黃巾凌，王嘉煒，牛沁雅，廉魯昕，尹明遠(yuǎn)，武 運(yùn)，楊保偉,*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052）

沙門氏菌（Salmonella）是一種非常重要的人畜共患病病原菌，該菌宿主譜較廣，不僅可以導(dǎo)致人患病，家畜、野生哺乳動(dòng)物、爬行類動(dòng)物、鳥類甚至昆蟲等均可感染發(fā)病。沙門氏菌病的發(fā)生也容易激發(fā)其他病原和并發(fā)癥，導(dǎo)致病情加重，甚至死亡[1]。據(jù)報(bào)道，在日本和美國(guó)等發(fā)達(dá)國(guó)家由沙門氏菌引起的食物中毒占到各類細(xì)菌性食物中毒的40%～80%，我國(guó)這一比例則高達(dá)90%[2-3]。在我國(guó)，每年約3億 人因感染沙門氏菌而患病，達(dá)病原菌食源性疾病總數(shù)的70%～80%[4]。因此，沙門氏菌一直是人們關(guān)注的焦點(diǎn)。隨著抗生素的廣泛使用，沙門氏菌的耐藥問題日趨嚴(yán)重，其耐藥水平也越來(lái)越高，給人類和動(dòng)物健康帶來(lái)極大的危害[5-7]。

氟喹諾酮類抗生素是沙門氏菌預(yù)防和臨床治療的最主要藥物之一，而qnrA、qnrB、qnrS和aac(6’)-Ib等基因的編碼產(chǎn)物則是導(dǎo)致沙門氏菌對(duì)喹諾酮和氟喹諾酮類抗生素產(chǎn)生抗性的重要原因[8-10]。目前，國(guó)外對(duì)畜、禽及其肉制品和食品源沙門氏菌耐藥性研究較多，對(duì)其耐藥性分子機(jī)理研究較為深入[8-9]。 在我國(guó)，雖然馬國(guó)柱等[10]研究了陜西地區(qū)食源性沙門氏菌，王嘉煒等[11]研究了陜西等4 省市雞肉源沙門氏菌對(duì)（氟）喹諾酮類抗生素的耐藥性及其相關(guān)耐藥基因，但這些研究涉及的菌株數(shù)量和調(diào)查范圍均相對(duì)較小。

本研究檢測(cè)分析了2007、2008、2010、2011、2013年和2014年分離于我國(guó)陜西、新疆和廣東等9 ?。ㄊ校┦吃葱陨抽T氏菌中與萘啶酮酸和環(huán)丙沙星耐藥相關(guān)的部分基因，探討了基因的檢出和耐藥性的關(guān)聯(lián)性，可為保障食品安全提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

814 株沙門氏菌分別于2007、2008、2010、2011、2013年和2014年分離于采集自新疆、廣東、廣西、福建、上海、陜西、北京、河南和四川農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)和超市的零售雞肉、豬肉、牛肉、羊肉、鴨肉、魚肉和奶粉樣品以及醫(yī)院的臨床生物樣品（人糞）。菌株的分離和鑒定按照Cui Shenghui等[12]方法進(jìn)行。鼠傷寒沙門氏菌（S. typhimurium）LT2，藥敏性測(cè)定用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株Escherichia coli ATCC25922、E. coli ATCC35218和Enterococcus faecalis ATCC29212為中國(guó)藥品生物制品檢定研究院惠贈(zèng)。

1.1.2 培養(yǎng)基

Luria-Bertani（LB）營(yíng)養(yǎng)瓊脂、Mueller Hinton（MH）瓊脂和半固體瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)于北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

1.1.3 抗生素與試劑

2 種（氟）喹諾酮類抗生素（萘啶酮酸和環(huán)丙沙星）美國(guó)Sigma公司；TaqDNA聚合酶、dNTPmix、10×PCR Buffer、MgCl2、DL 2000 DNA Ladder 寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.4 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增用引物

qnrA、qnrB、qnrS、aac(6’)-Ib、gyrA、parC、qepA、oqxA和oqxB基因擴(kuò)增用引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成（表1）。

