楊瑞冬，李伯海，王元弛，董安利，孫浩天，張和平*

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部奶制品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

布氏乳桿菌（Lactobacillus buchneri）屬于異型發(fā)酵乳酸菌，形態(tài)為短桿狀，菌落呈圓形，革蘭氏染色呈陽(yáng)性，無(wú)芽孢，無(wú)運(yùn)動(dòng)性[1]。通過(guò)黏附、競(jìng)爭(zhēng)排斥、占位和產(chǎn)生抑制物等效應(yīng)自然棲息在各類生態(tài)位[2]，廣泛存在于乙醇生物生產(chǎn)廠、泡菜汁、人腸道和口腔、奶酪樣本、青貯飼料和變質(zhì)的發(fā)酵黃瓜中[3-7]。除擁有所有革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌典型的肽聚糖細(xì)胞壁，一些L. buchneri還具有額外的規(guī)則排列蛋白質(zhì)表面保護(hù)層（S層）[8]，S層蛋白能夠保護(hù)L. buchneri細(xì)胞免受噬菌體和化學(xué)物質(zhì)侵害的同時(shí)參與細(xì)胞黏附并決定細(xì)胞形狀[9]。

L. buchneri在許多食品與飼料發(fā)酵過(guò)程中起好壞參半的作用，既是腐敗菌，又是有益發(fā)酵劑。L. buchneri作為腐敗菌可導(dǎo)致發(fā)酵黃瓜變質(zhì)[7]；L. buchner具有降膽固醇、調(diào)節(jié)宿主腸道菌群、抑制腐敗菌等功能[10-13]；可降低奶牛子宮內(nèi)膜炎感染率改善奶牛生殖性能[14]；在酸面團(tuán)中生產(chǎn)丙酸鹽，延長(zhǎng)產(chǎn)品保質(zhì)期[15]；對(duì)乙醇具有高度耐受性，已被開(kāi)發(fā)用于乙醇生物生產(chǎn)廠[16]；L. buchneri常被用作青貯飼料接種劑，可顯著提高有氧穩(wěn)定性、降低干物質(zhì)損失率[17-20]。隨著菌株身份確立且未檢測(cè)出抗生素耐藥性，對(duì)喂食動(dòng)物及其消費(fèi)者和外界環(huán)境都安全，已基本被食品行業(yè)接受。

L. buchneriIMAU80233是由20 株不同分離源L. buchneri經(jīng)耐酸耐膽鹽、生長(zhǎng)特性實(shí)驗(yàn)篩選而得到的1 株具有潛在益生特性的菌株。本研究對(duì)L. buchneriIMAU80233培養(yǎng)基和培養(yǎng)工藝進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)菌體高密度培養(yǎng)，為規(guī)?；a(chǎn)提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

L. buchneriIMAU80233分離自四川省阿壩州諾爾蓋縣鮮牦牛奶，由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室乳酸菌菌種庫(kù)（LABCC）保藏，GenBank序列號(hào)HM058519。

所用試劑部分為分析純，其中高密度發(fā)酵研究部分采用工業(yè)級(jí)試劑，均由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物與技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 儀器與設(shè)備

5810R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)艾本德股份公司；EYELA WFO-700型干燥箱 東京理化器械株式會(huì)社；VS-1300L-U潔凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；U-2000型分光光度計(jì) 株式會(huì)社日立制作社；FE20型pH計(jì) 瑞士梅特勒-托利多集團(tuán)；DHP-9272型恒溫培養(yǎng)箱、HWS28型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SIM-F124制冰機(jī) 日本三洋電機(jī)株式會(huì)社；ADVANTEC SP-650型全自動(dòng)干熱滅菌器 廣州綠百草科學(xué)儀器有限公司；SX-500型高壓蒸汽滅菌鍋 日本TOMY生物儀器公司；5 L液體發(fā)酵罐GUJS-5及其附屬設(shè)備鎮(zhèn)江東方電熱科技有限公司；BX50型光學(xué)顯微鏡日本奧林巴斯株式會(huì)社；KDC-6000R低速冷凍離心機(jī)安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；LL-6SFPV型真空冷凍干燥機(jī) 美國(guó)Labconco公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

