生長(zhǎng)狀況較好的菌群進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，按1∶1的體積比混合使其菌液活菌數(shù)達(dá)到108CFU/mL，用于接種。

表1 堆肥物料的基本性質(zhì)Table 1 Basic characteristics of compost materials

堆肥試驗(yàn)在3個(gè)工作體積完全相同的130 L的密閉不銹鋼反應(yīng)器中進(jìn)行。該反應(yīng)器直徑為0.51 m，高為0.75 m，筒壁外包有8 cm泡沫塑料和5 cm石棉布用于保溫。該堆肥反應(yīng)器設(shè)有3個(gè)孔，一個(gè)在反應(yīng)器底部用于連接泵進(jìn)行曝氣，一個(gè)位于反應(yīng)器中間用于堆體溫度的測(cè)量，最后一個(gè)位于反應(yīng)器頂部用于空氣流出。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

試驗(yàn)共設(shè)置3個(gè)處理，分別為不接種任何菌劑的對(duì)照處理(CK)，接種量為5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的Tx處理，以及接種量為5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的Tc處理。

將新鮮雞糞與小麥秸稈按比例混合并調(diào)節(jié)C/N比至25左右，再根據(jù)試驗(yàn)處理分別接種Tx和Tc微生物菌劑，添加適當(dāng)?shù)娜ルx子水使含水率控制在60%左右。在初始階段將堆料混合均勻，各堆體質(zhì)量為15 kg，最后裝填在密閉的堆肥反應(yīng)器中，保持堆肥通風(fēng)速率為0.35 L/(h·kg)(干質(zhì)量)[13]，試驗(yàn)在堆肥第3天翻堆1次，隨后每 7 d翻堆1次，保證物料充分混勻。

1.3 樣品采集與分析方法

堆肥試驗(yàn)持續(xù)44 d，依據(jù)堆肥過程中溫度的變化，在堆肥第0、3、12、17、44天進(jìn)行樣品采集。采集時(shí)在堆體上、中、下部分別進(jìn)行采集并混合均勻，每份樣品均勻地分為兩部分，一部分保存于 4 ℃冰箱，用于理化指標(biāo)的分析，另一部分樣品用于微生物測(cè)序，先用真空冷凍干燥機(jī)(北京松源，中國(guó))冷凍干燥，再用超離心研磨儀(Retsch z200，德國(guó))粉碎，在進(jìn)行微生物試驗(yàn)前保存于 -80 ℃冰箱。

1.3.1 NH3和理化指標(biāo)的測(cè)定 NH3的收集于每日8：00，經(jīng)硼酸吸收后用標(biāo)準(zhǔn)H2SO4溶液滴定[14]。用溫度計(jì)每日定點(diǎn)測(cè)量堆體及其環(huán)境溫度并求取平均值。pH、含水率、總有機(jī)碳、總氮的具體測(cè)定方法參考土壤農(nóng)化分析[15]，用pH計(jì)(Mettler Toledo，瑞士)對(duì)新鮮樣品懸浮液(固 體∶水=1∶10，m/v)進(jìn)行pH的測(cè)定；含水率在105 ℃下烘干8 h測(cè)定；總有機(jī)碳的測(cè)定采用重鉻酸鉀容量法，用凱氏定氮法完成對(duì)全氮的測(cè)定。種子發(fā)芽指數(shù)(GI)參照Zucconi等[16]方法，將鮮樣按1∶10(m/v)浸提后，取5 mL于鋪有濾紙的直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中，在其中均勻放置20粒顆粒飽滿的小白菜種子，對(duì)照為5 mL蒸餾水，各處理重復(fù)3次，放到25 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后對(duì)根長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)量。種子發(fā)芽指數(shù)(GI)按下式計(jì)算：GI=(試驗(yàn)樣種子發(fā)芽率×種子根長(zhǎng))/(對(duì)照種子發(fā)芽指數(shù)×對(duì)照樣種子根長(zhǎng))×100%

