程琢玉，嚴(yán)尚學(xué)，魏 偉

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種以滑膜增生、血管翳形成為特征的自身免疫性疾病。新生血管形成是RA發(fā)展過程中的早期事件[1]。新生血管為關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞提供營養(yǎng)和氧氣[2]，招募細(xì)胞炎癥因子，引起滑膜組織的增生，形成血管翳，致關(guān)節(jié)畸形。血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)是重要的促炎介質(zhì)，在RA過程中發(fā)揮著重要的作用[3]。Ang Ⅱ可以通過Ang Ⅱ-AT1R-ERK1/2信號通路加強(qiáng)佐劑性關(guān)節(jié)炎(CIA)大鼠血管損傷[4]。

新藥芍藥苷-6′-O-苯磺酰酯(代號CP-25)是芍藥苷的新型衍生物，具有良好的抗炎免疫調(diào)節(jié)活性。研究[5]表明，CP-25可以減輕CIA小鼠關(guān)節(jié)滑膜炎性細(xì)胞浸潤、滑膜增生以及滑膜炎癥，血管翳形成，提示CP-25可有效抑制大鼠新生血管形成。本實(shí)驗(yàn)擬以人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)為對象，觀察CP-25體外對其功能的影響及其相關(guān)作用機(jī)制，為進(jìn)一步了解RA的病理機(jī)制及發(fā)現(xiàn)新的作用靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器Ang Ⅱ、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、Matrigel基質(zhì)膠(美國Sigma公司)；8 μm Transwell小室(美國Corning公司)；兔來源抗人AngⅡ 1型受體(angiotensin Ⅱ type 1 receptor，AT1R)單克隆抗體(美國Abcam公司，批號：ab9391)；p-ERK1/2抗體(美國CST公司，批號：8544)；p-IκBα抗體(美國CST公司，批號：4025)；G蛋白偶聯(lián)受體激酶2 (G-protein-coupled receptor kinase 2，GRK2)抗體(美國CST公司，批號：3982S)；β-actin抗體(北京博奧森生物有限公司，批號：bs-0061R)；HUVEC由安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院朱華慶教授課題組惠贈；芍藥苷-6′-O-苯磺酰酯(代號CP-25)由安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所合成。

1.2 方法

1.2.1HUVEC的培養(yǎng) 鋪路石樣的HUVEC長至培養(yǎng)瓶的90%單層，此時傳代。傾棄培養(yǎng)基，用無菌的PBS溶液洗2～3次，加入1 ml消化液。在顯微鏡下觀察，待細(xì)胞變圓，倒去消化液并加入含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液終止反應(yīng)。用一次性吸管將細(xì)胞吹打下來，取一半細(xì)胞液傳至另一無菌培養(yǎng)瓶中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2CCK8法檢測細(xì)胞的增殖 課題組前期實(shí)驗(yàn)表明，TNF-α刺激HUVEC增殖的亞適濃度為5 ng/ml，作用最強(qiáng)在24 h；Ang Ⅱ(1×10-9、 1×10-8、 1×10-7、 1×10-6mol/L)刺激HUVEC均可使細(xì)胞數(shù)目顯著增高，最適濃度為10-7mol/L，作用最強(qiáng)在24 h。TNF-α(5 ng/ml)和Ang Ⅱ(1×10-7mol/L)聯(lián)合使用可促進(jìn)HUVEC增殖功能[6]。HUVEC消化后，以1.5×104細(xì)胞/孔種到96孔板中。分別設(shè)對照組、TNF-α+Ang Ⅱ組、TNF-α+Ang Ⅱ+CP-25(1×10-7、1×10-6、1×10-5mol/L)組作用24 h，終止培養(yǎng)前每孔加入10 μl CCK8試劑室溫下震蕩30 s混勻后繼續(xù)培養(yǎng)1～3 h。肉眼觀察細(xì)胞孔中顏色由黃色變成深橙色，于酶標(biāo)儀中讀取波長450 nm處的吸光度值(A)，結(jié)果以3個復(fù)孔的均值表示。