表1 PCR擴(kuò)增和測(cè)序用引物Table 1 Sequences of primers used for PCR amplification and sequencing

1.2 儀器與設(shè)備

超凈工作臺(tái) 蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司；高壓滅菌鍋 日本Tomy公司；超純水處理器 美國(guó)Millipor公司；-40 ℃低溫冰箱、-80 ℃低溫冰箱 日本Sanyo公司；恒溫?fù)u床 上海智成分析儀器制造有限公司；移液器、高速離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；Mycycler PCR儀、DNA電泳、凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司；恒溫水浴儀 寧波賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 沙門氏菌血清型鑒定

沙門氏菌血清型鑒定在河南省疾病預(yù)防控制中心進(jìn)行。使用泰國(guó)S&A公司生產(chǎn)的沙門氏菌診斷血清，采用玻片凝集法，按照操作說(shuō)明書分別確定沙門氏菌的O抗原和H抗原類型，得到抗原式后查閱White-Kauffmann抗原表，確定沙門氏菌的血清型。

1.3.2 藥敏性測(cè)定

采用臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）[19]推薦的瓊脂稀釋法測(cè)定供試抗生素對(duì)沙門氏菌的最小抑菌濃度，按照CLSI標(biāo)準(zhǔn)判讀藥敏結(jié)果并確定耐藥表型。藥敏測(cè)定中使用E. coliATCC25922和ATCC35218、E. faecalisATCC29212作為標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株。

1.3.3 PCR擴(kuò)增和基因序列測(cè)定分析

采用煮沸法制備PCR用DNA模板[20]。PCR條件：94 ℃、10 min預(yù)變性；94 ℃、1 min變性，72 ℃、1 min延伸，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃、10 min。不同基因擴(kuò)增時(shí)退火溫度的選擇由相應(yīng)引物序列而定。2 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離檢測(cè)后，在凝膠成像系統(tǒng)拍照留存。gyrA和parC基因PCR粗產(chǎn)物在低溫條件下送至上海桑尼生物科技有限公司測(cè)序，測(cè)定得到的DNA序列使用Primer premier 5軟件翻譯成氨基酸后提交基因庫(kù)，采用在線比對(duì)軟件BLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）進(jìn)行比對(duì)，確定標(biāo)準(zhǔn)菌株鼠傷寒沙門氏菌LT2的gyrA和parC序列和基因庫(kù)序列完全吻合后，分析比對(duì)供試菌相應(yīng)的氨基酸序列，確定突變點(diǎn)和氨基酸突變類型。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用Microsoft Office Excel 2010對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行基本處理和作圖，使用IBM SPSS Statistics 20.0進(jìn)行多因素方差分析（Duncan法，差異顯著，P＜0.05和多元回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙門氏菌的血清型

814 株沙門氏菌共涵蓋83 個(gè)血清型，其中鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、印第安納沙門氏菌和德比沙門氏菌等血清型檢出率較高。阿貢納沙門氏菌、哈達(dá)爾沙門氏菌、湯普森沙門氏菌和倫敦沙門氏菌等19 種血清型檢出率在0.5%～5%之間。埃森沙門氏菌和奧爾巴尼沙門氏菌等60 種血清型檢出率在0.1%～0.5%之間（表2）。

表2 沙門氏菌血清型分布（n=814）Table 2 Distribution of Salmonella serovar (n= 814)

2.2 沙門氏菌對(duì)萘啶酮酸和環(huán)丙沙星的藥敏性

814 株沙門氏菌中，553 株（67.94%）對(duì)萘啶酮酸產(chǎn)生抗性，219 株（26.90%）對(duì)環(huán)丙沙星耐藥。其中，耐萘啶酮酸但環(huán)丙沙星敏感（NAL＋CIP-）型菌株檢出率最高（41.03%），顯著（P＜0.05）高于對(duì)萘啶酮酸和環(huán)丙沙星均敏感（NAL-CIP-）型菌株的檢出率（32.06%）以及同時(shí)耐受萘啶酮酸和環(huán)丙沙星（NALCIP-）菌株的檢出率（26.90%）（圖1）。