L. buchneriIMAU80233菌種冷凍保存于脫脂乳凍存管中（-80 ℃），每次實(shí)驗(yàn)前將菌種以體積分?jǐn)?shù)2%接種量接種于液體MRS培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，活化2 代。

1.3.2 培養(yǎng)基成分篩選

采用Bioscreen C全自動(dòng)生長(zhǎng)讀值系統(tǒng)對(duì)L. buchneriIMAU80233生長(zhǎng)最適碳氮源進(jìn)行快速篩選：以不同種類碳氮源分別替代MRS培養(yǎng)基碳源，保持培養(yǎng)基其余成分及比例不變配制新的培養(yǎng)基；在上述優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上分別加入不同類別緩沖鹽體系、微量元素和促生長(zhǎng)因子等物質(zhì)，采用Bioscreen C全自動(dòng)生長(zhǎng)讀值系統(tǒng)快速篩選促進(jìn)L. buchneriIMAU80233生長(zhǎng)的物質(zhì)。

1.3.3 Bioscreen C系統(tǒng)參數(shù)

Bioscreen C讀值系統(tǒng)是一個(gè)全自動(dòng)化的儀器，該系統(tǒng)包括閱讀器（包含1 個(gè)培養(yǎng)箱和1 個(gè)測(cè)量單位）、樣品盤(pán)和軟件，能夠長(zhǎng)時(shí)間記錄菌體密度（吸光度A）。設(shè)置培養(yǎng)溫度37 ℃、培養(yǎng)時(shí)間48 h，每2 h讀取一次菌體密度A值，A值讀取波長(zhǎng)為600 nm，讀值前后樣品盤(pán)振蕩60 s與25 s，振蕩速度一般。每個(gè)加樣孔內(nèi)依次加入270 μL培養(yǎng)基、30 μL活化2 代菌液與50 μL無(wú)菌石蠟，每組設(shè)置3 個(gè)平行，將樣品板放入Bioscreen C培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃培養(yǎng)48 h，根據(jù)菌株生長(zhǎng)情況確定最適生長(zhǎng)物質(zhì)。

1.3.4 培養(yǎng)基主要成分響應(yīng)面優(yōu)化

根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果，對(duì)L. buchneriIMAU80233培養(yǎng)基碳源、氮源、緩沖鹽體系進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)（表1），以菌體密度為響應(yīng)值，確定培養(yǎng)基中主要成分的最優(yōu)配比。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Coded levels for independent variables used in Box-Behnken design

1.3.5 高密度發(fā)酵條件優(yōu)化

采用5 L×3聯(lián)液體發(fā)酵罐對(duì)L. buchneriIMAU80233高密度發(fā)酵恒定pH值、氣體環(huán)境等關(guān)鍵條件進(jìn)行單因素優(yōu)化。以發(fā)酵終點(diǎn)發(fā)酵液活菌數(shù)和菌體密度為指標(biāo)；發(fā)酵過(guò)程中流加25%氨水保持培養(yǎng)基恒定pH 6.50±0.02，培養(yǎng)溫度37 ℃，攪拌速率150 r/min，罐壓0.03～0.04 MPa。

1.3.6 菌體生長(zhǎng)特性檢測(cè)

菌體密度測(cè)定：用紫外分光光度計(jì)在600 nm波長(zhǎng)處測(cè)定L. buchneriIMAU80233的吸光度。測(cè)定前先用蒸餾水調(diào)零紫外分光光度計(jì)，以蒸餾水為空白。

活菌數(shù)測(cè)定：L. buchneriIMAU80233發(fā)酵液用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液進(jìn)行10 倍系列梯度稀釋，至適宜梯度后取1 mL稀釋液加入培養(yǎng)皿，采用傾注法計(jì)活菌數(shù)，培養(yǎng)基為改良MRS瓊脂（以等量果糖替代葡萄糖）。培養(yǎng)皿于37 ℃厭氧48 h后統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

pH值測(cè)定：利用pH計(jì)，每次測(cè)定前先將pH計(jì)校準(zhǔn)。

發(fā)酵終點(diǎn)判定：發(fā)酵至加堿高峰期后，每隔1 h測(cè)定發(fā)酵液菌體密度A600nm，差異不顯著則終止發(fā)酵。

1.4 數(shù)據(jù)處理

響應(yīng)面試驗(yàn)采用Design-Expert軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)與分析，差異性分析采用SPSS 17.0，圖形繪制采用Origin 2017軟件。

