王淑芳，董 飛，王 剛，俞明正，徐劍宏，史建榮*

（江蘇省食品質(zhì)量安全重點實驗室—省部共建國家重點實驗室培育基地，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全控制技術(shù)與標準重點實驗室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室（南京），江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營養(yǎng)研究所，江蘇 南京 210014）

酚類是一類含有活躍酚羥基的植物次生代謝產(chǎn)物，包括酚酸、黃酮和花色苷類，具有抗氧化[1]、抗癌、抗衰老[2]等生理作用。在禾谷類籽粒中，酚酸是主要的酚類物質(zhì)[1,3]，以游離和結(jié)合形式存在。酚酸主要有沒食子酸、原兒茶酸、對羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸、對香豆酸、阿魏酸和芥子酸等[4-5]。早期以福林-酚法研究谷物中的總酚類物質(zhì)含量[6]，隨著研究的不斷深入，黃酮、酚酸和花色苷類物質(zhì)被分別測定[7]。然而，酚酸在各種植物源食品中的存在形式不同，因此，適合的提取和測定方法對深入研究谷物籽粒中的酚類物質(zhì)具有重要意義。

目前，植物食品中酚酸含量的測定主要采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法。Chen Zhijie等[8]采用HPLC法定量了小麥苗中酚酸的含量，孫元琳等[9]用HPLC定量了黑麥麩皮中酚酸的含量。因酚酸結(jié)構(gòu)相似，色譜條件顯著影響酚酸組分的分離，故近年來有學(xué)者引入高效液相色譜-質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）聯(lián)用法定量酚酸[10-11]。通過質(zhì)譜定量離子的選擇，避免了因分離度不理想而影響準確定量的問題。然而，質(zhì)譜鑒定和定量對樣品純度要求較高，在前期制樣過程中，需要進行初步純化，盡量去除結(jié)構(gòu)近似的雜質(zhì)，有助于定量離子的選擇。因此，合適的提取和前期純化方法有助于HPLC-MS法準確定量酚酸。常用的酚酸提取溶劑有甲醇、乙醇和丙酮[12]，在水果和蔬菜酚酸提取中，使用乙醇為提取溶劑的較多，而在谷物酚酸提取中，甲醇較為常用。李春玲[12]比較了甲醇、乙醇和丙酮對景天中酚酸提取率的影響，結(jié)果顯示甲醇對酚酸的提取能力更好。但是在提取以結(jié)合酚酸為主，且淀粉含量高的樣品中的酚酸時，需先用堿液水解。對于結(jié)合酚酸含量高的谷物樣品，研究堿使用濃度和提取液料比有利于充分提取酚酸。前期研究發(fā)現(xiàn)，用堿水解小麥籽粒樣品后，水解液呈凝膠狀，酚酸分散其中難以分離，用常規(guī)方法難以提取，因而需用有機溶劑萃取的方法才能有效提取酚酸[13-14]。乙酸乙酯是較為有效的萃取溶劑，但對于不同的樣品，溶劑萃取時間和次數(shù)需進一步探討。

目前，江淮麥區(qū)小麥主栽品種主要有江蘇省農(nóng)科院育成的寧麥系列、煙農(nóng)19、以及淮麥系列，黃淮麥區(qū)主栽品種有河南的百農(nóng)207、新麥26，山東的濟麥22等，北方春麥區(qū)主栽品種有黑龍江的龍麥35和內(nèi)蒙古的永良4號。由于受基因型[15]、氣候條件[16]、土壤狀況[17]等自然條件的影響，我國不同產(chǎn)區(qū)生產(chǎn)的小麥品質(zhì)存在極大差異[18]。同時，同一產(chǎn)區(qū)不同小麥品種營養(yǎng)和功能品質(zhì)有顯著差異。因此，研究小麥主要產(chǎn)區(qū)主栽品種酚酸含量的差異具有重要的意義。

本研究采用NaOH溶液水解小麥籽粒后，用乙酸乙酯萃取的方法，探討水解及萃取條件對小麥籽粒酚酸提取量的影響，并優(yōu)化提取條件；然后用HPLC-MS方法定量我國小麥主要產(chǎn)區(qū)主栽品種酚酸含量的差異。為我國小麥品種選育、品質(zhì)區(qū)劃及小麥的綜合利用提供科學(xué)依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥品種為：江淮麥區(qū)：寧麥系列、淮麥系類、揚麥系類等；黃淮麥區(qū)：百農(nóng)207、矮抗58、新麥26等；北方麥區(qū)：龍麥35、津強7號、永良4號等，均為2017年收獲，詳見表1。