圖1 耐（氟）喹諾酮類抗生素沙門氏菌檢出率（n=814）Fig. 1 Prevalence of different fluoroquinolones resistance phenotypes in Salmonella (n = 814)

2.3 沙門氏菌中與（氟）喹諾酮類抗生素耐藥相關(guān)基因的檢出率

圖2 7 種基因在沙門氏菌中的檢出率（n=814）Fig. 2 Prevalence of seven fluoroquinolones resistance genes in Salmonella (n = 814)

如圖2所示，814 株沙門氏菌中，oqxB檢出率（31.82%）最高，顯著大于qnrA（24.94%）、oqxA（24.57%）、qnrB（24.45%）、qnrS（10.32%）和qepA（3.07%）陽(yáng)性菌株的檢出率（P＜0.05），與aac(6’)-Ib陽(yáng)性菌株的檢出率（27.52%）間無(wú)顯著差異。

圖3 7 種基因在不同耐藥表型沙門氏菌中的檢出率Fig. 3 Prevalence of seven fluoroquinolones resistance genes in Salmonella with different fluoroquinolones resistance phenotypes

如圖3所示，219 株NAL＋CIP＋型沙門氏菌中，aac(6’)-Ib陽(yáng)性菌株的檢出率（48.40%）與oqxB陽(yáng)性菌檢出率（43.83%）間無(wú)顯著性差異，但其2者均顯著大于oqxA（24.66%）、qnrB（15.98%）、qnrA（13.24%）、qnrS（8.68%）和qepA（0.91%）陽(yáng)性菌株的檢出率（P＜0.05）。334 株NAL＋CIP-型菌株中，oqxB（26.35%）檢出率最高；其次為qnrB和qnrA，檢出率均為22.75%；aac(6’)-Ib陽(yáng)性菌檢出率為20.36%；該4 種基因陽(yáng)性菌株的檢出率間無(wú)顯著性差異。261 株NAL-CIP-型菌株中，qnrA（37.93%）檢出率最高，但與qnrB（34.48%）和oqxA（31.42%）陽(yáng)性菌檢出率間無(wú)顯著性差異；該3 種基因陽(yáng)性菌株的檢出率均顯著高于aac(6’)-Ib（19.16%）、qnrS（9.20%）和qepA（7.66%）陽(yáng)性菌檢出率（P＜0.05）。

2.3.1 5 種檢出率較高血清型沙門氏菌中相關(guān)耐藥基因檢出情況

oqxA在德比沙門氏菌中的檢出率（45.24%）最高，其次為阿貢納沙門氏菌（37.50%）、鼠傷寒沙門氏菌（28.57%）、腸炎沙門氏菌（27.22%）和印第安納沙門氏菌（24.07%），5 種血清型沙門氏菌中oqxA陽(yáng)性菌的檢出率間無(wú)顯著性差異；圖4A中，oqxA在NAL＋CIP＋型鼠傷寒沙門氏菌中的檢出率（53.57%）顯著高于在NAL-CIP-型（28.77%）和NAL＋CIP-型（21.05%）中的檢出率（P＜0.05），在不同耐藥表型的德比沙門氏菌、印第安納沙門氏菌和阿貢納沙門氏菌中的檢出率間均無(wú)顯著性差異。oqxB在印第安納沙門氏菌中的檢出率（45.37%）顯著高于在阿貢納沙門氏菌（31.35%）和鼠傷寒沙門氏菌（27.04%）中的檢出率（P＜0.05），與德比沙門氏菌（45.24%）和腸炎沙門氏菌（41.77%）中的檢出間無(wú)顯著性差異；圖4B顯示在具不同氟喹諾酮類抗生素耐藥表型鼠傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌中的檢出率間存在顯著性差異，在其他血清型不同耐藥表型菌株中的檢出率間無(wú)顯著性差異。qepA在腸炎沙門氏菌中檢出率（5.70%）最高，其次為德比沙門氏菌（4.76%）、阿貢納沙門氏菌（3.13%）和鼠傷寒沙門氏菌（2.55%）。aac(6’)-Ib在印第安納沙門氏菌中的檢出率（50.93%）顯著高于在腸炎沙門氏菌（21.52%）、阿貢納沙門氏菌（15.63%）和德比沙門氏菌（14.29%）中的檢出率（P＜0.05），與鼠傷寒沙門氏菌中的檢出率（39.80%）則無(wú)顯著性差異。qnrA在阿貢納沙門氏菌中的檢出率（43.75%）顯著（P＜0.05）高于在德比沙門氏菌（21.43%）、鼠傷寒沙門氏菌（14.80%）和印第安納沙門氏菌（12.96%）中的檢出率，與腸炎沙門氏菌（33.54%）中的檢出率間無(wú)顯著性差異。qnrB在阿貢納沙門氏菌中的檢出率（25.00%）最高，其次為腸炎沙門氏菌（24.68%）、德比沙門氏菌（23.81%）、鼠傷寒沙門氏菌（15.31%）和印第安納沙門氏菌（12.96%），在5 種血清型菌株中的檢出率間無(wú)顯著性差異。qnrS在德比沙門氏菌中的檢出率（11.90%）最高，其次為鼠傷寒沙門氏菌（8.67%）、腸炎沙門氏菌（6.96%）和印第安納沙門氏菌（6.48%）。圖4C～G也可看出不同種血清型不同耐藥性之間的具體差異性。