生長(zhǎng)曲線擬合與生長(zhǎng)參數(shù)估計(jì)采用Logistic方程進(jìn)行擬合：

式中：x為培養(yǎng)時(shí)間/h；y為菌體密度；y0為初始菌體密度；a為菌體密度最大值；μmax為最大比生長(zhǎng)速率/h-1。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基成分篩選

2.1.1 碳源和氮源的篩選

碳水化合物是乳酸菌除水之外生長(zhǎng)需求量最大的物質(zhì)；氮源在乳酸菌生長(zhǎng)過(guò)程中起著重要的作用，不同種類的乳酸菌蛋白水解酶系存在差異，導(dǎo)致最適生長(zhǎng)氮源種類不同[21]。選擇適合L. buchneriIMAU80233生長(zhǎng)的碳氮源尤為重要，本著工業(yè)生產(chǎn)成本最低化原則，綜合本實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵乳酸菌常用到的碳氮源，篩選促L. buchneriIMAU80233生長(zhǎng)最適碳氮源，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 L. buchneri IMAU80233在不同碳氮源培養(yǎng)基中的最大比生長(zhǎng)速率（x ±s，n=3）Table 2 Maximum speci fic growth rates of L. buchneri IMAU80233 grown with different carbon and nitrogen sources (x± s, n= 3)

由表2可知，L. buchneriIMAU80233在以果糖為碳源的培養(yǎng)基內(nèi)最大比生長(zhǎng)速率值最高為0.159 5 h-1，與低聚異麥芽糖實(shí)驗(yàn)組0.145 1 h-1無(wú)顯著差異（P＞0.05），二者與其余各組存在顯著差異（P＜0.05）。其次，蔗糖與可溶性大豆多糖實(shí)驗(yàn)組最大比生長(zhǎng)速率分別為0.065 9 h-1和0.052 5 h-1，其中葡萄糖（MRS）實(shí)驗(yàn)組最大比生長(zhǎng)速率最低為0.005 3 h-1，與其余各組存在顯著差異（P＜0.05）。以上結(jié)果表明在以低聚果糖、水蘇糖和葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基內(nèi)幾乎不生長(zhǎng)，在以棉籽糖、海藻糖為碳源的培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng)緩慢，在以果糖與低聚異麥芽糖為碳源的培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng)最快。馮晨龍等[22]在L. parabuchneriK1培養(yǎng)基內(nèi)加入300 g/L果糖馴化得到耐高滲菌株L. parabuchneriK2，果糖利用速率提高了103%，發(fā)酵周期縮短46.4%。綜合考慮工業(yè)生產(chǎn)成本選擇果糖作為碳源進(jìn)行下一步研究。

酵母粉實(shí)驗(yàn)組最大比生長(zhǎng)速率0.101 1 h-1，大豆蛋白胨實(shí)驗(yàn)組最大比生長(zhǎng)速率0.096 8 h-1，二者之間差異不顯著（P＞0.05），顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組（P＜0.05）。其次，酵母蛋白胨和魚(yú)蛋白胨實(shí)驗(yàn)組最大比生長(zhǎng)速率分別為0.071 6 h-1和0.070 5 h-1。結(jié)果表明，L. buchneriIMAU80233在以酵母粉和大豆蛋白胨為單一氮源時(shí)生長(zhǎng)情況要明顯優(yōu)于其他實(shí)驗(yàn)組。由于酵母粉和大豆蛋白胨實(shí)驗(yàn)組不存在顯著性差異（P＞0.05），故對(duì)其復(fù)配進(jìn)一步優(yōu)化，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同氮源復(fù)配比對(duì)L. buchneri IMAU80233菌體密度的影響（x ±s，n=3）Table 3 Effect of nitrogen source composition on the cell density of L. buchneri IMAU80233 (x± s, n= 3)

