(1.湘潭市第一人民醫(yī)院病理科，湖南 湘潭 411010；2.湖南環(huán)境生物職業(yè)技術學院,湖南 衡陽 421001)

我國肝癌發(fā)病率排第4位，死亡率排第3，每年的新增病例約36.6萬，死亡病例大約32.1萬[1]。最常見肝癌的組織類型是肝細胞癌，大約占原發(fā)性肝癌的90%[2]。目前治愈肝細胞癌的主要挑戰(zhàn)是肝細胞癌易轉移，且分子機制尚未完全明確[3]。

研究發(fā)現(xiàn)上皮生長因子受體(EGFR)可以促進肝癌細胞(Huh-7細胞)的遷移、侵襲。課題組前期研究在Huh-7細胞中發(fā)現(xiàn)上皮生長因子受體突變體Ⅲ(EGFRvⅢ)。將EGFR和EGFRvⅢ分別轉染至Huh-7細胞中，構建了轉染上皮生長因子受體的人肝癌細胞(Huh-7-EGFR細胞)與轉染上皮生長因子受體突變體Ⅲ的人肝癌細胞(Huh-7-EGFRvⅢ細胞)。研究證明Huh-7-EGFR細胞的遷移、侵襲的能力強于Huh-7細胞；而 Huh-7-EGFRvⅢ細胞的遷移、侵襲的能力強于Huh-7-EGFR細胞[4]；從而證實EGFR vⅢ促進肝癌細胞的遷移、侵襲的能力強于EGFR。

在運用比較蛋白質組學方法對比分析Huh-7-EGFR細胞與Huh-7-EGFRvⅢ細胞這兩種細胞的差異表達蛋白中，發(fā)現(xiàn)絲切蛋白1(Cofilin-1)在Huh-7-EGFRvⅢ細胞中的表達顯著高于在Huh-7-EGFR細胞中的表達[5]。因Huh-7-EGFRvⅢ細胞的遷移、侵襲能力強于Huh-7細胞和Huh-7-EGFR細胞，并且Huh-7-EGFRvⅢ細胞中的Cofilin-1表達顯著高于Huh-7-EGFR細胞和Huh-7細胞，所以推測Cofilin-1與肝癌細胞的遷移與侵襲能力可能有關。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)

293T細胞購自中國科學院上海生化細胞所，其來源是轉染腺病毒E1A基因用生化的人腎上皮細胞(293細胞)；Huh-7細胞是人肝癌細胞；本實驗室前期構建Huh-7-EGFR，Huh-7-EGFRvⅢ細胞。用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞，放置于37 ℃，含5%CO2的培養(yǎng)箱中。待細胞生長密度80%～90%時，進行蛋白樣品提取后存于-80 ℃待用。

1.2 免疫印跡試驗(Western-blot)

用BCA測定試劑盒(Pierce 公司)測提取好的蛋白的蛋白濃度，并按說明書繪制標準曲線。剩余蛋白加入總體積1/5的5×SDS凝膠上樣緩沖液混勻后，放置于100 ℃沸水中，5 min使蛋白變性。按標準曲線公式計算蛋白含量，明確上樣蛋白量。用12%的SDS-PAGE分離膠，5%的濃縮膠，電泳，并將其轉移至PVDF膜上，然后用PBST配制5%脫脂奶粉，室溫封閉2 h。孵育一抗并于4 ℃過夜。PVDF膜用0.5%PBST洗3次，10 min/次。再在室溫下孵育二抗1 h。重復洗膜3次，10 min/次。最后ECL化學發(fā)光檢測并顯影。

1.3 構建過表達Cofilin-1的Huh-7細胞系

慢病毒表達載體質粒構建方法見本課題組前期研究[6]，構建的質粒送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測序并鑒定。

1.4 沉默Huh-7-EGFRvⅢ細胞中的Cofilin-1

1.4.1 干擾小RNA工作母液的配制及重退火 加入125 μL 1×通用緩沖液于2.5 nmol的雙鏈siRNA中，得到濃度為20 μmol的siRNA母液，將工作母液放于90 ℃，2 min，待自然冷卻至室溫后于4 ℃過夜備用。