圖4 5 種常見血清型不同耐藥表型沙門氏菌中耐藥基因檢出率Fig. 4 Prevalence of seven fluoroquinolones resistance genes in five common Salmonella serotypes with different rresistance phenotypes

相對(duì)而言，7 種基因在印第安納沙門氏菌（oqxB，45.37%；aac(6’)-Ib，50.93%）、德比沙門氏菌（oqxA，45.24%；qnrS，11.90%）和阿貢納沙門氏菌（qnrA，43.75%；qnrB，25.00%）中檢出率較高。

2.3.2 源于不同采樣地點(diǎn)的沙門氏菌中7 種耐藥基因檢出情況

oqxA在源于醫(yī)院的菌株中檢出率（28.57%）最高，其次為超市（27.52%）和農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)（20.81%），但檢出率間無(wú)顯著性差異；在源于醫(yī)院的NAL＋CIP＋型菌株中的檢出率（72.73%）顯著高于其在NAL＋CIP-型（22.50%）和NAL-CIP-型（19.23%）菌株中的檢出率（P＜0.05）（圖5A）。oqxB在源于超市菌株中的檢出率（39.24%）顯著高于其在源于農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)（27.30%）和醫(yī)院（18.18%）的菌株；在源于超市的菌株中，NAL＋CIP＋型（47.69%）和NAL＋CIP-型（41.60%）菌株中的檢出率間無(wú)顯著差異，但顯著高于NAL-CIP-型（26.79%）（P＜0.05）（圖5B）。qepA在源于農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)（3.24%）和超市（3.54%）的菌株中的平均檢出率間無(wú)顯著差異；而在不同耐藥表型的菌株中檢出率間均有顯著差異（P＜0.05）（圖5C）。aac(6’)-Ib在源于醫(yī)院的菌株中的檢出率（37.66%）顯著高于在超市（23.71%）和農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)（21.08%）（P＜0.05）；在源于醫(yī)院的NAL＋CIP＋型菌株中的檢出率（90.91%）顯著高于NAL-CIP-型（30.77%）和NAL＋CIP-型（27.50%）（P＜0.05）（圖5D）。qnrA在源于農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)（24.59%）和超市（29.43%）的菌株種檢出率間無(wú)顯著差異，但顯著高于醫(yī)院（5.17%）菌株檢出率；源于超市的菌株中不同耐藥表型之間差異顯著（P＜0.05）（圖5E）。qnrB在源于農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)（28.11%）和超市（24.52%）的菌株中的檢出率間無(wú)顯著差異，但顯著高于醫(yī)院（5.19%）菌株中的檢出率（P＜0.05）；源于超市的NAL-CIP-型（45.54%）菌株中的檢出率顯著高于NAL＋CIP＋型（13.08%）和NAL＋CIP-型（17.60%）菌株（P＜0.05）（圖5F）。qnrS在源于農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)（10.00%）、超市（10.90%）和醫(yī)院（9.09%）的菌株中的檢出率及在源于該3 類樣點(diǎn)具不同表型的菌株中的檢出率間均無(wú)顯著性差異（圖5G）。