酚酸標準品：沒食子酸（G7384-100G）、原兒茶酸（08992-50MG）、4-羥基苯甲酸（240141-100G）、香草酸（94770-10G）、咖啡酸（C0625-2G）、丁香酸（S6881-5G）、對香豆酸（C9008-1G）、阿魏酸（128708-5G）和芥子酸（D7927-1G） 美國Sigma公司；乙腈、甲醇、甲酸、NaOH、乙酸乙酯 上海安譜生物科技有限公司。

表1 不同產(chǎn)地和品種小麥采樣點Table 1 Wheat sampling points from different growing areas and varieties

1.2 儀器與設(shè)備

ZHSY-50WS型水浴往復(fù)恒溫振蕩培養(yǎng)箱 上海知楚儀器有限公司；5810R型離心機 Eppendorf公司；WH-3微型旋渦混合儀 上海滬西分析儀器廠；AB6500 HPLC-MS 美國AB SCIEX公司；RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 NaOH濃度對酚酸提取量的影響

小麥籽粒經(jīng)挑選除雜后，打粉過0.425 mm篩。分別用0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mol/L的NaOH溶液恒溫振蕩水解3 h（30 ℃，150 r/min），液料比為15∶1（mL/g）；然后用1 倍體積的乙酸乙酯在30 ℃、150 r/min萃取2 次，每次15 min，合并萃取液旋蒸，用10 mL 50%的甲醇溶液復(fù)溶，過0.22 μm的濾膜后測定酚酸含量。

1.3.2 液料比對酚酸提取量的影響

過0.425 mm篩的樣品用液料比5∶1、10∶1、15∶1、20∶1（mL/g）的2.0 mol/L NaOH溶液恒溫振蕩水解3 h（30 ℃，150 r/min），然后用1 倍體積的乙酸乙酯在30 ℃、150 r/min萃取2 次，每次15 min，合并萃取液旋蒸，用10 mL 50%的甲醇溶液復(fù)溶，過0.22 μm的濾膜后測定酚酸含量。

1.3.3 乙酸乙酯萃取時間對酚酸提取量的影響

過0.425 mm篩的樣品用液料比15∶1（mL/g）的2.0 mol/L NaOH溶液恒溫振蕩水解3 h（30 ℃，150 r/min），然后用1倍體積的乙酸乙酯在30 ℃、150 r/min振蕩2 次，每次萃取時間分別為5、10、15、20 min，合并兩次萃取液旋蒸，用10 mL 50%的甲醇溶液復(fù)溶，過0.22 μm的濾膜后測定酚酸含量。

1.3.4 萃取次數(shù)對酚酸提取量的影響

過0.425 mm篩的樣品用液料比為15∶1（mL/g）的2.0 mol/L NaOH溶液恒溫振蕩水解3 h（30 ℃，150 r/min），然后用1 倍體積的乙酸乙酯分別在30 ℃、150 r/min振蕩萃取1、2、3 次，每次萃取時間為15 min，合并萃取液旋蒸，用10 mL 50%的甲醇溶液復(fù)溶，過0.22 μm的濾膜后-20 ℃保存待測。

1.3.5 提取條件優(yōu)化

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以NaOH濃度、液料比和乙酸乙酯萃取時間為因素，以酚酸提取量為響應(yīng)值做響應(yīng)面優(yōu)化試驗。采用Design-Expert 8.0.6統(tǒng)計軟件對響應(yīng)面試驗數(shù)據(jù)進行線性回歸和方差分析，優(yōu)化出最適條件組合。

1.3.6 測定指標及方法

1.3.6.1 酚酸提取

在Chen Zhijie等[13]的方法上改進。準確稱取2.00 g完全通過0.425 mm孔篩的小麥樣品于250 mL三角瓶中，按照本實驗設(shè)置的體積質(zhì)量比和不同濃度的NaOH溶液水解樣品，水解結(jié)束后采用1 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)水解液pH值在1.5～2.0之間；然后取1 倍體積的乙酸乙酯與水解液充分混合萃取不同時間，4 ℃、10 000 r/min離心5 min，取上層乙酸乙酯層，重復(fù)此操作0～2 次，合并所有乙酸乙酯層于40 ℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸干，殘渣采用10 mL 50%的甲醇溶液復(fù)溶，過0.22 μm的濾膜后測定酚酸含量。

1.3.6.2 HPLC條件

分別取2 μL上述提取液采用HPLC-MS進行分析：Agilent XDB-C18（3.5 μm×2.1 mm，150 mm）色譜柱，流速為0.5 mL/min，流動相A溶液為含1%甲酸的水溶液，B溶劑為含1%甲酸的乙腈溶液；流動相洗脫程序：0～5 min，流動相A由90%～60%；流動相B從10%～40%；5～12 min，流動相A從60%～10%；流動相B從40%～90%；12～15 min，流動相A從10%～90%；流動相B從90%～10%；柱溫40 ℃。