由表3可知，以酵母粉和大豆蛋白胨為L(zhǎng). buchneriIMAU80233生長(zhǎng)氮源進(jìn)行不同比例復(fù)配時(shí)，酵母粉和大豆蛋白胨以1∶2比例復(fù)配菌體密度達(dá)到最高值4.35，顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組（P＜0.05）。隨著大豆蛋白胨含量的增加，菌體密度呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)；隨著酵母粉含量的增加，菌體密度呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)。MRS實(shí)驗(yàn)組菌體密度為2.84，顯著低于其他實(shí)驗(yàn)組（P＜0.05）。酵母粉實(shí)驗(yàn)組和大豆蛋白胨實(shí)驗(yàn)組菌體密度分別為3.24與3.18，顯著低于處理組1、2、4（P＜0.05），可見(jiàn)復(fù)配實(shí)驗(yàn)的必要性。綜上所述，選擇酵母粉與大豆蛋白胨比例為1∶2進(jìn)行下一步研究。常峰等[23]在研究L. buchneri YCF10發(fā)酵條件時(shí)，同樣在培養(yǎng)基內(nèi)添加0.5%酵母粉和1%大豆蛋白胨作為最佳氮源。

2.1.2 培養(yǎng)基碳氮源總量及比例優(yōu)化

培養(yǎng)基內(nèi)碳氮源總量及比例的變化顯著影響著菌體生長(zhǎng)[24]。以上述實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)，選取碳氮源總量40～80 g/L，碳氮比為1∶3、1∶2、1∶1、2∶1和3∶1。

圖1 碳氮總量及比例對(duì)L. buchneri IMAU80233菌體密度的影響Fig. 1 Effects of total concentration of nitrogen and carbon and carbon/nitrogen ratio on the cell density of L. buchneri IMAU80233

由圖1可知，L. buchneri IMAU80233菌體密度隨著培養(yǎng)基內(nèi)碳氮源總量增加而增加；當(dāng)培養(yǎng)基內(nèi)碳氮源總量一定時(shí)隨著碳源比例的升高，菌體密度都呈現(xiàn)出先上升后下降趨勢(shì)；培養(yǎng)基不同碳氮源總量在碳氮比為2∶1時(shí)達(dá)到菌體密度最高值，故選擇碳氮總量為80 g/L，碳氮比為2∶1進(jìn)行下一步研究。

2.1.3 培養(yǎng)基緩沖鹽體系優(yōu)化

乳酸菌在培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生乳酸等酸性物質(zhì)導(dǎo)致培養(yǎng)基pH值下降，抑制自身進(jìn)一步增殖[25]。緩沖鹽能夠在一定程度上維持培養(yǎng)基內(nèi)pH值相對(duì)穩(wěn)定，同時(shí)能夠調(diào)節(jié)菌體細(xì)胞周?chē)鷿B透壓平衡，提高菌體生長(zhǎng)量[26]。采用Bioscreen C讀值系統(tǒng)對(duì)pH 6.0的7 種緩沖體系進(jìn)行分析，結(jié)果如圖2所示。

圖2 培養(yǎng)基中不同緩沖鹽對(duì)L. buchneri IMAU80233最大比生長(zhǎng)速率的影響Fig. 2 Effects of different buffer salts on the maximum specific growth rate of L. buchneri IMAU80233

由圖2可知，Na2HPO4·12H2O/NaH2PO4·2H2O與MRS緩沖體系相比存在顯著性差異（P＜0.05），能夠在一定程度上促進(jìn)L. buchneri IMAU80233菌體增殖；檸檬酸-檸檬酸鈉實(shí)驗(yàn)組最大比生長(zhǎng)速率顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組（P＜0.05），表明檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖體系能夠顯著提高L. buchneri IMAU80233菌體密度；其他組與MRS對(duì)照組最大比生長(zhǎng)速率不存在顯著性差異（P＞0.05），表明其不能促進(jìn)L. buchneri IMAU80233增殖。故選擇檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖體系進(jìn)行下一步研究。