總體而言，7 種基因在源于超市（qnrA，29.43%；qnrB，24.52%；qnrS，10.90%；qepA，3.54%；oqxB，39.24%）和醫(yī)院（aac(6’)-Ib，37.66%；oqxA，28.57%）的菌株中的檢出率較高。

圖5 不同采樣地點(diǎn)具不同耐藥表型的沙門氏菌中7 種耐藥基因的檢出率Fig. 5 Prevalence of seven fluoroquinolones resistance genes in Salmonella with different resistance phenotypes from different sampling places

2.3.3 不同樣品來(lái)源沙門氏菌中7 種基因的檢出情況

oqxA在來(lái)源于豬肉的菌株中的檢出率（31.25%）最高，其次為人糞（28.57%）和雞肉（24.82%），但其檢出率間無(wú)顯著性差異；豬肉源沙門氏菌中NAL＋CIP＋型（60.00%）和NAL-CIP-型（50.00%）菌株中oqxA的檢出率顯著高于NAL＋CIP-型（6.90%）菌株（P＜0.05）（圖6A）。oqxB在雞肉源菌株中的檢出率（39.72%）顯著高于人糞（18.18%）和豬肉（18.75%）源菌株（P＜0.05）；在人糞源NAL＋CIP＋型（63.64%）菌株中的檢出率顯著高于NAL-CIP-型（11.54%）和NAL＋CIP-型（10.00%）菌株（P＜0.05）（圖6B）。qepA在雞肉源NAL-CIP-型（9.40%）菌株中的檢出率顯著高于NAL＋CIP＋型（1.06%）（P＜0.05）（圖6C）。aac(6’)-Ib在人糞源菌株中的檢出率（37.66%）最高，其次為豬肉（31.25%）和雞肉（25.185%）源菌株，但3者間無(wú)顯著差異；人糞源NAL＋CIP＋型（90.91%）菌株中的檢出率顯著高于NAL-CIP-型（30.77%）和NAL＋CIP-型（27.50%）菌株（P＜0.05）（圖6D）。qnrA在雞肉（21.28%）和豬肉（29.69%）源菌株中的檢出率間無(wú)顯著差異，但顯著高于人糞源菌株中的檢出率（5.17%）（P＜0.05）；雞肉源菌株中不同耐藥表型間差異顯著（P＜0.05）（圖6E）。qnrB在雞肉（23.76%）和豬肉（31.25%）源菌株中的檢出率間無(wú)顯著性差異，但顯著（P＜0.05）高于人糞源菌株中的檢出率（6.49%）；雞肉源菌株中不同耐藥表型間差異顯著（P＜0.05）（圖6F）。qnrS在人糞源菌株中的檢出率（23.38%）顯著高于雞肉（7.98%）和豬肉（7.81%）源菌株（P＜0.05）；來(lái)源于人糞中的NAL＋CIP＋型菌株中的檢出率（100.00%）顯著高于NAL-CIP-型（3.85%）和NAL＋CIP-型（15.00%）菌株（P＜0.05）（圖6G）。

圖6 不同樣品來(lái)源且具不同耐藥表型的沙門氏菌中7 種耐藥基因的檢出率Fig. 6 Prevalence of seven fluoroquinolones resistance genes in Salmonella with different resistance phenotypes from different samples

2.3.4 不同地域來(lái)源沙門氏菌中7 種基因的檢出情況

圖7 不同地域來(lái)源且具不同耐藥表型的沙門氏菌中7 種耐藥基因的檢出率Fig. 7 Prevalence of seven genes in Salmonella with different resistance phenotypes from different geographical regions