1.2.3transwell小室法檢測細(xì)胞的遷移 預(yù)先用對照組、TNF-α+Ang Ⅱ、TNF-α+Ang Ⅱ+CP-25(1×10-7、1×10-6、 1×10-5mol/L) 處理24 h的HUVEC，用胰酶消化后制備成1×105/ml的細(xì)胞懸液，取100 μl加入無菌的8 μm的transwell小室上室，下室加入含20% FBS的培養(yǎng)液，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。第2天取出小室，用棉簽輕輕擦去內(nèi)面未遷移的細(xì)胞，下室已遷移的細(xì)胞用20%甲醇配制的結(jié)晶紫室溫下染色10 min。顯微鏡檢遷移細(xì)胞數(shù)，4倍鏡視野統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)目。

1.2.4HUVEC的成管實(shí)驗(yàn) Matrigel基質(zhì)膠溶解后4 ℃環(huán)境下取55 μl包被于96孔板中，室溫平衡30 min，37 ℃凝膠60 min。預(yù)先對照組、TNF-α+Ang Ⅱ、TNF-α+Ang Ⅱ+CP-25(1×10-7、 1×10-6、 1×10-5mol/L)處理24 h的HUVEC，胰酶消化，用2% FBS的DMEM培養(yǎng)液制備細(xì)胞懸液。以1×104個細(xì)胞/孔的密度種到Matrigel膠上，將96孔板置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育6 h后每隔2 h在顯微鏡下觀察細(xì)胞的成管狀況并拍照。4倍顯微鏡下統(tǒng)計(jì)成管數(shù)目。

1.3 Western blot檢測HUVEC相關(guān)蛋白的表達(dá)HUVEC加入6孔板中培養(yǎng)至90%時，分別加入TNF-α+Ang Ⅱ、TNF-α+Ang Ⅱ+CP-25(1×10-7、 1×10-6、 1×10-5mol/L)培養(yǎng)24 h。棄去培養(yǎng)液后加入100 μl裂解液于冰上裂解30 min后，收集蛋白，預(yù)處理后，每孔30 μg蛋白加入10% SDS-PAGE凝膠電泳孔中電泳、轉(zhuǎn)膜。室溫封閉后，加入抗AT1R抗體、抗GRK2抗體、抗p-ERK抗體、抗p-IκBα抗體或β-actin抗體4 ℃過夜。辣根過氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗室溫孵育2 h后。采用凝膠成像系統(tǒng)掃描結(jié)果后，Image J軟件分析以目的蛋白條帶在相同面積下的灰度值為有效值，反映蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 CP-25對Ang Ⅱ和TNF-α聯(lián)合誘導(dǎo)的HUVEC增殖功能的影響與對照組(1.06±0.10)相比,Ang Ⅱ+TNF-α組給藥作用于HUVEC 24 h后，可以促進(jìn)HUVEC增殖功能(1.50±0.11)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=6.74，P<0.05)。與Ang Ⅱ(1×10-7mol/L)+TNF-α(5 ng/ml)組相比，TNF-α+Ang Ⅱ+CP-25(1×10-7、1×10-6、1×10-5mol/L)組作用24 h，細(xì)胞增殖反應(yīng)無明顯影響(P>0.05)。見圖1。

圖1 CP-25對Ang Ⅱ和TNF-α誘導(dǎo)的HUVEC增殖的影響

A：正常組；B：Ang Ⅱ+TNF-α組；C：Ang Ⅱ+TNF-α+CP-25(1×10-7mol/L)組；D：Ang Ⅱ+TNF-α+CP-25(1×10-6mol/L)組；E：Ang Ⅱ+TNF-α+CP-25(1×10-5mol/L)組；與正常組比較:*P<0.05

2.2 CP-25對Ang Ⅱ和TNF-α 聯(lián)合誘導(dǎo)的HUVEC遷移功能的影響與正常組比較(67.36±32.15)，Ang Ⅱ+TNF-α組給藥作用于HUVEC 24 h后，可以促進(jìn)HUVEC遷移功能(190.00±11.50)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=34.06，P<0.01)；與Ang Ⅱ+TNF-α組比較，TNF-α+Ang Ⅱ+CP-25(1×10-7、1×10-6、1×10-5mol/L)組給藥作用24 h可抑制其誘導(dǎo)的HUVEC的遷移能力，與Ang Ⅱ+TNF-α組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且不同濃度間的CP-25的抑制遷移作用沒有顯著性差異(P>0.05)。見圖2。

