潘曉梅，李昭煜，石曉玲，林勝紅，李佳佳，田永強

(蘭州交通大學(xué) 化學(xué)與生物工程學(xué)院，蘭州 730070)

番茄灰霉病是由灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)引發(fā)的一種危害嚴(yán)重的世界性病害，近年來在中國蔓延，已成為影響番茄產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素。該病在土壤里主要是以菌核、殘存菌絲體或分生孢子的形態(tài)存留，在低濕高溫的環(huán)境中萌發(fā)生長，主要侵染番茄的葉和果實，造成葉片干枯，果實腐爛，嚴(yán)重時可使番茄減產(chǎn)高達(dá)60%以上[1-2]。

目前，灰霉病的防治主要依靠于化學(xué)農(nóng)藥和栽培抗病品種。栽培抗病品種是防治病害的根本措施，但育種工作受到時間與技術(shù)的限制以及選育的新品種抗病單一，因此選育出有效抗灰霉的番茄品種還有待解決；而化學(xué)農(nóng)藥防治雖是速度快、成本低的有效防治措施，但造成環(huán)境的污染，且農(nóng)藥殘留問題已是人們關(guān)注的焦點[3-5]。鑒于此，人們將目光投向了生物防治。近年來，用有益微生物和其代謝產(chǎn)物防治植物病害時有報道，楊利敏等[1]在2015年報道了一株枯草芽孢桿菌的無菌發(fā)酵濾液在離體葉片上對番茄灰霉的防治效果可達(dá)100%。婁義等[7]在2018年報道了3株芽孢桿菌對番茄種子的胚根、胚軸有明顯的促進(jìn)作用，并處理盆栽番茄后，通過改變番茄根系土壤中微生物的種群變化，從而有效減少了病原真菌尖孢鐮刀菌的數(shù)量。Elad等[8]報道了2株哈茨木霉可有效控制大豆上的灰霉病，向大豆葉片噴灑發(fā)酵液能使灰霉病降低50%～100%。生物防治所使用的菌株均篩選于自然界，對環(huán)境友好，也解決了農(nóng)藥殘留問題，為植物病害的防治帶來新手段。

本試驗從甘肅省興隆山原始森林土壤中分離得到菌株XF，通過形態(tài)特征和16S rDNA序列分析鑒定為蠟樣芽孢桿菌，觀察其對番茄灰霉菌菌絲生長的影響并進(jìn)一步探討該菌株的拮抗機理，以期為番茄灰霉病的綠色防治探索新的方法。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 土樣的采集 2017年9月份，在甘肅省興隆山原始森林山腳、山腰和山頂植被保護(hù)相對完整的地方，用“S”型采樣法采取10～30 cm土層的土樣，裝入無菌袋，帶回實驗室，4 ℃保存，用于后續(xù)試驗。

1.1.2 生防菌 分離自甘肅省興隆山原始森林10～30 cm土壤的菌株XF。

1.1.3 病原真菌 番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)、番茄葉霉病菌(Fulviafulva)、番茄早疫病菌(Alternariasolani)、茄子菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)、茄子腐爛病菌(Phytophthoracinnamomi)、枸杞炭疽病菌(ColletotrichumgloeosporioidesPenz)、棉花枯萎病菌(Fusariumoxysporumvasinfectum)，試驗中用到的所有病原真菌均保存于甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院。

1.1.4 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基，LB培養(yǎng)基，脫脂牛奶瓊脂培養(yǎng)基(Skim Milk Medium)， Avicel培養(yǎng)基，幾丁質(zhì)檢測培養(yǎng)基，鐵載體檢測培養(yǎng)基，金氏培養(yǎng)基(King)，具體方法見參考文獻(xiàn)[9-13]。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，瓊脂15 g/L，pH 6.0。