以秦嶺-淮河為界，把9 省市分為南北方兩個(gè)區(qū)域，陜西、新疆、河南和北京為北方，廣東、廣西、四川、福建和上海為南方。oqxA在南方的菌株中的檢出率（25.24%）略高于北方（24.16%），但其檢出率間無(wú)顯著性差異；在南方3 種耐藥表型菌株中的檢出率間均有顯著差異（P＜0.05）（圖7A）。oqxB在南方菌株中的檢出率（34.19%）略高于北方（30.34%），二者無(wú)顯著差異；在南方3 種不同耐藥表型的菌株中的檢出率間存在顯著差異（P＜0.05）（圖7B）。qepA在北方菌株中的檢出率（4.99%）顯著高于南方；北方NAL-CIP-型菌株中的檢出率顯著較高（P＜0.05）（圖7C）。aac(6’)-Ib在南方菌株中的檢出率（32.53%）顯著（P＜0.05）高于北方（20.96%）；無(wú)論在南方還是北方，NAL＋CIP＋型菌株中的檢出率均顯著高于NAL＋CIP-型和NALCIP-型菌株中的檢出率（P＜0.05）（圖7D）。qnrA在北方菌株中的檢出率（32.53%）顯著高于南方菌株中的檢出率（12.78%）（P＜0.05）；在北方3 種耐藥表型菌株中的檢出率間均有顯著性差異，南方NAL＋CIP＋型（14.00%）和NAL-CIP-型（16.67%）菌株中的檢出率則顯著高于NAL＋CIP-型（9.49%）（P＜0.05）（圖7E）。qnrB在北方菌株中的檢出率（27.74%）顯著高于南方菌株中的檢出率（19.17%）（P＜0.05）；在北方和南方3 種耐藥表型的菌株中的檢出率間均存在一定的差異（P＜0.05）（圖7F）。qnrS在北方菌株中的檢出率（12.77%）顯著（P＜0.05）高于南方（6.39%）；無(wú)論在南方還是北方，在3 種耐藥表型菌株中的檢出率間均有顯著性差異（圖7G）。

2.4 沙門氏菌中與（氟）喹諾酮類抗生素耐藥相關(guān)基因突變

gyrA中檢出221 個(gè)氨基酸突變點(diǎn)，以Ser83Phe/Asp87Gly（21.27%）最為常見，其次分別為Ser83Phe（16.29%）、Asp87Gly（13.57%）、Ser83Tyr（12.22%）、Asp87Tyr（11.31%）、Asp87Asn（10.41%）、Ser83Phe/Asp87Asn（9.95%）、Ser83Tyr/Asp87Gly（2.71%）、Asp87Val（0.90%）、Gly75Phe（0.45%）、Asp87Asn/Ile89Val（0.45%）和Asp87Asn/Val90Gly（0.45%）。parC中檢出214 個(gè)突變點(diǎn)，以Ser80Arg（64.49%）最為常見，其次分別為Thr57Ser（35.05%）和Ser80Arg/Gly72Phe（0.47%）。

沙門氏菌對(duì)（氟）喹諾酮類抗生素的耐藥表型與gyrA和parC氨基酸突變檢出率之間存在著一定的相關(guān)性。如表3所示，219 株同時(shí)耐萘啶酮酸和環(huán)丙沙星的沙門氏菌中共檢出265 個(gè)點(diǎn)突變，占全部點(diǎn)突變的60.50%。對(duì)2 種抗生素同時(shí)產(chǎn)生抗性的沙門氏菌中，gyrA和parC中氨基酸突變點(diǎn)的檢出率顯著高于在其他幾種耐藥表型菌株中突變的檢出率（P＜0.05），表明沙門氏菌和（氟）喹諾酮類抗生素抗性有關(guān)的gyrA和parC中氨基酸突變?cè)蕉?，菌株?duì)（氟）喹諾酮類抗生素的耐藥性就越強(qiáng)。突變的發(fā)生與環(huán)丙沙星的耐藥性關(guān)聯(lián)性更高。

表3 （氟）喹諾酮抗生素抗性沙門氏菌gyrA和parC氨基酸突變Table 3 Mutations in gyrA and parC in fluoroquinolones resistant Salmonella

3 討論與結(jié)論

沙門氏菌血清型種類繁多、菌株復(fù)雜，且其菌型分布具有很強(qiáng)的區(qū)域特點(diǎn)。世界各國(guó)流行的沙門氏菌雖有所差異，但大多以腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、印第安納沙門氏菌和德爾卑沙門氏菌等為主[21-23]。

