易思華，張 媱，孫燕飛，李 楊，馮 麗

（石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 石河子 832000）

羊肚菌隸屬子囊菌亞門(mén)（Ascomycotina） 盤(pán)菌綱（Discomycetes） 盤(pán)菌目 （Peziales） 羊肚菌科（Morchellaceae） 羊肚菌屬 （Morchella）[1]，是世界性分布的名貴稀有食用菌，具有較大的食用和藥用價(jià)值，因此被人們所廣泛喜愛(ài)。因其子實(shí)體菌蓋呈“蜂窩”狀，形似羊肚而得名羊肚菌[2]。

新疆天山山脈地區(qū)得天獨(dú)厚的地理?xiàng)l件為羊肚菌提供了良好的生長(zhǎng)環(huán)境，擁有豐富的野生羊肚菌資源[3]。該地區(qū)野生羊肚菌分布范圍廣泛，普遍生長(zhǎng)于海拔800 m～2 300 m的山坡、低山和中山處；生境多為針葉林、闊葉林、混交林常見(jiàn)的闊葉林有櫟樹(shù)、白樺、柳樹(shù)等，針葉樹(shù)主要樹(shù)種有冷杉、油杉、云杉等[4]；有時(shí)在林緣草地及河灘草地，甚至在腐朽的樹(shù)根周圍、溪邊、巖石旁等處也常常能找到羊肚菌的“蹤跡”[5]。

傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類方法，根據(jù)菌蓋中部與菌柄是否分離、菌蓋邊緣是否明顯向外伸展、菌蓋的形狀和顏色、菌蓋棱紋排列和凹坑的深淺等性狀，可以進(jìn)行初步鑒定[6]。有關(guān)新疆野生羊肚菌的分類研究，大多采用常規(guī)形態(tài)學(xué)原理分類，但因野生羊肚菌在生長(zhǎng)過(guò)程中子實(shí)體形態(tài)受環(huán)境影響會(huì)發(fā)生很大變化，導(dǎo)致了分類不準(zhǔn)確。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，真菌分類和系統(tǒng)發(fā)育研究也發(fā)生了革命性的變革[7]，近年，ITS（internal transcribed spacer） 技術(shù)廣泛應(yīng)用于真菌分類及系統(tǒng)發(fā)育的研究。菌物學(xué)家將羊肚菌屬分為三大類，即黑色羊肚菌類、黃色羊肚菌類和半開(kāi)羊肚菌類[8]，而新疆野生羊肚菌已鑒定出的有小羊肚菌、高羊肚菌、羊肚菌、高柄羊肚菌、黑脈羊肚菌、離柄羊肚菌等[9]；趙震宇[10]在《新疆食用菌志》中記錄了黑脈羊肚菌，圓錐羊肚菌、羊肚菌、小羊肚菌、皺柄羊肚菌；卯曉嵐[11]在《中國(guó)大型真菌原色圖鑒》中記錄了新疆地區(qū)黑脈羊肚菌、尖頂羊肚菌、羊肚菌、粗腿羊肚菌、高羊肚菌。總體來(lái)說(shuō)，文獻(xiàn)報(bào)道新疆地區(qū)發(fā)現(xiàn)并鑒定出來(lái)的野生羊肚菌大多都分布于新疆伊犁、烏魯木齊、石河子、塔城、阿勒泰、哈密地區(qū)[12-19]。本試驗(yàn)中，以2016年～2018年間采自新疆石河子、呼圖壁、阜康、伊犁、沙灣地區(qū)的部分羊肚菌為材料，提取其基因組DNA，進(jìn)行ITS序列比對(duì)分析，構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，深入探究了新疆野生羊肚菌菌株的種屬及分類地位，確定了新疆地區(qū)未鑒定的野生羊肚菌資源，旨在進(jìn)一步明確新疆地區(qū)野生羊肚菌資源分布，以便為實(shí)現(xiàn)新疆地區(qū)野生羊肚菌的馴化、育種及商業(yè)化人工栽培奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 野生羊肚菌菌株及來(lái)源

2016年～2018年4下旬至6月中旬，赴新疆石河子、呼圖壁、阜康、伊犁、瑪納斯、沙灣地區(qū)采集到52株野生羊肚菌，從中選擇10株樣品進(jìn)行詳細(xì)分析，依次編號(hào)為M1～M10，樣品采集地生境信息見(jiàn)表1。

表1 野生羊肚菌樣品采集地生境Tab.1 Habitat of wild Morchella samples

1.1.2 主要試劑

2×Easy Taq Mix（北京康為世紀(jì)生物公司）、Gold view（北京索萊寶科技有限公司）、ITS1[5’-(TCCGTAGGTGAACCTGCGG)-3’]、ITS4[5’-（CAGG AGACTTGTACACGG）-3’]引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 野生羊肚菌形態(tài)學(xué)初步鑒定

