張 濤，張濤濤，吳旺宇，耿 浩，劉 杰，王 弦，萬 陽，張志華，馬嘉興，方 露，錢偉偉，李恩來，張志輝，于德新

腎癌是泌尿系統(tǒng)常見的惡性程度較高的腫瘤，發(fā)病原因復(fù)雜多樣[1]。吸煙是腎癌最為明確的危險因素，不僅可以增加腎癌的發(fā)生率，而且會影響腫瘤的分期[2]。高強(qiáng)度、長時間的吸煙會增加罹患進(jìn)展期腎癌的可能性，并對患者預(yù)后產(chǎn)生不利影響[3]，但目前具體分子機(jī)制尚不明確。本研究主要探討吸煙對于腎臟透明細(xì)胞癌患者的腫瘤細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)的誘導(dǎo)作用，嘗試從EMT的角度揭示吸煙促進(jìn)腎癌發(fā)展演變的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 病例資料本研究經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。選取了2017年12月～2019年2月于安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院確診并于泌尿外科行手術(shù)治療的腎透明細(xì)胞癌患者60例，吸煙患者(吸煙組)和非吸煙患者(非吸煙組)各30例。所有患者手術(shù)前沒有進(jìn)行新輔助靶向治療或介入治療，術(shù)前仔細(xì)詢問患者的吸煙狀態(tài)，如為吸煙患者，則需記錄吸煙時間、吸煙量、是否戒煙和戒煙時間，并且規(guī)定戒煙<1年的患者歸入未戒煙組。手術(shù)標(biāo)本離體后，立即留取癌組織和部分正常腎組織，送-80 ℃ 冰箱凍存。

1.2 主要試劑鼠抗E-cadherin、鼠抗N-cadherin和兔抗vimentin抗體工作液、DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋公司；蛋白免疫印跡試驗(yàn)所用抗E-cadherin、抗N-cadherin、抗vimentin、抗3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)抗體購自美國Proteintech公司，稀釋比列1 ∶1 500；抗兔二抗購自南京巴傲德生物公司，稀釋比例1 ∶10 000。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1免疫組織化學(xué)染色(immunohistochemistry，IHC) 選取60例患者的蠟塊，切片，常規(guī)方法脫臘、水化、抗原修復(fù)、滴加過氧化氫，放置室溫10 min，PBS沖洗, 滴加適量EMT標(biāo)志性蛋白抗體試劑,37 ℃下孵育60 min, 沖洗去抗體, 滴加合適劑量的二抗，置于室溫20 min，沖洗去二抗，加入DAB顯色液染色，觀察染色程度，至合適深度后迅速用蒸餾水沖洗，結(jié)束染色，最后蘇木精復(fù)染后封片。切片染色結(jié)果由兩位高年資病理科醫(yī)師分別進(jìn)行判讀，當(dāng)判讀結(jié)果不一致時，則請第三位病理科醫(yī)師進(jìn)行判讀并做最終的判定。染色評估使用半定量計(jì)數(shù)法[4]:光鏡100倍下判斷組織染色強(qiáng)度(0：無染色；1：低等強(qiáng)度染色；2：中等強(qiáng)度染色；3：強(qiáng)染色)，然后在400倍下判斷染色范圍(0：<5%；1：5%～25%；2：26%～75%；3：>75%)。 把強(qiáng)度得分和范圍得分相加得出最終免疫組化評分(0～6分)。

1.3.2蛋白免疫印跡試驗(yàn)(Western blot) 腎癌組織在RIPA緩沖液中置于組織研磨儀上裂解，BCA法測定總蛋白濃度。質(zhì)量相等的蛋白提取物經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳然后轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜上進(jìn)行蛋白印記分析。其中以GAPDH作為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1 患者人口學(xué)資料共收集60例患者人口學(xué)資料，其中吸煙組和非吸煙組各30例。根據(jù)美國癌癥聯(lián)合會(American joint committee on cancer,AJCC)2010年腎癌分期標(biāo)準(zhǔn)，對腫瘤進(jìn)行分期為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期。根據(jù)患者病理結(jié)果對腫瘤進(jìn)行分級，將Fuhrman和WHO/ISUP分級的1、2級統(tǒng)一為高分化，兩者分級的3級統(tǒng)一為中分化， 兩者分級的4級統(tǒng)一為低分化。吸煙組患者的腫瘤最大徑大于非吸煙組，且吸煙組腫瘤分期中Ⅳ期患者和腫瘤低分化患者都較非吸煙組多，吸煙組腫瘤分期的I期患者和腫瘤高分化患者都較非吸煙組少，但腫瘤分期和腫瘤分化的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。患者吸煙情況見表2。