1.3.6.3 質(zhì)譜條件

表2 酚酸質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Mass spectrometry parameters of phenolic acid

離子化模式為電噴霧電離負離子模式，多反應(yīng)監(jiān)測，離子源溫度500 ℃，駐留時間100 ms，霧化氣壓50 psi，輔助氣壓50 psi，噴霧電壓-4 500 V，碰撞室射出電壓6 V。質(zhì)譜參數(shù)如表2所示。

1.3.6.4 酚酸標準曲線建立

建立9 種酚酸標準曲線，在相應(yīng)的線性范圍內(nèi)，9 種酚酸在小麥基質(zhì)中均線性良好，相關(guān)系數(shù)R2不低于0.99，見表3。

表3 酚酸標準曲線及檢出限、定量限檢測結(jié)果Table 3 Standard curves, LODs and LOQs of phenolic acids

1.3.6.5 酚酸含量計算公式

試樣中酚酸含量按計算公式如下：

式中：X為試樣中酚酸含量/（mg/kg）；V為樣品最終定容體積/mL；m為稱樣量/g；c為儀器測得試樣溶液中酚酸質(zhì)量濃度/（μg/mL）。

1.4 數(shù)據(jù)分析

響應(yīng)面試驗采用Design Expert 8.0.6軟件設(shè)計，實驗設(shè)置重復(fù)3～6 次（n≥3），以表示，實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件Duncan多重比較法進行顯著性分析，P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥籽粒酚酸提取條件單因素試驗

由圖1A可以看出，用不同濃度的NaOH溶液水解顯著影響小麥籽粒中酚酸的提取量。隨著NaOH濃度的不斷增加，酚酸提取量不斷上升，在1.5 mol/L時達到最大；當NaOH濃度為3.0 mol/L時，酚酸含量降低。NaOH作為強堿，能水解小麥籽粒中酚酸與大分子之間的共價結(jié)合鍵[9,19]，隨著濃度的增加，水解能力增強，但是濃度過高時，可能對酚酸內(nèi)部化學(xué)鍵具有破壞作用，導(dǎo)致酚酸降解。提取液料比能顯著影響酚酸提取率，隨著液料比的增大，酚酸提取量增加，在液料比為15∶1（mL/g）時達到1 047.3 mg/kg（圖1B）。物質(zhì)在特定溶劑中的溶解度是一定的，隨著液料比的增加，溶解量不斷增加，但是液料比達到一定值后，酚酸幾乎被全部水解溶出，提取率達到動態(tài)平衡狀態(tài)。因此，本研究中液料比20∶1（mL/g）時不再增加酚酸提取量。在以結(jié)合酚為主的樣品中，結(jié)合酚酸被水解后需乙酸乙酯等有機溶劑萃取才能獲得較純的提取物以便用HPLC-MS檢測[13,20]。本研究結(jié)果顯示，乙酸乙酯萃取時間對小麥籽粒酚酸提取量有顯著影響（圖1C）。當提取時間大于15 min時萃取量達到最大，相比10 min萃取量增加45.02%。在設(shè)定乙酸乙酯為1 倍體積添加量和萃取15 min的情況下，萃取2 次以上對酚酸提取量無顯著影響（圖1D），因此后續(xù)采用萃取次數(shù)2 次，進行NaOH濃度、液料比和乙酸乙酯萃取時間的優(yōu)化實驗。

圖1 NaOH濃度（A）、液料比（B）、萃取時間（C）和萃取次數(shù)（D）對酚酸提取量的影響Fig. 1 Effect of NaOH concentration (A), liquid-to-material ratio (B),extraction time (C) and number of extraction cycles (D) on the extraction efficiency of phenolic acid

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選用3因素3水平Box-Behnken試驗設(shè)計對小麥籽粒中酚酸提取工藝進行優(yōu)化，試驗方案及結(jié)果見表4。運用Design Expert軟件，對表4中數(shù)據(jù)進行Forward模式多元二次回歸擬合，得到小麥籽粒中酚酸提取量預(yù)測值的二次多項回歸方程：

表4 Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果Table 4 Box-Behnken design with experimental and predicted values of phenolic acid

表5 回歸模型方差分析Table 5 Analyses of variance for the effect of extraction conditions on the the extraction efficiency of phenolic acid

液料比和乙酸乙酯萃取時間之間有顯著的交互作用（P＜0.05），由圖2可知，當液料比為10∶1（mL/g）時，萃取時間延長酚酸提取量先緩慢升高后有所降低；當液料比為20∶1（mL/g）時，隨著萃取時間的延長酚酸提取先迅速增加后緩慢下降，且液料比越大，酚酸提取量升高的速率越快。