本研究結(jié)果顯示，存在于我國(guó)食品和部分臨床生物樣品中的沙門氏菌主要為鼠傷寒沙門氏菌（24.08%）、腸炎沙門氏菌（1 9.4 1%）和印第安納沙門氏菌（13.27%），與施開創(chuàng)[24]、張秀麗[25]等和劉謝[26]的血清分型結(jié)果一致，表明鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌和印第安納沙門氏菌在我國(guó)肉類食品中流行廣泛，要嚴(yán)格預(yù)防控制。814 株沙門氏菌涵蓋了83 種血清型，表明市售食物中沙門氏菌的血清型具有較高的多樣性。

各種抗生素藥物的廣泛使用已經(jīng)導(dǎo)致沙門氏菌及其他細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的耐藥狀況十分嚴(yán)重[27-28]。劉渠等[29]對(duì)69 株分離于720 份生肉類樣品中沙門氏菌藥敏性測(cè)定發(fā)現(xiàn)，88.6%、34.77%和5.80%的分離株分別對(duì)1、5 種和11 種以上抗生素產(chǎn)生抗性。吳云鳳等[30]對(duì)分離于204 份肉雞胴體的71 株沙門氏菌的藥敏性檢測(cè)結(jié)果表明沙門氏菌至少對(duì)3 種以上抗生素耐藥，耐3～7 種藥物的菌株比例達(dá)33.8%，耐8～12 種藥物的達(dá)26.8%，耐13～16 種藥物的達(dá)36.6%。本研究結(jié)果與上述結(jié)果以及與潘志明[31]、代娟娟[32]、謝一俊[33]、孫璐[34]等報(bào)道的沙門氏菌對(duì)（氟）喹諾酮類抗生素的耐藥性結(jié)果比較相似，表明沙門氏菌耐藥性的產(chǎn)生已成為當(dāng)前食品安全和公共安全衛(wèi)生領(lǐng)域的核心問題之一。

本研究814 株沙門氏菌中，67.94%的菌株對(duì)萘啶酮酸產(chǎn)生抗性，對(duì)環(huán)丙沙星耐藥的菌株比例為26.90%。郝宏姍等[35]的研究表明63.59%的雞肉源沙門氏菌對(duì)萘啶酮酸產(chǎn)生抗性，21.28%菌株對(duì)環(huán)丙沙星產(chǎn)生抗性，與本研究結(jié)果比較相似。由于萘啶酮酸在動(dòng)物養(yǎng)殖過程使用較多，而環(huán)丙沙星則是沙門氏菌病臨床治療常用藥物，沙門氏菌對(duì)2 種抗生素耐藥率的升高很可能導(dǎo)致臨床治療失敗，加強(qiáng)抗生素的監(jiān)督和監(jiān)管已迫在眉睫。

導(dǎo)致沙門氏菌耐藥性出現(xiàn)的原因很多，質(zhì)粒介導(dǎo)的（氟）喹諾酮抗生素抗性是沙門氏菌耐藥性產(chǎn)生的一個(gè)重要機(jī)制[36]。質(zhì)粒攜帶的與（氟）喹諾酮類藥物耐藥相關(guān)的基因既可縱向傳播，也可橫向傳播（主要通過接合轉(zhuǎn)移方式傳遞給其他細(xì)菌）。除攜帶（氟）喹諾酮類抗生素耐藥基因外，這些質(zhì)粒通常還攜帶可引起其他抗生素耐藥的附加基因[37]。國(guó)內(nèi)外對(duì)沙門氏菌質(zhì)粒介導(dǎo)氟喹諾酮類耐藥相關(guān)基因檢測(cè)結(jié)果顯示，aac(6’)-Ib檢出率為0.05 ～37.1%[38-39]，qnrA檢出率為0qnrB檢出率為0.026 % ～11.34%[38,40-42]，qnrS檢出率為0.57 ～10.29%[38,40-42]，oqxA檢出率為20.2%～51.3%[43]，oqxB檢出率為20.2%～51.3%[43]，大部分報(bào)道中未見有qepA檢出[43-46]。