2.1.4 培養(yǎng)基微量元素優(yōu)化

微量元素通常作為某些活性物質(zhì)的組成成分或者酶的激活劑發(fā)揮作用[27]。采用Bioscreen C讀值系統(tǒng)對(duì)添加不同量ZnSO4·7H2O、CuSO4·5H2O、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O和MnSO4·5H2O的培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。

圖3 培養(yǎng)基中不同微量元素對(duì)L. buchneri IMAU80233最大比生長(zhǎng)速率的影響Fig. 3 Effects of different trace elements on the maximum specific growth rate of L. buchneri IMAU80233

由圖3可看出，與空白組（虛線）相比，隨著ZnSO4·7H2O添加量上升，菌體最大比生長(zhǎng)速率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，不同添加量的CuSO4·5H2O與FeSO4·7H2O最大比生長(zhǎng)速率也呈現(xiàn)出相似的趨勢(shì)，表明ZnSO4·7H2O、CuSO4·5H2O與FeSO4·7H2O對(duì)L. buchneriIMAU80233生長(zhǎng)增殖具有一定抑制作用；不同添加量的MnSO4·5H2O對(duì)菌體最大比生長(zhǎng)速率提高效果明顯，與空白組相比存在極顯著差異（P＜0.01）；此外MgSO4·7H2O對(duì)L. buchneriIMAU80233菌體最大比生長(zhǎng)速率促進(jìn)效果明顯，存在顯著差異（P＜0.05），因此優(yōu)化培養(yǎng)基選擇加入90 mg/L MnSO4·5H2O和600 mg/L MgSO4·7H2O。李興峰[28]的研究結(jié)論與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符，Mg2＋和Mn2＋對(duì)乳桿菌酶活力有促進(jìn)作用，Cu2＋對(duì)乳桿菌酶活力有不同程度的抑制作用。

2.1.5 培養(yǎng)基生長(zhǎng)因子優(yōu)化

乳酸菌屬于生長(zhǎng)因子異養(yǎng)型微生物，在培養(yǎng)基中添加一些乳酸菌自身難以合成卻是調(diào)節(jié)生長(zhǎng)或代謝不可缺少的物質(zhì)可促進(jìn)其生長(zhǎng)[29]。采用Bioscreen C讀值系統(tǒng)對(duì)不同種類和濃度生長(zhǎng)因子進(jìn)行篩選，由圖4可看出，添加不同種核苷酸和維生素對(duì)L. buchneriIMAU80233菌體最大比生長(zhǎng)速率并無(wú)明顯促進(jìn)效果。精氨酸實(shí)驗(yàn)組對(duì)L. buchneriIMAU80233菌體最大比生長(zhǎng)速率促進(jìn)效果要優(yōu)于其他氨基酸，且與空白組相比存在顯著性差異（P＜0.05）。Liu等[30]在研究代謝途徑時(shí)發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基內(nèi)加入精氨酸和可發(fā)酵糖會(huì)促進(jìn)L. buchneri菌體生長(zhǎng)。綜和考慮工業(yè)化生產(chǎn)成本，靜態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中添加500 mg/L精氨酸，工業(yè)生產(chǎn)中不作考慮。

圖4 培養(yǎng)基中不同生長(zhǎng)因子對(duì)L. buchneri IMAU80233最大比生長(zhǎng)速率影響Fig. 4 Effects of different growth factors on the maximum specific growth rate of L. buchneri IMAU80233

2.1.6 培養(yǎng)基主要成分響應(yīng)面優(yōu)化

采用Design-Expert軟件中Box-Behnken設(shè)計(jì)法對(duì)培養(yǎng)基主成分碳源、氮源和緩沖鹽用量進(jìn)行優(yōu)化，以菌體密度（A600nm）為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3因素3水平共17 組響應(yīng)面試驗(yàn)。用來(lái)評(píng)估誤差的零點(diǎn)試驗(yàn)重復(fù)5 次，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Box-Behnken design with experimental results

