呂 芳，辛美麗，丁 剛，吳海一,3

( 1.山東省海洋生物研究院，山東省大型海藻資源保護(hù)與應(yīng)用工程技術(shù)研究中心，山東 青島 266104; 2.青島市大型海藻工程技術(shù)研究中心, 山東 青島 266104; 3.山東省海水養(yǎng)殖病害防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266104 )

隨著重金屬在農(nóng)業(yè)、工業(yè)以及化學(xué)上的廣泛應(yīng)用，重金屬污染日益加劇，產(chǎn)生了嚴(yán)重的環(huán)境問(wèn)題。鎘是重金屬中毒性較強(qiáng)的元素之一，是植物非必需元素，具有蓄積性，難以去除，且能沿著食物鏈轉(zhuǎn)移富集，對(duì)生物造成毒害[1]。大型海藻作為海洋生態(tài)系統(tǒng)的初級(jí)生產(chǎn)者, 對(duì)海水中的重金屬具有高效的富集能力[2-5]，在近海污染修復(fù)方面顯示出廣闊的應(yīng)用前景，具有顯著而獨(dú)特的環(huán)境生態(tài)效益。

抗壞血酸是植物體內(nèi)廣泛存在的一種小分子物質(zhì)，在植物抗氧化清除自由基、光合作用、細(xì)胞生長(zhǎng)和分裂等植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中有著非常重要的生物功能[6-8]。研究表明，一定量的抗壞血酸對(duì)逆境脅迫下植物的生長(zhǎng)發(fā)育、生理代謝、抗氧化系統(tǒng)、超微結(jié)構(gòu)等有明顯的改善作用[9-10]，從而增強(qiáng)其對(duì)環(huán)境脅迫的耐受性。有關(guān)植物受重金屬鎘毒害及植物體內(nèi)緩解鎘脅迫的機(jī)理已有一些相關(guān)報(bào)道[11-12]，結(jié)果顯示，抗壞血酸能有效緩解鎘對(duì)植物的毒害，但關(guān)于抗壞血酸緩解大型海藻重金屬脅迫的研究則較少。

鼠尾藻(Sargassumthunbergii)，屬褐藻門、馬尾藻科，是我國(guó)沿海常見的經(jīng)濟(jì)海藻，不僅可以作為海參、鮑魚等水產(chǎn)動(dòng)物的優(yōu)質(zhì)餌料，還可以作為工業(yè)原料用于提取褐藻膠及其他生物活性物質(zhì)。前期研究表明，鼠尾藻對(duì)重金屬鎘具有較強(qiáng)的富集能力，是海洋生態(tài)環(huán)境修復(fù)的理想生物材料[2]，但鎘含量較高時(shí)會(huì)對(duì)鼠尾藻的生長(zhǎng)和生理產(chǎn)生明顯的抑制效應(yīng)，大大降低其修復(fù)鎘污染的效率[13]。筆者在前期研究的基礎(chǔ)上，探討外源抗壞血酸對(duì)鎘脅迫下鼠尾藻的生長(zhǎng)和抗氧化指標(biāo)的影響，旨在為進(jìn)一步探明大型海藻對(duì)重金屬耐受的生理機(jī)制和在重金屬脅迫下外源抗壞血酸對(duì)海藻的解毒機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

鼠尾藻于2017年4月6日采自山東省青島市太平灣潮間帶(N 36°05′, E 120°35′)。用低溫箱運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，經(jīng)海水反復(fù)清洗去除泥沙及雜質(zhì)后，置于溫度15 ℃、光照度2000 lx、光周期12L∶12D的循環(huán)水箱中充氣暫養(yǎng)，5 d后用于試驗(yàn)。選取生長(zhǎng)健壯、形態(tài)和規(guī)格較一致[長(zhǎng)度(5.0±0.5) cm、質(zhì)量(1.0±0.1) g]的個(gè)體作為試驗(yàn)材料。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)在容積為1000 mL的三角瓶中進(jìn)行，每個(gè)三角瓶放置3株藻體及800 mL培養(yǎng)液，培養(yǎng)液為過(guò)濾海水，添加5.0 mg/L CdCl2·2.5H2O (鎘質(zhì)量濃度由預(yù)備試驗(yàn)得到)和不同質(zhì)量濃度的抗壞血酸進(jìn)行處理。參照文獻(xiàn)[13]及預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果，試驗(yàn)分組如下：

空白對(duì)照組；鎘脅迫組：5.0 mg/L CdCl2·2.5H2O；20 mg/L抗壞血酸緩解組：5.0 mg/L CdCl2·2.5H2O+20 mg/L抗壞血酸；40 mg/L抗壞血酸緩解組：5.0 mg/L CdCl2·2.5H2O+40 mg/L抗壞血酸；60 mg/L抗壞血酸緩解組：5.0 mg/L CdCl2·2.5H2O+60 mg/L抗壞血酸；80 mg/L抗壞血酸緩解組：5.0 mg/L CdCl2·2.5H2O+80 mg/L抗壞血酸；100 mg/L抗壞血酸緩解組：5.0 mg/L CdCl2·2.5H2O+100 mg/L抗壞血酸。