觀察野生羊肚菌子實(shí)體形狀、大小、顏色和脈紋等形態(tài)特征，參照《大型真菌圖鑒》[20]，初步鑒定52份野生羊肚菌。選擇其中10株進(jìn)一步進(jìn)行ITS分析。

1.2.2 組織分離與純化

將10個(gè)羊肚菌子實(shí)體沖洗干凈、晾干。在超凈工作臺(tái)中，用75%酒精反復(fù)緩慢沖洗子實(shí)體30 s，后用無(wú)菌水沖洗3次，用無(wú)菌吸水紙將子實(shí)體表面水分吸干。使用無(wú)菌的手術(shù)刀片切取子實(shí)體內(nèi)部組織，接種在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）試管斜面上，室溫、黑暗培養(yǎng)1周后挑取菌絲生長(zhǎng)點(diǎn)部位轉(zhuǎn)接至新的PDA試管中，直至培養(yǎng)基中無(wú)雜菌生長(zhǎng)，即獲得野生羊肚菌純菌絲。

1.2.3 菌株基因組DNA提取

采用CTAB改良法，從試管斜面刮取50 mg左右菌絲體于2 mL無(wú)菌EP管中，加入CTAB抽提液500 μL 與酚和氯仿-異戊醇 （24∶1） 各 250 μL，并加入適量無(wú)菌石英砂，置于280 r·min-1搖床中常溫抽提40 min；12 000 r·min-1室溫離心10 min后，小心吸取上清液600 μL于1.5 mL無(wú)菌EP管中，加入3 mol·L-1醋酸鈉 60 μL 與異丙醇 660 μL，混勻后室溫沉淀2 h；10 000 r·min-1離心5 min，棄上清；加入 70%乙醇 200 μL漂洗，10 000 r·min-1離心 5 min，棄上清；加入200 μL無(wú)水乙醇漂洗，10 000 r·min-1離心5 min，棄上清；超凈工作臺(tái)中吹干，加入無(wú)菌水30 μL溶解，冰箱-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 ITS 區(qū)擴(kuò)增及 ITS 測(cè)序

ITS-PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為20 μL：2×Easy Taq Mix 10 μL、ITS1和 ITS4 引物各 1 μL、模板 DNA 2 μL、ddH2O 6 μL。PCR程序設(shè)定為：預(yù)變性，94℃，10 min；變性，94℃，1 min；退火，56℃，45 s；延伸，72℃，1 min；延伸，72℃，10 min；30個(gè)循環(huán)。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，使用凝膠成像儀拍照，最后將PCR產(chǎn)物送生物技術(shù)公司測(cè)序。

1.2.5 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

利用 MEGA 6.0、Align by-ClustalW 程序進(jìn)行多序列比對(duì)，手動(dòng)刪除不合群序列[21]，選擇Neighbor-Joining法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)[22]，選擇Bootstrp method作為構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)的檢驗(yàn)方法[23]，檢驗(yàn)次數(shù)設(shè)置為1 000，遺傳距離計(jì)算模型設(shè)置為p-diatance,選擇pairwise處理序列中的空位與缺失，得出構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)。

2 研究結(jié)果與分析

2.1 野生羊肚菌子實(shí)體形態(tài)特征

野生羊肚菌子實(shí)體形態(tài)特征見(jiàn)圖1。

圖1 野生羊肚菌子實(shí)體性狀Fig.1 Wild Morchella sporocarp characters

如圖1所示，野生羊肚菌的生長(zhǎng)對(duì)周圍環(huán)境條件要求極為苛刻，由于新疆不同地區(qū)氣候差異較大，采集自新疆石河子、呼圖壁、阜康、伊犁、瑪納斯、沙灣地區(qū)的羊肚菌子實(shí)體形態(tài)也各有差異。

對(duì)初步分類所得的10株野生羊肚菌進(jìn)行子實(shí)體特征描述，詳見(jiàn)表2。

如表2所示，樣品M3、M4、M8的菌蓋形狀為球狀，頂端呈橢圓狀；樣品M2、M3、M4、M5、M6、M7的菌蓋顏色均為黑色，樣品M1、M8、M9、M10的菌蓋顏色均為黃色，10個(gè)樣品菌蓋與菌柄長(zhǎng)度比基本一致。

2.2 ITS擴(kuò)增分析

根據(jù)Wipf[24]等對(duì)黃色羊肚菌和黑色羊肚菌ITS序列的研究，可知黑色羊肚菌的ITS序列長(zhǎng)度在740 bp～750 bp之間；黃色羊肚菌的ITS序列長(zhǎng)度在1 150 bp～1 220 bp之間。10個(gè)樣品的PCR檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖2可知，本試驗(yàn)中樣品M8、M9、M10在1 100 bp左右有明亮且清晰的條帶；樣品M6、M7在750 bp左右有明亮且清晰的條帶，與Wipf所報(bào)道的結(jié)果基本一致。