2.3 CP-25對Ang Ⅱ和TNF-α 聯(lián)合誘導(dǎo)的HUVEC成管功能的影響與正常組比較，Ang Ⅱ+TNF-α組給藥作用于HUVEC 24 h后，可以促進(jìn)HUVEC成管功能(367.90±48.19)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=31.24，P<0.01)；與Ang Ⅱ+TNF-α組比較，TNF-α+Ang Ⅱ+CP-25(1×10-7、1×10-6、1×10-5mol/L)組給藥作用24 h可抑制其誘導(dǎo)的HUVEC的成管能力(P<0.05，P<0.01)，TNF-α+Ang Ⅱ+CP-25(1×10-6mol/L)抑制成管作用最強(qiáng)(P<0.01)。見圖3。

2.4 CP-25對Ang Ⅱ和TNF-α 聯(lián)合誘導(dǎo)的HUVEC相關(guān)信號蛋白表達(dá)的影響與Ang Ⅱ+TNF-α組比較，TNF-α+Ang Ⅱ+CP-25(1×10-7、1×10-6、1×10-5mol/L)組給藥可以降低AT1R蛋白(F=4.11，P<0.05，P<0.01)、GRK2蛋白(F=14.00，P<0.05，P<0.01)表達(dá)水平。TNF-α+Ang Ⅱ+CP-25(1×10-7、1×10-6mol/L)組給藥明顯降低HUVEC內(nèi)Ang Ⅱ+TNF-α組給藥誘導(dǎo)活化的p-ERK1/2蛋白(F=13.53，P<0.05，P<0.01)的表達(dá)水平，而TNF-α+Ang Ⅱ+CP-25(1×10-6、1×10-5mol/L)組給藥降低HUVEC內(nèi)Ang Ⅱ+TNF-α組給藥誘導(dǎo)活化的p-IκBα蛋白(F=8.61，P<0.05，P<0.01)的表達(dá)水平，見圖4。

圖2 CP-25 對Ang Ⅱ和TNF-α誘導(dǎo)的HUVEC遷移的影響×40

A：正常組；B：Ang Ⅱ+TNF-α組；C：Ang Ⅱ+TNF-α+CP-25(1×10-7mol/L)組；D：Ang Ⅱ+TNF-α+CP-25(1×10-6mol/L)組；E：Ang Ⅱ+TNF-α+CP-25(1×10-5mol/L)組；與正常組比較：**P<0.01；與Ang Ⅱ+TNF-α組比較：#P<0.05

圖3 CP-25 對Ang Ⅱ和TNF-α誘導(dǎo)的HUVEC成管的影響×40

A：正常組；B：Ang Ⅱ+TNF-α組；C：Ang Ⅱ+TNF-α+CP-25(1×10-7mol/L)組；D：Ang Ⅱ+TNF-α+CP-25(1×10-6mol/L)組；E：Ang Ⅱ+TNF-α+CP-25(1×10-5mol/L)組；與正常組比較：**P<0.01；與Ang Ⅱ+TNF-α組比較：#P<0.05,##P<0.01

圖4 CP-25對Ang Ⅱ與TNF-α聯(lián)合刺激的HUVEC細(xì)胞 AT1R、GRK2、p-ERK、p-IκBα表達(dá)的影響

A：Ang Ⅱ+TNF-α組；B：Ang Ⅱ+TNF-α+CP-25(1×10-7mol/L)組；C：Ang Ⅱ+TNF-α+CP-25(1×10-6mol/L)組；D：Ang Ⅱ+TNF-α+CP-25(1×10-5mol/L)組；與Ang Ⅱ+TNF-α組比較：▼P<0.05,▼▼P<0.01