每個(gè)處理3個(gè)平行，培養(yǎng)條件同暫養(yǎng)條件，每日更換培養(yǎng)液，培養(yǎng)5 d后進(jìn)行如下指標(biāo)測(cè)定。

1.3 生物量的測(cè)定

生物量的測(cè)定以比生長(zhǎng)速率[14]表示，取出各處理組的藻體，用濾紙吸干藻體表面的水分，稱得鮮質(zhì)量，計(jì)算公式如下：

比生長(zhǎng)速率/%·d-1=[(mt/m0)1/t-1]×100%

式中，mt為試驗(yàn)結(jié)束時(shí)藻體鮮質(zhì)量(g)，m0為試驗(yàn)開始時(shí)藻體鮮質(zhì)量(g)，t為培養(yǎng)時(shí)間(d)。

1.4 鎘含量的測(cè)定

鼠尾藻用雙蒸水充分清洗后，用濾紙吸干藻體表面的水分，取2 g研磨成勻漿狀，采用微波消解后，用原子吸收光譜儀(Thermo Scientific iCE 3500)測(cè)定。

1.5 光合色素(葉綠素a和類胡蘿卜素)、可溶性糖和可溶性蛋白的測(cè)定

光合色素參照文獻(xiàn)[15]的方法測(cè)定，取0.1 g新鮮藻體研磨成勻漿狀，加入8 mL 80%丙酮置于4 ℃黑暗處抽提24 h。4000 r/min、4 ℃離心10 min棄沉淀，上清液用80%丙酮定容至10 mL。以80%丙酮作為空白對(duì)照，測(cè)定665、652、510、480 nm波長(zhǎng)處的吸光值(OD)。重復(fù)3次以上，計(jì)算平均值。按下式計(jì)算葉綠素a含量及類胡蘿卜素含量：

葉綠素a含量/mg·g-1=(16.29OD665-8.54OD652)×V/m/1000

類胡蘿卜素含量/mg·g-1=7.6×(OD480-1.49×OD510)×V/m/1000

式中，V為浸提丙酮的體積(mL)，m為藻體質(zhì)量(g)。

可溶性糖采用南京建成植物可溶性糖檢測(cè)試劑盒蒽酮比色法測(cè)定，取0.2 g新鮮藻體在液氮中研磨成勻漿狀，加8 mL蒸餾水后于80 ℃水浴30 min，冷卻后離心定容至10 mL，作為待測(cè)溶液。

可溶性蛋白采用南京建成蛋白檢測(cè)試劑盒考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定，取1 g藻體在液氮中研磨成勻漿狀，加蒸餾水后離心定容到10 mL，作為待測(cè)溶液。

1.6 抗氧化系統(tǒng)的測(cè)定

超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶的活性和丙二醛含量的測(cè)定均用南京建成生物工程研究所試劑盒測(cè)定。取1 g新鮮藻體用液氮研磨成勻漿狀，加入4 mL提取液(50 mmol/L磷酸緩沖液，pH 7.0；0.1% Triton X-100；1% PVP)[16], 離心取上清液作為待測(cè)溶液。

1.7 數(shù)據(jù)分析

所得數(shù)值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。顯著性差異用單因素方差分析，分析軟件為SPSS 13.0，當(dāng)P<0.05時(shí)為顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源抗壞血酸對(duì)鎘脅迫下鼠尾藻生長(zhǎng)的影響

不同質(zhì)量濃度抗壞血酸處理對(duì)鎘脅迫下鼠尾藻生長(zhǎng)的影響見圖1。5.0 mg/L鎘處理嚴(yán)重影響了鼠尾藻的生長(zhǎng)，與空白對(duì)照組相比，比生長(zhǎng)速率下降了58.01%；加入不同濃度的抗壞血酸后，藻體的比生長(zhǎng)速率均有了顯著提高，并且比生長(zhǎng)速率隨著抗壞血酸質(zhì)量濃度的增加呈現(xiàn)先增后略降的趨勢(shì)，以80 mg/L抗壞血酸處理下的比生長(zhǎng)速率最高。

圖1 外源抗壞血酸對(duì)鎘脅迫下鼠尾藻生長(zhǎng)的影響 圖中線上不同字母表示有顯著性差異(P<0.05).下同.