采用Design-Expert軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，得到L. buchneriIMAU80233菌體密度與培養(yǎng)基3 類主成分生長(zhǎng)模型為：Y=8.17＋0.10X1＋1.49X2-0.11X3＋0.055X1X2-

采用Design-Expert軟件對(duì)響應(yīng)值進(jìn)行顯著性回歸分析，二次項(xiàng)對(duì)L. buchneriIMAU80233菌體密度有顯著影響（P＜0.05），交叉項(xiàng)對(duì)L. buchneriI MAU8 02 33菌體密度影響有一定影響但不顯著（P＞0.05），方程模型整體極顯著（P＜0.01），失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），方程模型的為0.926 0，為0.830 9，說(shuō)明方程與試驗(yàn)擬合度良好[31]。

圖5 碳源、氮源、緩沖鹽用量交互影響的響應(yīng)面圖Fig. 5 Response surface plots showing the interactive effect of buffered salt, carbon and nitrogen on the cell density of L. buchneri IMAU80233

由圖5可知，隨著碳源、緩沖鹽用量增加，菌體密度呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)。菌體密度最大值出現(xiàn)在曲面上，且碳源、緩沖鹽各自對(duì)應(yīng)菌體密度最大值與其并不重合，可知二者之間存在顯著性差異（P＜0.05）。隨著氮源用量增加，菌體密度先增加，后趨于平衡?；貧w分析結(jié)果表明碳源與氮源、緩沖鹽與氮源之間交互作用不顯著（P＞0.05）。

響應(yīng)面預(yù)測(cè)最優(yōu)培養(yǎng)基為碳源50.78 g/L、氮源35.8 g/L、緩沖鹽21.65 g/L，菌體密度預(yù)測(cè)最大值為8.704，為驗(yàn)證該方法可靠性，采用上述優(yōu)化后培養(yǎng)基對(duì)L. buchneri IMAU80233活化二代按2%接種量37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，菌體密度為8.853，與模型預(yù)測(cè)最優(yōu)值不存在顯著差異（P＞0.05），表明此方法結(jié)果可靠。最終優(yōu)化后靜態(tài)培養(yǎng)基成分為果糖50.78 g/L，大豆蛋白胨23.90 g/L，酵母粉11.90 g/L，檸檬酸1.59 g/L，檸檬酸鈉20.06 g/L，MnSO4·5H2O 0.09 g/L，MgSO4·7H2O 0.60 g/L，精氨酸0.50 g/L，吐溫-80 1.00 g/L。

2.2 高密度培養(yǎng)工藝優(yōu)化

2.2.1 培養(yǎng)基碳源用量?jī)?yōu)化

L. buchneri屬于典型的異型發(fā)酵乳酸菌，在發(fā)酵過(guò)程中代謝碳源可產(chǎn)生乳酸、乙醇、乙酸、CO2等多種物質(zhì)[32]。同時(shí)考慮到2.1.2節(jié)結(jié)果顯示碳氮比在2∶1時(shí)菌體密度最高，因此高密度發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中增加果糖用量，以期達(dá)到更高活菌數(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 果糖用量對(duì)發(fā)酵液活菌數(shù)影響Fig. 6 Effect of fructose concentration on the viable cell count of fermentation broth

由圖6可以看出，當(dāng)果糖用量為60～120 g/L時(shí)，發(fā)酵液中L. buchneri IMAU80233活菌數(shù)呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)，在果糖用量為80 g/L時(shí)活菌數(shù)達(dá)到最高。結(jié)果表明適當(dāng)提高果糖用量可以提高L. buchneri IMAU80233發(fā)酵液中活菌數(shù)，果糖用量太高可能抑制L. buchneri IMAU80233生長(zhǎng)增殖，因此選擇高密度發(fā)酵培養(yǎng)基果糖用量為80 g/L。