1.3.2 16S高通量測(cè)序分析 將0.1 g堆肥樣品使用Fast DNA Spin Kit for Soil(MP Biomedicals，美國(guó))進(jìn)行DNA的提取，具體詳細(xì)步驟參考說明書。利用Nanodrop Spectrophotometer ND-1000(Thermo Fisher Scientific，美國(guó))檢測(cè)DNA濃度和純度，在確保樣品濃度和純度合格后，保存于-30 ℃冰箱。

將提取的DNA堆肥樣品寄送至北京諾禾致源科技股份有限公司，進(jìn)行16S rRNA基因V3-V4可變區(qū)高通量測(cè)序。通過UPARSE將序列在97%相似水平下進(jìn)行聚類，獲得可操作分類單元(OTUs)。利用QIIME進(jìn)行抽平、RDP分類，得到樣品OTUs詳細(xì)的注釋結(jié)果，進(jìn)行后續(xù) 分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析和方差分析(LSD，P<0.05)，采用Microsoft Excel 2016繪圖。利用CANOCO 4.5軟件進(jìn)行冗余分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 各處理堆肥過程中理化參數(shù)的變化

2.1.1 溫度的變化 溫度是堆肥進(jìn)程的直觀反映，如圖1所示，該過程經(jīng)歷了快速升溫、持續(xù)高溫、降溫和腐熟穩(wěn)定4個(gè)階段，各處理在堆肥第1天迅速升至55 ℃以上并維持了一定時(shí)間，達(dá)到了中國(guó)農(nóng)業(yè)廢棄物無害化處理標(biāo)準(zhǔn)(GB 7959-87)。具體來看，Tx和Tc處理于第1天達(dá)到60 ℃以上，并在55 ℃以上均維持了13 d；而CK處理升溫較慢，于第3天開始升至60 ℃以上，并于55 ℃以上持續(xù)了11 d。各處理在第10天經(jīng)翻堆后溫度又回升至55 ℃以上，在堆肥15 d后，隨著易降解有機(jī)質(zhì)的連續(xù)減少[14]，各處理溫度下降至平穩(wěn)水平。

圖1 不同堆肥處理溫度的變化Fig.1 Changes in temperature of different treatments during composting

如圖2-D所示，各處理全氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)在整個(gè)堆肥過程中均逐漸增加。堆肥初期，CK、Tx和Tc處理全氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.46%、1.51%和1.35%，各處理間差異不顯著(P>0.05)。直至堆肥結(jié)束，各處理測(cè)得的全氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別增加到2.49%、3.11%和3.08%，Tx和Tc處理顯著高于CK(P<0.05)。

2.1.3 堆肥過程中C/N和種子發(fā)芽指數(shù)(GI)的變化 C/N可看作一個(gè)較為直觀的衡量堆肥腐熟的化學(xué)指標(biāo)，CK、Tx、Tc處理的C/N在堆肥過程中均逐漸下降(圖3-A)，分別由25.49、22.96、27.97下降至12.14、10.05、11.39。這是微生物利用消耗有機(jī)碳、全氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)相對(duì)增加的結(jié)果。研究表明堆肥結(jié)束時(shí)的C/N為10～14，可表明堆肥已腐熟完全[19]。有學(xué)者采用T=(終點(diǎn) C/N)/(初始C/N)來衡量堆肥腐熟度，當(dāng)T<0.6時(shí)可認(rèn)為其達(dá)到腐熟標(biāo)準(zhǔn)[20]。在本試驗(yàn)的3個(gè)處理中，T值分別為0.48、0.44、0.41。