1.4.2 干擾小RNA的轉染 在轉染的前一天，于無菌6孔培養(yǎng)板中將細胞傳代，培養(yǎng)24 h，直至細胞融合率達40%～50%。每個孔取一無菌的eppendoff管將6 μL 20 μmol的siRNA雙鏈與100 μL無血清DMEM混合。取搖勻后的LipofectamineTM2000 (1 μg/μL)3 μL 置于另一無菌eppendorf管中與100 μL無血清DMEM混合，室溫孵育5 min?；旌蟽晒芤后w，室溫靜置20 min形成siRNA．Lipofectamine 復合物。棄去細胞培養(yǎng)舊液，加1 mL含10%FCS的DMEM，再加入已配制的轉染混合物200 μL，轉染終濃度為100 nmol/L。于37 ℃，5%CO2的細胞孵箱中孵育轉染48 h后，收集細胞進行細胞生物學功能實驗的檢測。

1.5 體外細胞遷移和侵襲實驗

細胞遷移實驗：取對數(shù)生長期細胞，用含0.1%BSA的無血清培養(yǎng)基將細胞制成5×105個/mL的懸液。將Transwell小室放入在每孔加入500 μL含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基的24孔培養(yǎng)板中。每個小室內(nèi)加細胞懸液200 μL后，蓋好培養(yǎng)板，置于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中孵育。8 h后取出Transwell小室，吸走小室內(nèi)液體，加500 μL 4%多聚甲醛室溫固定，1 h后去除小室內(nèi)液體，并用0.1%結晶紫染色30 min。在倒置顯微鏡下觀察細胞數(shù)，并在高倍鏡下隨機取5個視野，拍照，計數(shù)穿膜細胞數(shù)并取平均值。穿膜細胞數(shù)的相對數(shù)代表遷移力。細胞侵襲實驗：將存放于-20 ℃冰箱的BD Matrigel于4 ℃ 過夜融解，將液態(tài)的Matrigel用4 ℃無血清培養(yǎng)基稀釋(稀釋比例為1∶8)。將Transwell小室放入24孔培養(yǎng)板中，均勻鋪好100 μL稀釋后的Matrigel后，置于含5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中孵育4 h，形成均勻薄層凝膠后，用無血清DMEM培養(yǎng)基清洗凝膠2遍，在Transwell小室內(nèi)加入密度為2.5×106個/mL 的細胞懸液200 μL，蓋好培養(yǎng)板并放入含5%CO2的37 ℃ 培養(yǎng)箱中孵育14 h。余下的實驗方法同遷移實驗。

1.6 統(tǒng)計學處理

實驗均重復三次，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，運用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件采用成組設計的兩樣本均數(shù)比較(兩樣本t檢驗)，P<0.05為差異有顯著性。

2 結 果

2.1 Cofilin-1在Huh-7和Huh-7-EGFR 和Huh-7-EGFRvⅢ三種細胞中的表達

通過Western-blot方法檢測Cofilin-1在Huh-7、Huh-7-EGFR 和 Huh-7-EGFRvⅢ中的表達情況，通過灰度值進行半定量分析，結果如圖1所示：Cofilin-1在Huh-7-EGFRvⅢ細胞中的表達水平明顯高于Huh-7和Huh-7-EGFR細胞(P<0.05)。

圖1 Coflin-1蛋白表達A：Western-blot方法檢測Cofilin-1；B：灰度值對比的百分值的統(tǒng)計圖與Huh-7和Huh-7-EGFR比較，*P<0.05

2.2 構建轉染絲切蛋白1的人肝癌細胞(Huh-7-Cofilin-1細胞)

通過實時定量PCR(RT-PCR)擴增Cofilin-1后，得到Cofilin-1 的編碼序列531 bp，如圖2A所示。鑒定pWPT-Cofilin-1與慢病毒載體質粒(pWPT-GFP)酶切，結果顯示其大小，位置正確，如圖2B所示。測序的結果和GenBank中的標準序列進行 Blast 比對，顯示一致，測序結果見圖2C。慢病毒包裝系統(tǒng)共轉染293T細胞48 h后，用熒光顯微鏡觀察，顯示慢病毒包裝成功(可見明顯綠色熒光,共轉染細胞已停止生長)。Huh-7細胞感染慢病毒48 h后，GFP陽性率大于95%，結果如圖2D。為了進一步驗證轉染Cofilin-1后Huh-7細胞(Huh-7-Cofilin-1細胞)構建是否成功，通過RT-qPCR方法檢測Huh-7-Cofilin-1細胞中Cofilin-1mRNA的表達情況，結果顯示Cofilin-1在Huh-7-Cofilin-1細胞中的mRNA水平明顯高于加入空轉染試劑的Huh-7細胞(Huh-7-GFP細胞，陰性對照組)和未加任何試劑的Huh-7細胞(空白對照組)，見圖2E。WB結果與RT-qPCR的結果顯示一致，見圖2F。