圖2 液料比和乙酸乙酯萃取時間交互作用對酚酸提取量的影響Fig. 2 Response surface plot showing the interactive effects of liquid-tosolid ratio and extract time on the extraction efficiency of phenolic acid

由回歸方程可得，NaOH水解-乙酸乙酯萃取方法提取小麥籽粒酚酸的最佳條件為NaOH濃度1.56 mol/L、液料比15.53∶1（mL/g）、萃取時間17.33 min、萃取2 次；模型預(yù)測值為1 053 mg/kg。便于操作，選取NaOH濃度1.56 mol/L、液料比15.5∶1（mL/g）、萃取時間17 min，在此提取條件下，小麥籽粒中酚酸提取量達到1 055.99 mg/kg，且顯著高于隨機組合試驗結(jié)果（表6）；說明本試驗所擬合的二次多項式模型可預(yù)測提取條件和提取量之間的關(guān)系。

表6 響應(yīng)面驗證實驗Table 6 Verification of optimal combination of extraction conditions

2.3 不同產(chǎn)區(qū)和品種小麥中主要酚酸組成和含量

由表7可以看出，小麥中的主要酚酸為阿魏酸，占總酚酸的73.07%～89.01%，其次為芥子酸。沒食子酸只有在江淮麥區(qū)的保麥6號中含有，其他地區(qū)的小麥中都不含有?？Х人嶂饕嬖谟诮贷渽^(qū)和北方麥區(qū)的小麥中。研究表明[21]，不同種類谷物間酚類物質(zhì)含量差異較大，同種類谷物不同品種間酚類物質(zhì)含量差異也較大。江淮麥區(qū)寧麥14中總酚酸含量最高，達1 001.12 mg/kg，和該產(chǎn)區(qū)的煙農(nóng)19、淮麥33有顯著性差異；黃淮麥區(qū)的品種新麥26中總酚酸含量最高，為1 016.03 mg/kg，和該產(chǎn)區(qū)的濟麥22、百農(nóng)207有顯著性差異。Curvas等[22]比較了6 種小麥總酚含量，變幅為133.25～173.48 mg/kg。由此可見，谷物酚類物質(zhì)含量主要受其種類和品種決定[23-24]。生長環(huán)境或產(chǎn)地的不同也會造成谷物多酚含量的較大差異。不同種類谷物的酚酸組成及含量差異也較大。Lin等[25]研究發(fā)現(xiàn)，美國6 種小麥中，阿魏酸、對香豆酸、丁香酸、香草酸、咖啡酸等5 種酚酸平均含量變異系數(shù)分別為19.10%、18.54%、24.42%、21.83%和32.38%。此外，提取或制備方法也對谷物酚酸構(gòu)成及含量造成較大差異[26-27]。在本研究中，小麥采自中國江淮、黃淮和北方主要的小麥產(chǎn)區(qū)，產(chǎn)自海拔低的小麥品種寧麥14、揚麥16、揚輻麥4號，產(chǎn)自高海拔的小麥品種龍麥35、津強7號永良4號中咖啡酸含量較高，暗示咖啡酸可能與抵御極端環(huán)境有關(guān)[28]。北方小麥中原兒茶酸和丁香酸含量高于江淮和黃淮產(chǎn)區(qū)小麥，而阿魏酸的含量相對較低。說明日照時間長和晝夜溫差大有助于原兒茶酸和丁香酸的累積[29]。

表7 不同產(chǎn)區(qū)和品種小麥中主要酚酸組成和含量Table 7 Main phenolic acid compositions and contents of different wheat varieties grown in different areas mg/kg

3 結(jié) 論

本研究經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化獲得NaOH水解-乙酸乙酯萃取一步法提取小麥籽粒中酚酸的條件為：NaOH濃度1.56 mol/L、液料比15.53∶1（mL/g）、萃取時間17.33 min、萃取2 次。以便操作，選取NaOH濃度1.56 mol/L、液料比15.5∶1（mL/g）、萃取時間17 min。在此提取條件下，小麥籽粒中酚酸提取量達到1 055.99 mg/kg。黃淮麥區(qū)的新麥26中總酚酸含量最高；阿魏酸為小麥中的主要酚酸，占總酚酸的73.07%～89.10%。不同產(chǎn)區(qū)小麥中酚酸的組成和含量差異較大，北方小麥中原兒茶酸、丁香酸和咖啡酸容易積累，而阿魏酸含量較江淮、黃淮區(qū)小麥低。本研究結(jié)果為我國主要產(chǎn)區(qū)小麥功能品質(zhì)提供了重要參考。