如圖3-B所示，各處理的種子發(fā)芽指數(shù)(GI)在整個(gè)堆肥進(jìn)程中均為增長(zhǎng)趨勢(shì)。在堆肥初期，GI較低，為27.8%～31.9%，堆肥結(jié)束時(shí)，各處理的GI分別達(dá)到93.1%、117.0%、146.3%。GI作為生物指標(biāo)常用作評(píng)價(jià)堆肥腐熟度，當(dāng)GI>60%時(shí)，可認(rèn)為其不具有植物毒性，即堆肥已達(dá)到腐熟[21]，說明經(jīng)過44 d堆肥，堆肥產(chǎn)品均達(dá)到無害化程度。

圖2 不同堆肥處理中和全氮的變化Fig.2 Changes in and total nitrogen during the composting of different treatments

圖3 不同堆肥處理中C/N和GI的變化Fig.3 Changes in C/N and GI during the composting of different treatments

2.2 堆肥過程中NH3的排放

堆肥過程中各處理的NH3排放量和積累量如圖4所示。從圖4-A可以看出，堆肥過程中NH3排放的峰值集中在高溫階段，即前10 d，在各處理中分別占總排放量的79.5%、75.4%和83.0%，并在第10 天翻堆后又出現(xiàn)回升，隨后逐漸減弱。CK、Tx、Tc處理NH3的排放量分別在第6、6、5天達(dá)到最大值，分別為1.868、1.575和1.285 g/d。圖4-B顯示了堆肥過程中NH3的累積排放量，CK、Tx、Tc處理NH3的累積排放量分別達(dá)到12.7、9.4和8.4 g/d，Tx和Tc處理與對(duì)照相比分別降低28.9%和34.1%。

圖4 不同堆肥處理NH3的排放量和累積排放量的變化Fig.4 Changes in emissions and acumulative emissions of NH3 of different treatments during composting

2.3 堆肥過程中微生物群落結(jié)構(gòu)變化

如圖5所示，細(xì)菌群落在門水平上表現(xiàn)出較大的變化。在13個(gè)樣品中，厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)和軟壁菌門(Tenericutes)是雞糞好氧堆肥過程中主要的門類水平類群，占總細(xì)菌數(shù)的93.3%～99.4%。厚壁菌門在堆肥高溫期一直占主導(dǎo)地位，隨著溫度下降其豐度逐漸降低。變形菌門、放線菌門和綠彎菌門的相對(duì)豐度在降溫期和腐熟期明顯增高，分別比堆肥第0天升高了2.66～3.85、1.30～1.87和66.3～111.6倍。

圖5 堆肥過程中主要門水平細(xì)菌相對(duì)豐度的變化Fig.5 Changes in relative abundance of bacteria at main phylum levels during composting

將細(xì)菌群落相對(duì)豐度(基于門水平)和溫度、pH、硝氨態(tài)氮、全氮(TN)、C/N、GI、NH3進(jìn)行冗余分析(圖6)，對(duì)細(xì)菌群落和環(huán)境因子之間的關(guān)系進(jìn)行探究。結(jié)果顯示選取的環(huán)境因子共解釋了細(xì)菌群落變化的90.9%，RD1軸解釋了84.8%，RD2軸解釋了6.1%。在所選的變量中溫度和pH的解釋度最高，分別為20.34%和17.51%，表明溫度和pH是雞糞堆肥過程中不同處理間細(xì)菌群落差異的主要驅(qū)動(dòng)因子。

從表2可以看出，溫度對(duì)主要的6大菌門均呈顯著相關(guān)性(P<0.01)，pH對(duì)于變形菌門、放線菌門及綠彎菌門呈顯著正相關(guān)，而對(duì)厚壁菌門呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)。厚壁菌門和變形菌門均與氮元素的轉(zhuǎn)化有顯著的相關(guān)性(P<0.05)。

表2 微生物菌劑對(duì)雞糞堆肥過程中理化性質(zhì)與門水平微生物的Spearman相關(guān)系數(shù)Table 2 Spearman’s correlation coefficients between physicochemical properties and dominant bacterial phyla during chicken manure composting

注：* 相關(guān)系數(shù)在0.05水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)。** 相關(guān)系數(shù)在0.01水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)。

Note: * Correlation coefficient was significantly correlated at 0.05 level (bilateral). ** Correlation coefficient was significantly correlated at 0.01 level (bilateral).