圖2 構建過表達Cofilin-1的Huh-7細胞系結果圖A：經(jīng)RT-PCR擴增后，Cofilin-1的產(chǎn)物電泳圖，編碼序列為531bp；B：pWPT-Cofilin-1和pWPT-GFP酶切之后的電泳圖；C：測序結果圖；D：慢病毒包裝和感染后的細胞的顯微鏡和熒光顯微鏡展示圖；E：RT-qPCR檢測Cofilin-1mRNA在Huh-7-Cofilin-1細胞中的表達情況；F：WB驗證Cofilin-1蛋白在Huh-7-Cofilin-1細胞中的表達情況 ；G：為F圖的統(tǒng)計圖.與Huh-7和Huh-7-EGFR比較，*P<0.05

2.3 轉染Cofilin-1后，Huh-7-Cofilin-1細胞的遷移、侵襲能力檢測

運用Transwell/Matrigel實驗分別檢測轉染Cofilin-1后Huh-7細胞(即Huh-7-Cofilin-1細胞)、加入空轉染試劑的Huh-7細胞(Huh-7-GFP細胞，陰性對照組)和未加任何試劑的Huh-7細胞(空白對照組)的遷移、侵襲能力。結果如圖3A，3B所示：Huh-7-Cofilin-1細胞的侵襲能力強于Huh-7-GFP細胞(P=0.001)和Huh-7細胞(P=0.003)，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，空白對照組與陰性對照組之間無差異(P=0.437)；Huh-7-Cofilin-1細胞的遷移能力強于Huh-7-GFP細胞(P=0.004)和Huh-7細胞(P=0.004)，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，空白對照組與陰性對照組之間差異無顯著性(P=0.682)。

圖3 Huh-7-Cofilin-1遷移、侵襲能力檢測結果圖A：Huh-7、Huh-7-GFP、Huh-7-Cofilin-1細胞在顯微鏡下的觀察結果圖，染成紫色的穿膜細胞數(shù)的相對數(shù)代表遷移力;B：為A圖的統(tǒng)計圖與Huh-7和Huh-7-GFP比較，*P<0.05

2.4 沉默Huh-7-EGFRvⅢ細胞中的Cofilin-1

干擾6 h后，觀察FAM熒光圖，效果達90%以上，見圖4A。沉默Cofilin-1的Huh-7-EGFRvⅢ細胞(siCofilin-1Huh-7-EGFRvⅢ)中Cofilin-1的mRNA量顯著低于陰性對照組(加入無干擾小RNA轉染液的Huh-7-EGFRvⅢ細胞)(P<0.05)和空白組(未加任何試劑的Huh-7-EGFRvⅢ細胞)(P<0.05)；而陰性對照組與空白組Huh-7-EGFRvⅢ細胞中 Cofilin-1的mRNA量無明顯差異，見圖4B：siCofilin-1Huh-7-EGFRvⅢ中Cofilin-1的蛋白量顯著低于陰性對照組(P<0.05)和空白組(P<0.05),而陰性對照組與空白組Huh-7-EGFRvⅢ細胞中 Cofilin-1的蛋白量無明顯差異，見圖4C。

圖4 干擾Huh-7-EGFRvⅢ細胞中的Cofilin-1的驗證A：進行干擾6 h后的FAM的熒光圖與白光圖的對照；B：通過Real-time quantitative PCR檢測siCofilin-1Huh-7-EGFRvⅢ中Cofilin-1的mRNA的表達.與NC和Huh-7-EGFRvⅢ比較，*P<0.05；C：Western-blot檢測siCofilin-1Huh-7-EGFRvⅢ中 Cofilin-1的蛋白的表達情況 ；D：為C圖的統(tǒng)計圖.與陰性對照組和Huh-7-EGFRvⅢ比較，*P<0.05

