劉玉海，劉明明，劉新華

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一。在我國(guó)，胃癌發(fā)病率和死亡率分別位于惡性腫瘤的第三位和第五位，近年來(lái)仍有上升趨勢(shì)[1-2]。胃癌的發(fā)生發(fā)展是多基因、多因素參與的復(fù)雜過(guò)程，其發(fā)病機(jī)制尚不完全明確。microRNA(miRNA)是一類由18～25個(gè)核苷酸組成的小分子非編碼RNA，通過(guò)與靶基因的mRNA結(jié)合，抑制其翻譯或促進(jìn)降解，從而起到調(diào)控靶基因表達(dá)的作用。大量研究[3-5]表明，miRNA直接或間接參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。miR-637在肝癌[6]、神經(jīng)膠質(zhì)瘤[7]、甲狀腺癌[8]等腫瘤細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，過(guò)表達(dá)miR-637可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移。表明miR-637可能是一個(gè)腫瘤抑制因子。但miR-637對(duì)胃癌細(xì)胞的影響尚不明確。本文擬研究miR-637在人低分化胃腺癌細(xì)胞系A(chǔ)GS、中分化胃腺癌細(xì)胞系SGC-7901和正常胃黏膜上皮細(xì)胞系GES-1中的表達(dá)水平，探討miR-637對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料人胃癌細(xì)胞系SCG7901、AGS和人胃黏膜上皮細(xì)胞系GES-1均購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)；RPMI-1640培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶、雙抗購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；CCK-8增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司；miR-637 mimics、抑制劑、轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000、RNA 提取試劑TRIzol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司；Western blot所用的CDK6、cyclin D1、E2F1、Rb、β-actin一抗均購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司；磷酸化Rb一抗、二抗購(gòu)自美國(guó)CST公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞系SCG7901、AGS和胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1，用含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，在5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)至匯聚度達(dá)到95%時(shí)傳代。細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于6孔板中培養(yǎng)24 h，按轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書操作方法，用Lipofectamine 2000分別將miR-637 mimics及陰性對(duì)照miR-NC、miR-637 inhibitor及陰性對(duì)照IN-NC轉(zhuǎn)入AGS和SCG7901細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染6 h后更換新鮮培養(yǎng)基并繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，用實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)鑒定轉(zhuǎn)染效率，并進(jìn)行后續(xù)功能實(shí)驗(yàn)。

1.3 RNA提取及qRT-PCR根據(jù)RNA提取試劑盒的說(shuō)明書，用TRIzol試劑提取各組細(xì)胞中的總RNA，利用Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，根據(jù)說(shuō)明書進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，以U6 RNA和GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法將Ct值結(jié)果進(jìn)行處理，對(duì)miR-637和CDK6 mRNA相對(duì)表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。各基因引物見表1。

1.4 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞用胰蛋白酶消化，吹打成單細(xì)胞懸液。細(xì)胞計(jì)數(shù)后，以每孔2 000個(gè)接種于96孔板，每孔200 μl培養(yǎng)基，5% CO2、37 ℃培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)1、2、3、4、5 d后，按20 μl/孔加入CCK-8溶液，2 h后在振蕩器上振蕩15 min，用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm的吸光度，以時(shí)間(d)為橫坐標(biāo)，吸光度值(OD)為縱坐標(biāo)，繪制出各組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

表1 各基因qRT-PCR引物一覽表

1.5 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力將各組細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞匯聚度達(dá)到100%后，用滅菌槍頭在單層細(xì)胞層上用力劃線，劃痕后0 h和48 h分別在顯微鏡下觀察細(xì)胞劃痕的恢復(fù)情況并拍照。用圖像分析軟件分析細(xì)胞劃痕寬度并計(jì)算劃痕愈合率。劃痕愈合率=(劃痕寬度0 h-劃痕寬度48 h)/劃痕寬度0 h×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.6 Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力各組細(xì)胞消化后吹打成單細(xì)胞懸液。細(xì)胞計(jì)數(shù)后，按5×104個(gè)/孔的密度接種到預(yù)先加入matrigel的transwell小室中，下室中加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，用棉簽擦去上室內(nèi)層細(xì)胞。小室下層細(xì)胞用無(wú)水甲醇固定15 min，結(jié)晶紫染色，每孔隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值，計(jì)算抑制率。