2.3 進(jìn)化樹(shù)分析

樣品的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖3。

表2 野生羊肚菌樣品形態(tài)特征Tab.2 Morphological characteristics of wild Morchella samples

圖2 野生羊肚菌樣品ITS片段檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Amplified ITS fragment of wild Morchella samples

圖3 基于ITS序列構(gòu)建的羊肚菌菌種間系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.3 Phylogenetic analysis of Morchella species based on ITS sequences

如圖3所示，以皺蓋鐘菌（Verpa bohemica） 作為外群，進(jìn)化樹(shù)的根部分支出黑色羊肚菌支系（group 1）、黃色羊肚菌支系（group 2） 和外群3支。通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析，羊肚菌M8、M9、M10均聚類在黃色羊肚菌支系（group 2） 上，即推斷其都屬于黃色羊肚菌。其中羊肚菌M8以76%的Bootstrap聚在羊肚菌（Morchella Mes-X） 分支上，說(shuō)明M8的ITS序列與羊肚菌極為相似，而羊肚菌屬于黃色羊肚菌，由此可進(jìn)一步確定M8為黃色羊肚菌[25]。羊肚菌M9以100%的Bootstrap聚在美味羊肚菌（Morchella esculenta）分支上，說(shuō)明它們之間親緣關(guān)系較近，可確定羊肚菌M9就是美味羊肚菌。編號(hào)為M1、M2、M3、M4、M5、M6、M7的羊肚菌均聚類在黑色羊肚菌支系（group 1） 上，它們都屬于黑色羊肚菌。其中采自沙灣鹿角灣地區(qū)的羊肚菌M7以81%的Bootstrap聚在高羊肚菌（Morchella elata)分支上，可確定M7是高羊肚菌；羊肚菌M5以100%的Bootstrap聚在黑脈羊肚菌（Morchella angusticeps)分支上，可確定M5是黑脈羊肚菌。采自阜康地區(qū)的羊肚菌M6以100%的Bootstrap聚在梯棱羊肚菌（Morchella importuna)分支上，表明M6的ITS序列與梯棱羊肚菌的ITS序列之間差異很小，可確定羊肚菌M6為梯棱羊肚菌。

3 討論

目前，傳統(tǒng)經(jīng)典形態(tài)分類學(xué)方法已經(jīng)非常完善了，但因羊肚菌的生長(zhǎng)對(duì)周圍生長(zhǎng)環(huán)境條件極其敏感，子實(shí)體形態(tài)不一，使用傳統(tǒng)經(jīng)典形態(tài)分類學(xué)以及單一的ITS序列鑒定常常不準(zhǔn)確，因此要求我們尋求更多更可靠的辦法為羊肚菌的分類研究提供新的更可信的依據(jù)，該結(jié)論在韓鵬遠(yuǎn)等[26]在山西中南部地區(qū)羊肚菌資源研究中也得到證實(shí)，現(xiàn)在可采用rpb1、rbp2、ef1-α等多基因片段聯(lián)合，進(jìn)行野生羊肚菌更加準(zhǔn)確的物種界定[27]。

本試驗(yàn)采自伊犁察布查爾縣地區(qū)的野生羊肚菌M5是黑脈羊肚菌（Morchella angusticeps)，鑒定結(jié)果與武冬梅采自伊犁察布查爾縣的羊肚菌一致；目前新疆石河子采集并鑒定的野生羊肚菌有2種，即尖頂羊肚菌、黑脈羊肚菌，本試驗(yàn)采自石河子不同地區(qū)的野生羊肚菌M9鑒定為美味羊肚菌（Morchella esculenta），該種羊肚菌在新疆石河子地區(qū)從未報(bào)道過(guò)。

新疆北部地區(qū)各地特殊的小氣候?yàn)檠蚨蔷陌l(fā)生提供了良好條件，因此新疆地區(qū)成為了我國(guó)羊肚菌資源和種類最豐富的地區(qū)之一，羊肚菌產(chǎn)業(yè)在新疆地區(qū)具有巨大潛力。目前，對(duì)新疆地區(qū)羊肚菌的研究正處于探索階段，深入而廣泛的野生羊肚菌資源調(diào)查是非常必要的。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)中采用傳統(tǒng)經(jīng)典形態(tài)學(xué)分類與核糖體DNA轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS） 序列分析技術(shù)結(jié)合的方法，確定羊肚菌M8（MK752768）、M10（MK757602） 均屬于黃色羊肚菌，M9（MK757633）是美味羊肚菌；羊肚菌 M1（MK757636）、M2（MK757644）、M3（MK757642）、M4（MK757646） 均屬于黑色羊肚菌。M5 （MK757657） 是黑脈羊肚菌；M6 （MK757608）是梯棱羊肚菌；M7（MK757626）是高羊肚菌，新疆天山山脈地區(qū)野生羊肚菌資源豐富。