3 討論

新生血管生成是由原有的血管形成新的毛細(xì)血管，隨著對氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)需求的增加，它在缺血/缺氧組織中更為常見。生理性血管生成在胚胎發(fā)育、創(chuàng)面愈合等過程中起著不可缺少的作用，但是不受控制的病理性血管生成在RA滑膜炎中發(fā)揮了重要作用。在炎癥早期階段，RA患者關(guān)節(jié)滑膜內(nèi)分泌大量TNF-α、前列腺素E、IL-1等促血管因子，激活內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)其增殖遷移，形成新生微血管[7]。這些新血管為肥厚關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞提供營養(yǎng)和氧氣[2]，并招募細(xì)胞因子和炎癥因子浸潤滑膜，引起滑膜組織的增生，這種惡性循環(huán)最終形成血管翳，引起滑膜炎癥以及骨和軟骨的破壞，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形及功能障礙。在RA血管生成和血管翳形成過程中，血管內(nèi)襯的血管內(nèi)皮細(xì)胞是各種細(xì)胞因子發(fā)揮作用的重要靶點(diǎn)，例如血管生成介質(zhì)、生長因子、滲透因子、基質(zhì)降解酶等作用因子[8]。這些因子作用于內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致內(nèi)皮基底膜和滑膜細(xì)胞外基質(zhì)的降解，最終促進(jìn)血管翳的形成[9]。由于滑膜血管翳內(nèi)的內(nèi)皮細(xì)胞難以分離出來作為研究對象，本實(shí)驗(yàn)選取HUVEC作為替代研究對象，觀察了CP-25對其增殖、遷移以及體外成管的作用。研究[10-11]表明，Ang Ⅱ及TNF-α都參與了RA疾病的病理進(jìn)程。而且在課題組前期預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Ang Ⅱ刺激HUVEC增殖的最適濃度是10-7mol/L，TNF-α刺激HUVEC增殖的適宜濃度是5 ng/ml。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)Ang Ⅱ(10-7mol /L)和TNF-α(5 ng/ml) 聯(lián)合刺激后HUVEC的增殖、遷移與成管能力顯著增強(qiáng)，CP-25(1×10-7、 1×10-6、 1×10-5mol/L)體外給藥可明顯抑制TNF-α和Ang Ⅱ聯(lián)合誘導(dǎo)的HUVEC遷移與成管反應(yīng)，但對其增殖作用無顯著影響。

白芍總苷(total glucosides of paeony, TGP)是臨床治療RA的主要藥物，以其主要生物活性成分芍藥苷結(jié)構(gòu)修飾改造合成的新藥芍藥苷-6′-O-苯磺酰酯(代號CP-25)具有良好的抗炎免疫調(diào)節(jié)活性。研究表明，CP-25可以減輕CIA小鼠關(guān)節(jié)滑膜炎性細(xì)胞浸潤、滑膜增生以及滑膜炎癥，抑制淋巴細(xì)胞活化，下調(diào)白介素2(IL-2)和白介素17(IL-17)的水平，改善脾臟病理變化[5]；CP-25還可抑制人的活化B細(xì)胞的功能[12]，通過調(diào)節(jié)炎癥和骨損傷的免疫介質(zhì)來預(yù)防自身免疫性關(guān)節(jié)炎[13]。

由于ERK信號通路通過激活細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子水平與細(xì)胞增殖、遷移緊密相關(guān)，因此檢測AngⅡ和TNF-α聯(lián)合使用以及CP-25 (1×10-7、1×10-6、1×10-5mol/L)對HUVEC p-ERK、p-IκBα 等蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，與Ang Ⅱ和TNF-α聯(lián)合給藥組相比，CP-25(1×10-7、 1×10-6、 1×10-5mol/L)體外給藥可顯著降低HUVEC的GRK2蛋白表達(dá)水平，明顯降低AT1R、p-ERK和p-Ikβα的蛋白表達(dá)。AT1R為G蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)，可被G蛋白偶聯(lián)受體激酶2(GRK 2)調(diào)控。GRK 2屬于絲/蘇氨酸蛋白激酶家族(GRKs)成員，可以磷酸化受體蛋白，參與受體的內(nèi)吞和脫敏過程。它的異常表達(dá)與多種炎癥疾病有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)提示CP-25可能通過減弱GRK 2的表達(dá)從而調(diào)控ERK1/2-NF-κB來抑制RA的發(fā)生。