1.7 Western blot用Western blot及IP細(xì)胞裂解液將各組細(xì)胞裂解，提取細(xì)胞中總蛋白，使用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，用10% SDS-PAGE電泳，每孔泳道加入30 μg總蛋白，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜后，封閉液室溫封閉1 h，加入一抗(用一抗稀釋液1 ∶1 000稀釋)，4 ℃下孵育過(guò)夜，TBST洗膜3次，每次15 min。加入TBST 1 ∶2 000稀釋的二抗，室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次15 min。采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(enhanced chemiluminescence, ECL)進(jìn)行顯影檢測(cè)蛋白條帶，以β-actin蛋白作為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1 miR-637在胃癌細(xì)胞系中低表達(dá)用qRT-PCR檢測(cè)了正常胃黏膜上皮細(xì)胞系GES-1和胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS、SGC7901中miR-637的表達(dá)量。結(jié)果如圖1所示，與正常胃黏膜細(xì)胞GES-1相比，miR-637在胃癌細(xì)胞SGC7901和AGS中的表達(dá)量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=16.63,P<0.01;t=15.88,P<0.01)。

圖1 miR-637在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)與GES-1細(xì)胞比較：**P<0.01

2.2 miR-637抑制胃癌細(xì)胞增殖在胃癌細(xì)胞系SGC7901和AGS中轉(zhuǎn)入miR-637 mimics、inhibitor以及陰性對(duì)照miR-NC、IN-NC后，用qRT-PCR鑒定miR-637的相對(duì)表達(dá)量，以GAPDH為內(nèi)參。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染mimics的SGC7901和AGS細(xì)胞相對(duì)表達(dá)量均顯著高于陰性對(duì)照組miR-NC，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-21.96,P<0.01;t=-21.32,P<0.01)(圖2A)。轉(zhuǎn)染inhibitor的SGC7901和AGS細(xì)胞相對(duì)表達(dá)量均顯著低于陰性對(duì)照組IN-NC(圖2B)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.67,P<0.05；t=4.89,P<0.05)。PCR結(jié)果表明在細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)miR-637和降低miR-637表達(dá)量成功，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞系可以進(jìn)行后續(xù)功能研究。

用CCK-8試劑盒檢測(cè)miR-637 mimics和inhibitor對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果如圖3所示，在人胃癌細(xì)胞SGC7901、AGS中轉(zhuǎn)入mimics后，OD值低于轉(zhuǎn)入陰性對(duì)照(miR-NC)的細(xì)胞，表明細(xì)胞增殖水平降低，第3天之后兩組細(xì)胞的OD值差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖3A、3B)；而轉(zhuǎn)入inhibitor后，OD值高于轉(zhuǎn)入陰性對(duì)照(IN-NC)的細(xì)胞，表明細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)，第2天之后兩組細(xì)胞OD值差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖3C、3D)。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，miR-637作為抑癌基因抑制胃癌細(xì)胞的增殖。

圖2 細(xì)胞中miR-637過(guò)表達(dá)和抑制的驗(yàn)證

A：轉(zhuǎn)染miR-637 mimics和miR-NC后miR-637相對(duì)表達(dá)水平；與miR-NC組比較：**P<0.01；B：轉(zhuǎn)染miR-637 inhibitor和IN-NC后miR-637相對(duì)表達(dá)水平；與IN-NC組比較：#P<0.05

圖3 miR-637對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響

A、B：轉(zhuǎn)染miR-637 mimics和miR-NC后細(xì)胞生長(zhǎng)曲線；與miR-NC組比較：*P<0.05；C、D：轉(zhuǎn)染miR-637 inhibitor和IN-NC后細(xì)胞生長(zhǎng)曲線；與IN-NC組比較：#P<0.05