2.2 外源抗壞血酸對(duì)鎘脅迫下鼠尾藻鎘含量的影響

5.0 mg/L 鎘處理5 d 后，鼠尾藻體內(nèi)的鎘含量達(dá)到了68 μg/g，而加入20 mg/L抗壞血酸后，鼠尾藻體內(nèi)鎘含量降至52 μg/g，且隨著加入抗壞血酸質(zhì)量濃度的增大，鼠尾藻體內(nèi)鎘含量逐漸降低，當(dāng)加入80 mg/L 抗壞血酸時(shí)，降至最低值37 μg/g，比單一鎘處理降低了45.59% (P<0.05)，而加入100 mg/L抗壞血酸時(shí)，藻體內(nèi)鎘含量又略有升高，為43 μg/g(圖2)。

圖2 外源抗壞血酸對(duì)鎘脅迫下鼠尾藻鎘含量的影響

2.3 外源抗壞血酸對(duì)鎘脅迫下鼠尾藻葉綠素a、類胡蘿卜素、可溶性糖和可溶性蛋白含量的影響

5.0 mg/L鎘脅迫下，鼠尾藻藻體顏色變淺，經(jīng)測(cè)定葉綠素a和類胡蘿卜素的含量與對(duì)照相比分別降低24.90%和23.43%，抗壞血酸加入后，除抗壞血酸質(zhì)量濃度為20 mg/L的試驗(yàn)組類胡蘿卜素的含量略有下降外，其余均顯著升高，而且隨著加入抗壞血酸質(zhì)量濃度的增加，均呈先增后略降的趨勢(shì)，抗壞血酸質(zhì)量濃度為80 mg/L時(shí)達(dá)到峰值，葉綠素a和類胡蘿卜素的含量較單一鎘處理分別增加24.46%和15.89%(圖3a, 3b)。

可溶性糖的含量在5.0 mg/L鎘脅迫5 d時(shí)顯著升高，20 mg/L抗壞血酸加入后，變化不明顯(P>0.05)；40、60 mg/L抗壞血酸加入后，藻體可溶性糖含量顯著下降，但兩組之間差異不顯著(P>0.05)；抗壞血酸質(zhì)量濃度80、100 mg/L處理組可溶性糖的含量進(jìn)一步下降，兩組之間差異不顯著(P>0.05) (圖3c)。

可溶性蛋白含量在5.0 mg/L鎘脅迫下顯著下降，僅為對(duì)照組的40.65%，而外源抗壞血酸處理顯著緩解了這種下降趨勢(shì)，可溶性蛋白的含量均顯著升高，抗壞血酸質(zhì)量濃度為20～60 mg/L的試驗(yàn)組間差異不顯著(P>0.05)，抗壞血酸質(zhì)量濃度為80 mg/L的試驗(yàn)組緩解作用最顯著(圖3d)。

2.4 外源抗壞血酸對(duì)鎘脅迫下鼠尾藻超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶活性和丙二醛含量的影響

鎘脅迫導(dǎo)致鼠尾藻超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶的活性和丙二醛含量顯著增加，外加抗壞血酸后，超氧化物歧化酶活性在抗壞血酸質(zhì)量濃度≥60 mg/L時(shí)開始顯著下降，且80 mg/L時(shí)最低(圖4a)；過(guò)氧化氫酶活性在低質(zhì)量濃度抗壞血酸(≤40 mg/L)試驗(yàn)組中顯著升高，≥60 mg/L時(shí)又逐漸下降(P<0.05) (圖4b)；丙二醛含量在抗壞血酸質(zhì)量濃度為20～60 mg/L的組間沒有顯著變化，≥80 mg/L的試驗(yàn)組中才顯著下降(P<0.05) (圖4c)。

圖3 外源抗壞血酸對(duì)鎘脅迫下鼠尾藻葉綠素a、類胡蘿卜素、可溶性糖、可溶性蛋白含量的影響

圖4 外源抗壞血酸對(duì)鎘脅迫下鼠尾藻抗氧化系統(tǒng)的影響

3 討 論

3.1 外源抗壞血酸對(duì)鎘脅迫下鼠尾藻生長(zhǎng)的影響

利用生物監(jiān)測(cè)水體的重金屬污染，可用于評(píng)估海洋環(huán)境中重金屬對(duì)該地域或生物的污染狀況[17]。吳海一等[2]研究發(fā)現(xiàn)，鼠尾藻對(duì)重金屬鎘具有較強(qiáng)的富集能力，而且藻體積累金屬離子的量與外界環(huán)境的金屬離子質(zhì)量濃度正相關(guān)，因此可以作為一種指示生物，用于監(jiān)測(cè)海洋環(huán)境重金屬污染狀況。鎘是植物非營(yíng)養(yǎng)元素，高含量下嚴(yán)重阻礙大型海藻的生長(zhǎng)，給藻體帶來(lái)了一系列生理效應(yīng)[17-20]。本試驗(yàn)結(jié)果也顯示，5.0 mg/L 鎘處理下，鼠尾藻體內(nèi)鎘的含量顯著升高，藻體生長(zhǎng)受到顯著抑制，其生物量、可溶性蛋白的含量顯著低于對(duì)照組，可溶性糖含量顯著升高，誘導(dǎo)組織產(chǎn)生大量的活性氧，藻體的抗氧化酶(超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶)活性升高，膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛大量生成。