1.2 方 法

1.2.1 生防菌的篩選 (1)將土壤配置成 10-1～10-5濃度的懸液，吸取10-5濃度的懸液上清液0.1 mL，采用平板涂布法培養(yǎng)菌落(LB培養(yǎng)基)，挑取形態(tài)各異的菌落劃線純培養(yǎng)。每個試驗重復(fù)3次。

(2)將培養(yǎng)5 d的番茄灰霉病菌用打孔器(直徑8 mm)打成菌餅，放置在培養(yǎng)皿中央，再用無菌牙簽將培養(yǎng)24 h的細(xì)菌用十字交叉法接種在距菌餅2 cm處，25 ℃黑暗培養(yǎng)5 d。能產(chǎn)生抑圈帶即為生防菌，并測定抑菌率[2]。每個試驗重復(fù)3次。同時，在光學(xué)顯微鏡下觀察菌落邊緣菌絲的形態(tài)變化。

抑菌率=(對照組菌落直徑-處理組菌落直徑)/對照組菌落直經(jīng)×100%

1.2.2 抑菌譜的測定 選取番茄葉霉病菌、番茄早疫病菌、茄子菌核病菌、茄子腐爛病菌、枸杞炭疽病菌、棉花枯萎病菌與篩選的生防菌XF做對峙試驗(方法同“1.2.1”)，測定菌株XF對其他病原真菌的抑制 效果。

1.2.3 菌株XF的無菌發(fā)酵濾液對番茄灰霉菌的抑制作用 將篩選出的生防菌株XF接入100 mL LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃ 160 r/min培養(yǎng)24 h后，以1∶100接入發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)60 h后，培養(yǎng)液8 000 r/min離心10 min，取上清，以孔徑為0.45 μm的菌膜過濾掉菌體得到濾液，按1∶10， 1∶100(濾液：培養(yǎng)基，V/V)將發(fā)酵濾液混入 50 ℃融化的PDA培養(yǎng)基中。待培養(yǎng)基凝固后，在培養(yǎng)皿中心接入直徑8 mm的番茄灰霉菌菌餅，25 ℃培養(yǎng)，以不加發(fā)酵濾液為對照，每組重復(fù) 3次。5 d后，測量各組菌落直徑，計算抑菌率。

1.2.4 生防因子的測定 (1)菌株XF分泌蛋白酶、葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶、鐵載體能力的定性測定：將培養(yǎng)24 h的菌株XF分別點接在脫脂牛奶瓊脂培養(yǎng)基、Avicel培養(yǎng)基、幾丁質(zhì)檢測培養(yǎng)基、鉻天青(CAS)檢測培養(yǎng)基平板上，30 ℃培養(yǎng)24～ 48 h，觀察其透明圈的直徑大小并計算D值[14](透明圈直徑-菌落直經(jīng))，測定其蛋白酶、葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶和鐵載體活性水平。

(2)菌株XF合成生長素(IAA)能力的測定：采用Salkowski比色法[15]。比色液的配置：將 4.5 g FeCl3溶于300 mL蒸餾水，緩慢加入98%濃硫酸587.4 mL，待冷卻后定容至1 L，測定IAA范圍5～200 mg/L。

1.2.5 菌株XF的分子鑒定 菌株采用16S rDNA基因序列分析并對生防菌進(jìn)行序列鑒定。采用Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒(上海生工生物工程有限公司)提取拮抗菌株總DNA后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR采用的引物為27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3′)與 1492R (5 ′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)，PCR的反應(yīng)體系為25 μL，所用程序為94 ℃預(yù)變性 5 min，94 ℃變性30 s，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸 90 s，共進(jìn)行30次循環(huán)，然后以72 ℃延伸10 min后結(jié)束。4 ℃保存，備用。送至北京華大基因完成測序工作，測序結(jié)果于NCBI 數(shù)據(jù)庫 Blast 比對分析并用 MEGA 5.0 軟件(Neighbor-Joining 法)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 生防菌的篩選