本研究中，oqxB檢出率（31.82%）最高，aac(6’)-Ib、qnrA、oqxA、qnrB、qnrS和qepA的平均檢出率分別為27.52%、24.94%、24.57%、24.45%、10.32%和3.07%。與同類研究結(jié)果相比，本研究aac(6’)-Ib的檢出率遠(yuǎn)高于其他國(guó)家[38,40,42]，但低于我國(guó)醫(yī)學(xué)臨床菌株中該基因的檢出率（37.1%）[39]。研究中qnrB的檢出率同樣高于一些歐洲國(guó)家[42]，且遠(yuǎn)高于美國(guó)和我國(guó)醫(yī)學(xué)臨床菌株中的檢出率[38,40-41]。qnrA檢出率也明顯高于歐洲[42]。這可能由于qnrA和qnrB主要存在于可轉(zhuǎn)移質(zhì)粒或其他可移動(dòng)基因元件，經(jīng)接合或轉(zhuǎn)導(dǎo)作用在不同的細(xì)菌之間進(jìn)行傳遞的結(jié)果。qnrS的檢出率也高于歐洲一些國(guó)家[42]。7 種常被質(zhì)粒上攜帶的基因的檢出率在沙門氏菌中頻被檢出可能是導(dǎo)致沙門氏菌對(duì)常用（氟）喹諾酮類抗生素耐藥的原因之一。

抗生素靶位編碼基因突變導(dǎo)致表達(dá)產(chǎn)物的空間構(gòu)型與理化性質(zhì)發(fā)生變化，進(jìn)而致使藥物的結(jié)合作用下降或消失是耐藥性產(chǎn)生的另一重要原因。DNA解旋酶亞單位GyrA和拓?fù)洚悩?gòu)酶IV亞單位ParC中的氨基酸突變?cè)谏抽T氏菌對(duì)（氟）喹諾酮類抗生素藥敏性降低及多重耐藥性形成過程中起重要的作用[47]。DNA解旋酶亞單位GyrA氨基酸在83或/和87位點(diǎn)處發(fā)生點(diǎn)突變，parC基因57和80位點(diǎn)發(fā)生突變是細(xì)菌耐萘碇酮酸和環(huán)丙沙星等（氟）喹諾酮類抗生素的主要耐藥機(jī)制，也是本研究中沙門氏菌對(duì)萘啶酮酸和環(huán)丙沙星呈現(xiàn)出高耐藥率的原因之一。本研究在gyrA中檢出221 個(gè)氨基酸突變點(diǎn)，以Ser83Phe-Asp87Gly雙突變（21.27%）最為常見；parC中檢出214 個(gè)突變點(diǎn)，以Ser80Arg（64.49%）突變最為常見，這些突變的發(fā)生在很大程度影響了（氟）喹諾酮類抗生素對(duì)沙門氏菌的作用，導(dǎo)致耐藥性的產(chǎn)生，這可能也是本研究中沙門氏菌對(duì)萘啶酮酸和環(huán)丙沙星呈現(xiàn)出高耐藥率的原因之一。

細(xì)菌耐藥已成為當(dāng)前食品安全和公共安全衛(wèi)生領(lǐng)域的核心問題之一。質(zhì)粒介導(dǎo)的（氟）喹諾酮類抗生素耐藥、DNA解旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶IV氨基酸突變，特別是質(zhì)粒攜帶介導(dǎo)與耐藥性相關(guān)基因的水平傳遞和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致細(xì)菌耐藥的主要原因[48-49]。研究不同食物類型、不同采樣地點(diǎn)和不同血清型的沙門氏菌的藥敏情況及耐藥性產(chǎn)生相關(guān)基因，將有助于設(shè)計(jì)干預(yù)措施減少耐藥的發(fā)生。同時(shí)，也有助于人們?cè)谑秤脛?dòng)物用藥上作出慎重的選擇，控制耐藥菌株的傳播，減少和防止沙門氏菌耐藥性的產(chǎn)生，對(duì)保障食品安全和保證人類健康具有重要意義。