2.2.2 高密度培養(yǎng)條件優(yōu)化

乳酸菌生長(zhǎng)是否良好取決于適合的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。其中最為首要的因素包括培養(yǎng)溫度（L. buchneri最適培養(yǎng)溫度為37 ℃[33]，此處不做優(yōu)化）、恒定pH值、氣體環(huán)境等。高密度培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)酵液恒定pH值對(duì)菌體活菌數(shù)、離心得率、凍干菌粉后期穩(wěn)定性與溶解性和發(fā)酵用時(shí)等有著關(guān)鍵性作用。L. buchneri IMAU80233屬于兼性厭氧菌，發(fā)酵初期氣體環(huán)境對(duì)L. buchneri IMAU80233啟動(dòng)起至關(guān)重要的影響。為實(shí)現(xiàn)工業(yè)生產(chǎn)利益最大化，本研究利用5 L×3聯(lián)發(fā)酵罐對(duì)L. buchneri IMAU80233高密度發(fā)酵過(guò)程中恒定pH值和氣體環(huán)境進(jìn)行優(yōu)化。

圖7 發(fā)酵恒定pH值和氣體環(huán)境對(duì)L. buchneri IMAU80233菌體密度和活菌數(shù)的影響Fig. 7 Effect of constant fermentation pH value and gas environment on the cell density and viable count of L. buchneri IMAU80233

如圖7所示，當(dāng)恒定pH值為5.9時(shí)，活菌數(shù)和菌體密度顯著高于其他2 個(gè)實(shí)驗(yàn)組（P＜0.05）；同一指標(biāo)不同氣體環(huán)境L. buchneri IMAU80233活菌數(shù)差異顯著（P＜0.05），發(fā)酵初期通入氮?dú)鈱?shí)驗(yàn)組優(yōu)于空氣實(shí)驗(yàn)組。綜上所述，發(fā)酵初期選擇通入氮?dú)?、恒定pH值5.9發(fā)酵，優(yōu)化后活菌數(shù)達(dá)3.81×109CFU/mL。

3 結(jié)論與討論

本研究以工業(yè)化生產(chǎn)為出發(fā)點(diǎn)，對(duì)具有潛在益生特性菌株L. buchneri IMAU80233高密度培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)工藝進(jìn)行優(yōu)化。確定高密度培養(yǎng)基為果糖80 g/L，大豆蛋白胨23.90 g/L，酵母粉11.90 g/L，檸檬酸1.59 g/L，檸檬酸鈉20.06 g/L，MnSO4·5H2O 0.09 g/L，MgSO4·7H2O 0.60 g/L，吐溫-80 1.00 g/L；確定高密度培養(yǎng)條件為：初始pH 6.5、流加25%氨水恒定pH 5.9、37 ℃恒溫至發(fā)酵20 h至發(fā)酵終點(diǎn)。優(yōu)化后發(fā)酵液活菌數(shù)為3.81×109CFU/mL。本研究在提高潛在益生特性L. buchneri IMAU80233發(fā)酵液活菌數(shù)的同時(shí)還大幅度縮短其發(fā)酵時(shí)間，對(duì)其工業(yè)化應(yīng)用和微生態(tài)制品生產(chǎn)都將有深遠(yuǎn)意義。

利用Bioscreen C全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀繪制L. buchneri IMAU80233在各類生長(zhǎng)物質(zhì)中的生長(zhǎng)曲線，以最大比生長(zhǎng)速率為指標(biāo)實(shí)現(xiàn)最優(yōu)生長(zhǎng)物質(zhì)快速篩選。該儀器存在一定的局限性：無(wú)法對(duì)點(diǎn)樣孔內(nèi)樣品進(jìn)行自動(dòng)稀釋，所以很難準(zhǔn)確測(cè)定菌體密度大于2對(duì)應(yīng)各點(diǎn)的信息，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中采取減少接種量或稀釋培養(yǎng)基的方法來(lái)延緩菌體生長(zhǎng)，可在一定程度上規(guī)避此局限性。本研究方法優(yōu)點(diǎn)在于通量高，能夠一次性對(duì)幾十種不同種類生長(zhǎng)物質(zhì)進(jìn)行篩選比較[34]，且實(shí)驗(yàn)周期短，數(shù)據(jù)平行，能夠在一定程度上反映菌體特性，適合應(yīng)用于此類研究中。