圖6 堆肥過程中不同處理環(huán)境因子對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的冗余分析Fig.6 Redundancy analysis between environmental factors and bacterial community structure by different treatment during composting

3 討 論

好氧堆肥是處理養(yǎng)殖場(chǎng)廢棄物主要方式，但當(dāng)前堆肥腐熟周期較長(zhǎng)，堆制過程中會(huì)產(chǎn)生大量NH3而造成養(yǎng)分損失，其臭味也會(huì)帶來環(huán)境二次污染等問題[22]。通過外源接種微生物菌劑可以加速堆肥進(jìn)程或減少有害氣體的排放[23-25]。因此本試驗(yàn)在雞糞堆肥過程中分別接種Tx和Tc 2種微生物菌劑，探究其對(duì)堆肥過程中NH3排放的影響及不同理化因子和微生物群落之間的相 關(guān)性。

通過對(duì)雞糞堆肥過程中不同處理進(jìn)行門水平細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)堆肥過程中細(xì)菌群落是不斷演化的，堆肥過程中主要的門類與Qian等[40]的研究一致。堆肥初始階段，厚壁菌門豐度最高(52.5%)，經(jīng)高溫期增加后，在降溫期逐漸下降腐熟期降至最低。有研究表明厚壁菌門成為堆肥高溫期的優(yōu)勢(shì)菌門可能與厚壁菌門的內(nèi)孢子具有耐熱性有關(guān)[41]，可以對(duì)抗外界的惡劣環(huán)境。還有研究表明，厚壁菌門對(duì)促進(jìn)纖維素的降解和利用起著特殊的作用[42]。而變形菌門和放線菌門在降溫期和腐熟期占據(jù)主導(dǎo)地位成為優(yōu)勢(shì)菌群，這與殷亞楠[43]研究結(jié)果一致。放線菌門的相對(duì)豐度在堆肥過程中逐漸增加并于堆肥結(jié)束時(shí)保持穩(wěn)定，研究表明堆肥過程中放線菌門的大量出現(xiàn)是堆肥腐熟的標(biāo)志之一[44]。與此同時(shí)，擬桿菌門的相對(duì)豐度也逐漸增加，這種門主要存在于堆肥成熟期，被認(rèn)為是專門降解高分子量化合物的細(xì)菌[45-46]。在堆肥結(jié)束時(shí)，Tx和Tc處理的擬桿菌門相對(duì)豐度分別較CK高2.96和2.82倍，這可能是接種微生物菌劑的處理腐熟程度高的原因。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)研究了接種2種不同的微生物菌劑對(duì)雞糞堆肥過程中基本理化參數(shù)、NH3排放和微生物群落的影響。結(jié)果表明，堆肥中接種Tx和Tc微生物菌劑均可以加速堆體升溫，使得高溫期延長(zhǎng)，提高堆肥的腐熟度。Tx和Tc微生物菌劑均對(duì)雞糞堆肥過程中NH3排放有一定的抑制作用，還能增加堆肥產(chǎn)品的全氮，Tc微生物菌劑對(duì)NH3的控制效果更好，具有較好的除臭保氮效果。接種微生物菌劑會(huì)對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)和組成產(chǎn)生影響，冗余分析結(jié)果表明，溫度和pH是影響微生物群落結(jié)構(gòu)變化的主要驅(qū)動(dòng)因子。厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)在氮素的轉(zhuǎn)化和釋放過程中發(fā)揮著重要作用，今后可以對(duì)其相關(guān)的功能微生物進(jìn)行深入研究，以期減少氮素的損失，進(jìn)而生產(chǎn)高質(zhì)量的堆肥產(chǎn)品。