于2017年9月采集甘肅省興隆山原始森林土壤15份，從這些土樣中共分離純化到30株細(xì)菌。通過與番茄灰霉病菌的對峙培養(yǎng)結(jié)果顯示，10株有抑菌效果，處理組菌落直經(jīng)與對照組菌落直經(jīng)的差值為3.50～5.64 cm，其中菌株XF的拮抗效果最好，菌落直經(jīng)差值可達(dá)5.64 cm，因此確定菌株XF為目標(biāo)生防菌株。

2.2 菌株XF對番茄灰霉菌的拮抗作用

在對峙培養(yǎng)平板中拮抗效果明顯(圖1)，抑菌率可達(dá)66.35%，與對照組相比，處理組菌絲生長緩慢且稀薄。邊緣菌絲顯微觀察顯示(圖2，顯微鏡放大倍數(shù)為10×40倍)，菌株XF對番茄灰霉菌菌絲的生長有顯著的影響，與對照組正常生長的菌絲相比，受生防菌抑制的灰霉菌菌絲膨大變粗，分枝增多，節(jié)間縮小(圖2-1)，出現(xiàn)囊泡狀畸形，伴有細(xì)胞壁破裂，內(nèi)涵質(zhì)外泄的現(xiàn)象(圖2-2)。

1.對照 Control of B.cinerea； 2.對峙培養(yǎng) Dual culturing test

1.正常菌絲 Normal mycelia；2.菌絲膨大變粗，分枝增多，節(jié)間縮小 Mycelia branch increased while internode shortened；3.菌絲囊泡狀畸形，細(xì)胞壁破裂，內(nèi)涵質(zhì)外泄 Vesicle-like deformity，Vesicle breakdown

圖2 對峙培養(yǎng)中菌株XF對番茄灰霉菌菌絲生長的影響
Fig.2 Inhibition effect of strain XF on mycelia morphology ofB.cinerea

2.3 菌株XF抑菌譜的測定

菌株XF與番茄葉霉病菌(Fulviafulva)、番茄早疫病菌(Alternariasolani)、茄子菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)、茄子腐爛病菌(Phytophthoracinnamomi)、枸杞炭疽病菌(ColletotrichumgloeosporioidesPenz)、棉花枯萎病菌(Fusariumoxysporumvasinfectum)的PDA對峙培養(yǎng)平板結(jié)果顯示，菌株XF對這6種病原真菌均有顯著的拮抗效果(表1)，抑菌率可達(dá)60%以上，證明菌株XF對植物病害的防治具有廣譜性。

表1 菌株XF抑菌譜的測定Table 1 Determination of bacteriostatic spectrum of strain XF

注：數(shù)據(jù)為“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤”。下同。

Note:Data are “mean±standard” error.The same below.

2.4 菌株XF的無菌發(fā)酵濾液對番茄灰霉菌的抑制作用

發(fā)酵60 h的無菌濾液以1∶10和1∶100加入到PDA培養(yǎng)基中，對番茄灰霉有顯著的抑制效果(表2)，抑菌率可達(dá)98.19%和83.73%。處理組番茄灰霉菌與對照組相比，菌絲生長緩慢，稀薄。顯微觀察(顯微鏡放大倍數(shù)為10×40倍)其邊緣菌絲形態(tài)顯示，與對照組相比，菌絲延伸扭曲，有瘤狀突起，相互交纏(圖3-C、E)，菌絲斷裂，胞質(zhì)外泄(圖3-F)，分生孢子變成橢球狀(圖3-B)。

表2 菌株XF的發(fā)酵濾液對番茄灰霉菌的抑菌效果Table 2 Effect of strain XF fermentation filtrate on colony diameter and inhibition of B.cinerea