2.5 干擾Cofilin-1后Huh-7-EGFRvⅢ細胞的遷移與侵襲能力檢測

為了反向證實Cofilin-1可以促進肝癌細胞的遷移與侵襲，運用Transwell/Matrigel實驗檢測siCofilin-1 Huh-7-EGFRvⅢ細胞、陰性對照組(NC組)和空白對照組的遷移與侵襲能力，結果如圖5A，5B所示：siCofilin-1Huh-7-EGFRvⅢ組的細胞侵襲能力明顯低于陰性對照組(NC組)(P=0.011)和空白對照組(P=0.010)，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，空白對照組與陰性對照組之間無差異(P=0.396)；siCofilin-1Huh-7-EGFRvⅢ組的細胞遷移能力明顯低于陰性對照組(NC組)(P=0.000)和空白對照組(P= 0.000)，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，空白對照組與陰性對照組之間無差異(P=0.421)。

圖5 SiCofilin-1 Huh-7-EGFRvⅢ細胞的遷移與侵襲能力檢測結果圖A：鏡下觀察并拍攝的干擾Cofilin-1后Huh-7-EGFRvⅢ細胞遷移、侵襲能力與陰性對照組及空白組的對比圖，穿膜細胞數(shù)代表相對遷移、侵襲力；B：為A圖的統(tǒng)計圖.與陰性對照組和Huh-7-EGFRvⅢ比較，*P<0.05

3 討 論

Cofilin-1是一種細胞骨架蛋白，基因定位于11q13，分子量為19 kDa，屬于肌動蛋白解聚因子家族，可維持成熟的細胞結構。Cofilin-1可以結合和解聚F-actin，也可以抑制G-actin的聚合，還能增強肌動蛋白絲的轉換，進而對細胞運動起重要的調(diào)控作用。Cofilin-1在肺腺癌[7]，胰腺癌[8]，卵巢癌[9]，膀胱癌[10]，惡性黑色素瘤[11]，子宮內(nèi)膜癌[12]等組織中存在高表達，且與腫瘤細胞的生長，遷移侵襲及耐藥密切相關，下調(diào)Cofilin-1的表達水平可以抑制細胞增生，遷移，粘附以及克隆形成能力等[13]。在晚期的肺癌患者的血漿中，它被發(fā)現(xiàn)是一個很好的腫瘤生物標志物[7]。肺癌患者痰液中Cofilin-1水平顯著提高，可能成為肺癌診斷的潛在生物標志物[7]。cofilin-1作為轉化生長因子的效應器，它在癌癥惡化過程中提高了其遷移侵襲能力，與不同程度的惡性腫瘤細胞的遷移侵襲能力存在相關性。Cofilin-1被包含在各種人類惡性細胞中，并與惡性腫瘤的形成、遷移、侵襲、轉移和對化療藥物的耐藥性等方面有關聯(lián)[14]。

課題組前期研究，將EGFR和EGFRvⅢ分別轉染至Huh-7細胞中，構建了Huh-7-EGFR細胞與Huh-7-EGFRvⅢ細胞。研究證明Huh-7-EGFRⅢ細胞的遷移、侵襲的能力強于Huh-7細胞和Huh-7-EGFR細胞。本文結果顯示在遷移、侵襲能力較強的Huh-7-EGFRvⅢ細胞中Cofilin-1的表達顯著高于Huh-7和Huh-7-EGFR細胞中的表達，提示Cofilin-1與肝癌細胞的遷移和侵襲性能之間可能存在相關性。為了證實Cofilin-1與肝癌細胞的遷移和侵襲性能之間的關系，將Cofilin-1導入遷移和侵襲能力最弱的Huh-7細胞后，檢測到Huh-7-Cofilin-1的侵襲、遷移能力強于陰性對照組和空白對照組。因此從正面證明Cofilin-1可以增強肝癌細胞的遷移和侵襲能力。而沉默掉遷移和侵襲能力較強的Huh-7-EGFRvⅢ細胞中的Cofilin-1后，細胞的遷移，侵襲能力明顯減弱，進而從反面證實了Cofilin-1可以促肝癌細胞的遷移與侵襲。此研究為進一步研究肝癌細胞遷移、侵襲的分子機制提供新的標志物，但其Cofilin-1促肝癌細胞的遷移與侵襲的分子機制還有待研究。