2.3 miR-637抑制胃癌細(xì)胞的遷移能力用劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了轉(zhuǎn)染miR-637 mimics和inhibitor對(duì)兩株胃癌細(xì)胞遷移能力的影響。SGC7901細(xì)胞轉(zhuǎn)入mimics后，劃痕愈合率為(33.3%±3.7%)，轉(zhuǎn)入陰性對(duì)照miR-NC為(60.4%±4.2%)；AGS細(xì)胞轉(zhuǎn)入mimics后，劃痕愈合率為(28.6%±3.4%)，轉(zhuǎn)入miR-NC為(55.3%±4.8%)(圖4A)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.84,P<0.01；t=7.86,P<0.01)。SGC7901細(xì)胞轉(zhuǎn)入inhibitor后，劃痕愈合率為(78.9%±7.5%)，轉(zhuǎn)入陰性對(duì)照IN-NC為(53.1%±6.7%)；AGS細(xì)胞轉(zhuǎn)入inhibitor后，劃痕愈合率為(89.4%±16.1%)，轉(zhuǎn)入IN-NC為(37.1%±3.7%)(圖4B)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-4.44,P<0.05；t=-5.48,P<0.05)。劃痕實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，轉(zhuǎn)入mimics抑制了細(xì)胞的遷移，而轉(zhuǎn)入inhibitor促進(jìn)了細(xì)胞的遷移，提示miR-637可以抑制胃癌細(xì)胞的遷移能力。

圖4 miR-637對(duì)胃癌細(xì)胞遷移能力的影響

A：轉(zhuǎn)染miR-637 mimics和miR-NC后細(xì)胞劃痕愈合情況；B：轉(zhuǎn)染miR-637 inhibitor和IN-NC后細(xì)胞劃痕愈合情況

2.4 miR-637抑制胃癌細(xì)胞的侵襲能力進(jìn)一步用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了miR-637 mimics和inhibitor對(duì)兩株胃癌細(xì)胞侵襲能力的影響。在顯微鏡200倍視野下對(duì)侵襲穿過(guò)小室的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。SGC-7901細(xì)胞轉(zhuǎn)入mimics后，穿過(guò)小室的細(xì)胞數(shù)為(35.1±4.8)個(gè)，轉(zhuǎn)入miR-NC為(27.3±1.4)個(gè)；AGS細(xì)胞轉(zhuǎn)入mimics的為(20.9±2.3)個(gè)，轉(zhuǎn)入miR-NC的為(14.1±2.0)個(gè)(圖5A)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.48,P<0.05；t=4.98,P<0.05)。SGC-7901細(xì)胞轉(zhuǎn)入inhibitor的為(32.6±3.0)個(gè)，轉(zhuǎn)入IN-NC的為(44.3±5.4)個(gè)；AGS細(xì)胞轉(zhuǎn)入inhibitor的為(15.7±2.3)個(gè)，轉(zhuǎn)入IN-NC的為(24.7±3.1)個(gè)(圖5B)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-3.28,P<0.05;t=-4.03,P<0.05)。Transwell實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，轉(zhuǎn)入mimics減少了侵襲的細(xì)胞數(shù)，而轉(zhuǎn)入inhibitor增加了侵襲的細(xì)胞數(shù)，提示miR-637可以降低胃癌細(xì)胞的侵襲能力。

2.5 miR-637抑制CDK6/cyclinD1/Rb信號(hào)傳導(dǎo)通路本研究采用qRT-PCR和Western blot兩種方法分別檢測(cè)了miR-637對(duì)CDK6 mRNA和蛋白表達(dá)量的影響，結(jié)果如圖6A、6B所示，與轉(zhuǎn)染miR-NC相比，轉(zhuǎn)染miR-637 mimics的SGC7901和AGS細(xì)胞中CDK6 mRNA表達(dá)量顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.32,P<0.05；t=5.08,P<0.05)。與轉(zhuǎn)染IN-NC相比，轉(zhuǎn)染miR-637 inhibitor的SGC7901和AGS細(xì)胞中CDK6 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-7.65,P<0.01；t=-6.18,P<0.05)。

圖5 miR-637對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲能力的影響 結(jié)晶紫染色×200

A：轉(zhuǎn)染miR-637 mimics和miR-NC后穿過(guò)transwell小室的細(xì)胞；B：轉(zhuǎn)染miR-637 inhibitor和IN-NC后穿過(guò)transwell小室的細(xì)胞

Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染mimics降低了SGC-7901和AGS細(xì)胞中CDK6的表達(dá)水平，而轉(zhuǎn)染inhibitor上調(diào)了CDK6的表達(dá)(圖6C)。進(jìn)一步用Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了miR-637 mimics和inhibitor對(duì)CDK6下游信號(hào)通路的影響。結(jié)果如圖6D所示，與miR-NC相比，轉(zhuǎn)染mimics能下調(diào)周期相關(guān)蛋白cyclin D1、轉(zhuǎn)錄因子E2F1的表達(dá)以及Rb的磷酸化水平，對(duì)Rb的表達(dá)水平?jīng)]有顯著影響。而轉(zhuǎn)染inhibitor能增加cyclin D1、E2F1的表達(dá)和Rb的磷酸化水平。上述結(jié)果表明，miR-637可以抑制CDK6/cyclinD1/Rb信號(hào)傳導(dǎo)通路。

圖6 miR-637對(duì)CDK6/cyclinD/Rb和E2F1信號(hào)通路的影響

A：轉(zhuǎn)染miR-637 mimics和miR-NC后CDK6 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平；與miR-NC組比較：*P<0.05；B：轉(zhuǎn)染miR-637 inhibitor和IN-NC后CDK6 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平；與IN-NC組比較：#P<0.05，##P<0.01；C、D：Western blot檢測(cè)CDK6和下游信號(hào)分子的變化情況；1：SGC7901 miR-NC組；2：SGC7901 mimics組；3：SGC7901 IN-NC組；4：SGC7901 inhibitor組；5：AGS miR-NC組；6：AGS mimics組；7：AGS IN-NC組；8：AGS inhibitor組

3 討論

胃癌是一種具有侵襲性的惡性腫瘤，轉(zhuǎn)移率高，導(dǎo)致胃癌患者5年生存期較低，僅30%～35%[9]。癌癥的發(fā)生發(fā)展是多種促癌和抑癌基因表達(dá)異常、信號(hào)傳導(dǎo)通路調(diào)控失常的綜合結(jié)果。因此，深入研究闡明胃癌發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵基因和信號(hào)分子，對(duì)于發(fā)現(xiàn)潛在治療靶點(diǎn)、開發(fā)早期診斷標(biāo)志物和靶向治療藥物都具有重要意義和應(yīng)用價(jià)值。miRNAs與靶基因mRNA的3′-UTR通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，調(diào)控靶基因的表達(dá)，從而促進(jìn)或者抑制腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移和對(duì)藥物的敏感性。研究證實(shí)，多種miRNA與胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力有密切關(guān)系，例如miR-23a/b通過(guò)調(diào)控PDCD4促進(jìn)了胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、抑制細(xì)胞凋亡[10]；miR-125a通過(guò)調(diào)控STAT3抑制胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲[11]；miR-362-5p在胃癌組織中表達(dá)量高于癌旁組織，并在體外促進(jìn)了胃癌細(xì)胞的增殖和遷移[12]，但miR-637與胃癌的關(guān)系尚未見報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常胃黏膜細(xì)胞相比，胃癌細(xì)胞系SGC7901和AGS中miR-637的表達(dá)量顯著降低。在胃癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-637 mimics可顯著抑制細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，而轉(zhuǎn)染inhibitor則促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，說(shuō)明miR-637是胃癌發(fā)生發(fā)展的抑制因子。

CDK6是重要的細(xì)胞周期調(diào)控因子。CDK6與細(xì)胞周期蛋白cyclin D1形成復(fù)合體而激活，激活后的復(fù)合體通過(guò)磷酸化下游腫瘤抑制因子Rb導(dǎo)致其失活，同時(shí)上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子E2F1的表達(dá)，今后推動(dòng)細(xì)胞周期的轉(zhuǎn)換，促進(jìn)細(xì)胞增殖[13]。CDK6的過(guò)表達(dá)與非小細(xì)胞型肺癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤密切相關(guān)，已成為抗腫瘤藥物的作用靶點(diǎn)[14]。

有文獻(xiàn)[15]報(bào)道，在慢性阻塞性肺病中，缺氧導(dǎo)致miR-637下調(diào)，從而增加下游靶基因CDK6在肺部平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)，導(dǎo)致肺動(dòng)脈高壓，表明miR-637可以調(diào)控CDK6的表達(dá)。因此，在本研究中檢測(cè)了胃癌細(xì)胞過(guò)表達(dá)和沉默miR-637時(shí)CDK6 mRNA和蛋白水平的變化情況。結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)miR-637可顯著下調(diào)CDK6的表達(dá)，同時(shí)降低cyclin D1、轉(zhuǎn)錄因子E2F1的表達(dá)，抑制Rb的磷酸化，從而抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。