2.2 E-cadherin、N-cadherin和vimentin在吸煙組和非吸煙組腎透明細(xì)胞癌組織中的表達(dá)水平比較在腫瘤組織中，Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，吸煙組較非吸煙組E-cadherin表達(dá)下降(P<0.05)，而vimentin表達(dá)升高(P<0.05)。吸煙組較非吸煙組N-cadherin表達(dá)有上調(diào)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖1。為了進(jìn)一步檢測E-cadherin、N-cadherin和vimentin在腎透明細(xì)胞癌組織中的表達(dá)，使用IHC方法檢測三種蛋白的表達(dá)情況，見圖2。觀察結(jié)果表明E-cadherin和N-cadherin染色于細(xì)胞膜著色較深，而vimentin于細(xì)胞質(zhì)中著色較深。E-cadherin在非吸煙組腎癌組織中高表達(dá)，在吸煙組腎癌組織中低表達(dá)；N-cadherin和vimentin在非吸煙組腎癌組織中低表達(dá)，在吸煙組腎癌組織中高表達(dá)。吸煙組和非吸煙組患者的E-cadherin的IHC評分比較，吸煙組表達(dá)下調(diào)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.06)。而吸煙組和非吸煙組患者N-cadherin的IHC評分表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。吸煙組和非吸煙組患者vimentin的IHC評分比較，吸煙組較非吸煙組表達(dá)升高(P<0.01)，見圖3。

表1 兩組腎癌患者人口學(xué)資料

注：*將Ⅲ期和Ⅳ期腎癌患者合并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；#將中分化和低分化腎癌患者合并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析

表2 兩組腎癌患者的吸煙情況

注：累計(jì)吸煙暴露(包-年)= 吸煙時間(年)×吸煙量(包/天)

圖1 Western blot方法檢測 非吸煙組和吸煙組腎透明細(xì)胞癌患者腫瘤組織 E-cadherin、N-cadherin和vimentin蛋白表達(dá)水平

A：Western blot檢測蛋白表達(dá)結(jié)果；B: E-cadherin、N-cadherin和vimentin蛋白相對表達(dá)量；與非吸煙組比較:*P<0.05

2.3 吸煙狀態(tài)與E-cadherin、N-cadherin及vimentin的Western blot檢測結(jié)果的關(guān)系吸煙組患者中，吸煙<20包-年與吸煙>20包-年患者分別為13例和17例，戒煙>10年和戒煙<10年者分別為9例和21例。與吸煙<20包-年組患者相比，吸煙>20包-年組患者腎透明細(xì)胞癌組織中vimentin表達(dá)升高(P<0.05)，然而E-cadherin以及N-cadherin表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與戒煙>10年組患者比較，戒煙<10年組患者腎癌組織中E-cadherin、N-cadherin 以及vimentin表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖4A、B。

2.4 吸煙狀態(tài)與E-cadherin、N-cadherin 和vimentin的IHC評分的關(guān)系與吸煙<20包-年組患者相比，吸煙>20包-年組的吸煙暴露時間較長的患者腎癌組織中vimentin的IHC評分升高(P<0.05)，而E-cadherin和N-cadherin的IHC評分差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與戒煙>10年組患者相比，戒煙<10年組的吸煙患者腎癌組織中E-cadherin、N-cadherin以及vimentin的IHC評分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖4C、D。

3 討論

腎癌的發(fā)病率逐年上升[1]，吸煙被認(rèn)為是其發(fā)生發(fā)展最重要的危險因素[5-6]。吸煙危害極大，煙草成分中含有多種致癌物，它們的燃燒產(chǎn)物可通過各種機(jī)制攻擊細(xì)胞，從而呈網(wǎng)絡(luò)狀激活各條腫瘤相關(guān)的信號通路，導(dǎo)致腫瘤快速發(fā)生發(fā)展的結(jié)局[7]。但現(xiàn)有研究中，吸煙促進(jìn)腎癌發(fā)展演變的研究多集中于流行病學(xué)領(lǐng)域。Kroeger et al[3]對802例腎癌患者隨訪長達(dá)232個月，隨后發(fā)現(xiàn)與不吸煙組比較，吸煙組腎癌患者具有相對更高的腫瘤分級，該組患者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險更大，更重要的是，研究顯示吸煙組患者的總生存時間和腫瘤特異性生存時間均較非吸煙組縮短，提示了吸煙對于腎癌可能存在的促進(jìn)效應(yīng)。雖有多位學(xué)者已經(jīng)探明吸煙與腎癌進(jìn)展存在關(guān)聯(lián)性，但吸煙促進(jìn)腎癌進(jìn)展的具體分子機(jī)制仍然沒有明確。