A.正常孢子 Normal spores；B.孢子形態(tài)微變 Changed spore morphology；C.菌絲瘤狀突起，相互交纏；D.正常菌絲 Normal mycelia；E.菌絲延伸扭曲，瘤狀突起 Mycelia elongated , twisted and tuberculous；F.菌絲斷裂，胞質(zhì)外泄 Mycelia ruptured and cytoplasm exserted

圖3 菌株XF的無菌發(fā)酵濾液對番茄灰霉菌菌絲生長的影響
Fig.3 Inhibition effect of strain XF fermentation filtrate on mycelia morphology ofB.cinere

2.5 菌株XF的生防因子及合成生長素能力的測定

2.5.1 菌株XF分泌蛋白酶、葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶、鐵載體能力的定性測定 將菌株XF點接在脫脂牛奶瓊脂培養(yǎng)基、Avicel培養(yǎng)基、幾丁質(zhì)檢測培養(yǎng)基、鉻天青(CAS)檢測培養(yǎng)基平板上，48 h后有透明圈產(chǎn)生(表3)，表明菌株XF的次生代謝物含有蛋白酶、葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶和鐵載體。

2.5.2 菌株XF合成生長素(IAA)能力的測定 定性測定：采用Salkowski比色法的結(jié)果表明，在不含色氨酸的金氏培養(yǎng)液接種XF菌株比色反應(yīng)顏色為淡紅色，在含色氨酸的金氏培養(yǎng)液接種XF菌株比色反應(yīng)顏色為深紅色，顏色差異明顯(圖4)。證明在金氏培養(yǎng)基中加入100 mg/L的色氨酸能顯著提高菌株XF合成生長素IAA 的量。

定量測定：采用標(biāo)準(zhǔn)樣品IAA制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖5)。在含色氨酸的金氏培養(yǎng)液中，加入比色液比色的OD值為0.575，在不含色氨酸的金氏培養(yǎng)液中，加入比色液比色的OD值為0.302。

表3 菌株XF生防因子的測定Table 3 Determination of biocontrol factor of strain XF

注：++++.D≥2 cm；+++.D=1～2 cm；++.D=0.5～1 cm；+.D<0.5 cm。

Note: ++++.D≥2 cm；+++.D=1-2 cm；++.D=0.5-1 cm；+.D<0.5 cm.

1.CK；2.不含色氨酸 No tryptophan；3.含色氨酸 Contain tryptophan

圖4 菌株XF的比色反應(yīng)
Fig.4 Strain XF colorimetric reaction

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得，菌株XF在含色氨酸的金氏培養(yǎng)液中分泌IAA的質(zhì)量濃度為13.64 mg/L，在不含色氨酸的金氏培養(yǎng)液中分泌IAA的質(zhì)量濃度為6.59 mg/L，證明色氨酸是菌株XF合成IAA過程中的一種重要前體物質(zhì)。在后續(xù)發(fā)酵試驗中，可在培養(yǎng)液中適量加入色氨酸，以提高菌株XF分泌IAA的量。

圖5 IAA標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 IAA standard curve

2.6 菌株XF的鑒定

菌株XF在LB平板上菌落粗糙，似融蠟狀(圖6-1)；菌體細(xì)胞桿狀，末端方，革蘭氏陽性，產(chǎn)芽孢(圖6-2紅色圈標(biāo)注)。以菌株XF的總DNA為模板，通過PCR獲得16S rDNA基因片段，測序后將數(shù)據(jù)提交至GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast比對，結(jié)果顯示，該菌與多種芽孢桿菌Bacillus有較高的同源性，通過MEGA 5.0構(gòu)建Neighbor Joining系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖7)，其中與蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)的同源性最高，故確定菌株XF為蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)。

圖6 菌株XF的單菌落(1)及革蘭氏染色(2)(10×100倍油鏡)Fig.6 Colony(1) and gram staining(2)(the 10×100 times oil mirror) of strain XF

圖7 MEGA 5.0構(gòu)建菌株XF 的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.7 Phylogenetic tree of strain XF using MEGA 5.0 analysis