圖2 免疫組織化學(xué)方法檢測非吸煙組和吸煙組腎透明細(xì)胞癌患者腫瘤組織E-cadherin、N-cadherin和vimentin蛋白染色 ×400

圖3 免疫組織化學(xué)方法檢測 非吸煙組和吸煙組腎透明細(xì)胞癌患者腫瘤組織 E-cadherin、N-cadherin和vimentin蛋白染色評分與非吸煙組比較：**P<0.01

EMT是首先發(fā)現(xiàn)于胚胎生長中的獨(dú)特生理過程。后來有研究[8]顯示EMT表型變化與上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)變，獲得類似間質(zhì)細(xì)胞運(yùn)動和侵襲能力有關(guān)。有研究者在人正常膀胱上皮細(xì)胞和小鼠模型中均證實(shí)，上皮細(xì)胞發(fā)生EMT后會導(dǎo)致其細(xì)胞形態(tài)變化、增殖和侵襲能力顯著增強(qiáng)[9-11]。而蔡重陽 等[12]在人胰腺癌組織中研究發(fā)現(xiàn)，EMT與胰腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，胰腺癌組織中間質(zhì)標(biāo)志物表達(dá)升高，而上皮標(biāo)志物的表達(dá)下降，并且二種標(biāo)志物的表達(dá)水平與胰腺癌的分化程度、TNM 分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)等臨床病理參數(shù)密切相關(guān)。近期有研究報(bào)告提出，EMT與腫瘤的干細(xì)胞特性密切相關(guān)。Giordano et al[13]研究表明，EMT的誘導(dǎo)因子不僅誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞EMT的發(fā)生，還會使癌細(xì)胞的干細(xì)胞特性得以增強(qiáng)。EMT在腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著不可或缺的作用，調(diào)控EMT可能成為今后治療癌癥復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的新策略[14]。

在前期的體外細(xì)胞試驗(yàn)中，研究發(fā)現(xiàn)在人腎癌細(xì)胞系A(chǔ)CHN和A498中，香煙懸液可以誘導(dǎo)腎癌細(xì)胞發(fā)生EMT，使腎癌細(xì)胞的形態(tài)、侵襲能力和EMT標(biāo)志物的表達(dá)情況都發(fā)生了轉(zhuǎn)變，而且發(fā)現(xiàn)ERK5可以通過調(diào)控下游轉(zhuǎn)錄因子c-jun和c-fos促進(jìn)腎癌細(xì)胞EMT進(jìn)程[15]。而在本研究中，發(fā)現(xiàn)吸煙組腎癌患者較非吸煙組患者的腫瘤直徑、腫瘤分期和腫瘤分級雖略有升高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。同時在Western blot和IHC檢測中均發(fā)現(xiàn)，吸煙組較非吸煙組患者EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)發(fā)生了變化，結(jié)合體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果，認(rèn)為吸煙可以誘導(dǎo)腎癌細(xì)胞發(fā)生EMT，而EMT在吸煙誘導(dǎo)腎癌進(jìn)展過程中可能發(fā)揮重要作用，但具體調(diào)控機(jī)制仍待進(jìn)一步研究。同時vimentin的表達(dá)與吸煙總暴露量有相關(guān)性，說明總的吸煙暴露量是腎癌細(xì)胞發(fā)生EMT的重要影響因素。研究還顯示吸煙患者中，戒煙>10年組患者和<10年組患者的EMT相關(guān)蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明吸煙對于腎癌組織發(fā)生EMT的誘導(dǎo)效應(yīng)是長期存在的，短期戒煙對于EMT的發(fā)生可能無影響，而長期戒煙對于腎癌EMT的影響，因病例數(shù)量有限，研究尚難以深入開展。

圖4 吸煙狀態(tài)與腎透明細(xì)胞癌患者腫瘤組織E-cadherin、N-cadherin和vimentin蛋白表達(dá)的關(guān)系與吸煙組比較：*P<0.05

本研究屬于單中心的回顧性研究，收集的臨床病例數(shù)量有限，未進(jìn)行長時間的患者隨訪，缺乏腫瘤特異性生存期及總生存期等隨訪數(shù)據(jù)，但本研究使吸煙與EMT的關(guān)系在臨床病例上得以呈現(xiàn)，并且初步的研究結(jié)果已經(jīng)揭示了吸煙對腎癌組織EMT的誘導(dǎo)作用，與前期的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)基本吻合。