3 討 論

番茄灰霉病已嚴(yán)重影響設(shè)施栽培番茄的產(chǎn)量與品質(zhì)，使用拮抗微生物及其代謝產(chǎn)物進(jìn)行生物防治，解決了農(nóng)藥殘留問題，有效防治了病害的發(fā)生，還減緩了病菌的抗藥性。因此在番茄的設(shè)施栽培中使用有益拮抗微生物進(jìn)行灰霉病防治，即以菌治病已成為一種有效措施[16-18]。唐容容等[19]研究了蠟樣芽孢桿菌BacilluscereusCGMCC4348 菌株對番茄灰霉病菌Botrytiscinerea的生物防治效果，發(fā)酵濾液原液對番茄灰霉病的防效達(dá) 75.80%；黃海[13]研究了解淀粉芽孢桿菌 Ba168WP 的無菌發(fā)酵液對番茄灰霉病菌的抑制效果可達(dá)80.63%，且對15 種植物病原真菌均有抑制活性。本研究從甘肅省興隆山原始森林土壤中分離得到一株蠟樣芽孢桿菌，其菌體和發(fā)酵濾液對番茄灰霉病菌均有較好的拮抗效果，且效果穩(wěn)定，同時對番茄葉霉病菌、番茄早疫病菌、茄子菌核病菌、茄子腐爛病菌、枸杞炭疽病菌、棉花枯萎病菌均有拮抗作用，因此是一株有應(yīng)用前景的生防菌。

國內(nèi)外學(xué)者對芽孢桿菌防治植物病害的機理進(jìn)行了探索，認(rèn)為芽孢桿菌可以防治植物病害是因為可以與植物病菌競爭營養(yǎng)和空間位點，并且產(chǎn)生抑菌物質(zhì)，促進(jìn)植物生長和誘導(dǎo)植物抗性等[20-23]。Glick[24]認(rèn)為生防菌株促進(jìn)植物生長就是間接抑制植物病原菌。Kakar等[25]和Yuan等[26]研究出假單胞菌可產(chǎn)生抗微生物庫，包括氰化氫(HCN)、吡蟲啉、苯嗪、吡咯硝基、鐵蛋白、環(huán)脂肽和2,4-二乙酰間苯三酚(DAPG)，以及水解酶，如蛋白酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶和-葡聚糖酶等，以此來抑制番茄灰霉病菌。本研究通過對峙培養(yǎng)和無菌發(fā)酵濾液抑制平板上的番茄灰霉菌菌絲的觀察發(fā)現(xiàn)，處理組菌絲稀薄且生長緩慢；通過對邊緣菌絲顯微觀察發(fā)現(xiàn)，菌絲畸形，分支增多，隔間縮小，有囊泡狀突起，斷裂，內(nèi)涵質(zhì)外泄等。通過對菌株XF的蛋白酶活性、幾丁質(zhì)酶活性、葡聚糖酶活性和鐵載體活性水平的測定以及對生長素IAA的檢測結(jié)果顯示，葡聚糖酶活性水平最高，為++++；蛋白酶活性水平次之，為+++；幾丁質(zhì)酶活性、鐵載體活性水平較低，為+；具有分泌生長素IAA的能力，當(dāng)在培養(yǎng)液中加入100 mg/L的色氨酸時，IAA的分泌量增長2倍。因此可以推測菌株XF在生長過程中不僅產(chǎn)生了一些酶和活性蛋白類物質(zhì)，直接抑制番茄灰霉病菌的生長，還產(chǎn)生了植物生長素IAA促進(jìn)番茄植株的生長而增強對番茄灰霉病的抗性。盡管本試驗已確定該蠟樣芽胞桿菌對番茄灰霉病菌具有一定的抑制效果， 但具體是哪種活性物質(zhì)在起作用、其抑菌機制及在田間的防治效果等還有待進(jìn)一步 研究。