3.2 外源抗壞血酸對(duì)鎘脅迫下鼠尾藻藻體生化特性的影響

光合生理特征的變化是衡量大型海藻生長(zhǎng)狀況的首要指標(biāo)，對(duì)光合作用的抑制也是鎘對(duì)藻體產(chǎn)生的主要毒害作用之一[18,21]。本研究發(fā)現(xiàn)，鼠尾藻在鎘脅迫下，葉綠素a和類胡蘿卜素的含量均顯著下降，這可能是色素合成系統(tǒng)對(duì)重金屬毒害的一種應(yīng)激反應(yīng)，也可能是色素體被破壞降解。葉綠素a是大型海藻最重要的光合色素, 因此光合作用的強(qiáng)弱與藻體中葉綠素a的含量息息相關(guān)，因此葉綠素a含量的降低將直接導(dǎo)致光合速率的下降。而類胡蘿卜素不僅作為輔助色素參與吸收傳遞光能的過(guò)程，而且是植物體內(nèi)非酶促抗氧化系統(tǒng)，能夠有效地清除活性氧，防止膜脂的過(guò)氧化，維持膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，進(jìn)而起到保護(hù)作用[22]。因此，推測(cè)類胡蘿卜素含量的減少不僅是合成受到了抑制，而且與其參與抗氧化反應(yīng)有關(guān)。加入適當(dāng)質(zhì)量濃度的抗壞血酸后，葉綠素a和類胡蘿卜素的含量均顯著增加，表明抗壞血酸可以緩解鎘對(duì)葉綠體的破壞作用，有助于提高葉綠體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，對(duì)光合色素具有保護(hù)效應(yīng)，從而維持藻體的光合能力。

可溶性蛋白和可溶性糖是植物體內(nèi)重要的基礎(chǔ)物質(zhì)，在植物體的各種生理活動(dòng)和功能中起著重要作用，其含量的變化是衡量植物代謝水平的重要指標(biāo)[23]。本研究中，鎘脅迫下，鼠尾藻可溶性蛋白的含量較對(duì)照顯著減少，而可溶性糖大量累積，說(shuō)明鼠尾藻對(duì)鎘有一定的耐受性，在一定范圍內(nèi)可以通過(guò)主動(dòng)積累可溶性糖來(lái)降低鎘的毒害，但該質(zhì)量濃度下卻影響了蛋白質(zhì)的合成，或者重金屬與巰基結(jié)合而導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性失活。而加入適當(dāng)質(zhì)量濃度的抗壞血酸后，可溶性蛋白的含量有所回升，可溶性糖含量上升的幅度有所減弱，這也從另一個(gè)角度說(shuō)明適宜質(zhì)量濃度的外源抗壞血酸在一定程度上減輕了鎘對(duì)鼠尾藻藻體的脅迫強(qiáng)度。

3.3 外源抗壞血酸對(duì)鎘脅迫下鼠尾藻抗氧化系統(tǒng)的影響

植物在逆境下，細(xì)胞內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧，進(jìn)而通過(guò)提高相關(guān)抗氧化酶的活性來(lái)清除過(guò)多的活性氧，從而使植物細(xì)胞免受毒害[24]。超氧化物歧化酶是植物抗氧化的第一道防線，對(duì)于清除活性氧具有重要的作用[25]。而過(guò)氧化氫酶的主要功能是清除細(xì)胞質(zhì)中產(chǎn)生的過(guò)氧化氫,從而有效防止過(guò)氧化氫在植物體內(nèi)的積累。超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶協(xié)同作用, 可排除這些氧化產(chǎn)物對(duì)植物細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的潛在傷害。5.0 mg/L 鎘脅迫下，藻體超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶活性顯著升高，以抵抗藻細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的過(guò)多氧自由基，進(jìn)而適應(yīng)逆境。而加入一定質(zhì)量濃度抗壞血酸(≤40 mg/L)后，藻體超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶的活性仍維持在較高的水平，加入抗壞血酸的質(zhì)量濃度≥60 mg/L時(shí)，超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶的活性有所下降，原因可能是適宜含量的抗壞血酸緩解了藻體的脅迫，使藻細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的氧自由基減少，進(jìn)而誘導(dǎo)產(chǎn)生的超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶減少。另一方面，抗壞血酸也是一種抗氧化劑，可直接同活性氧反應(yīng), 將其還原或者作為酶的底物在活性氧清除中發(fā)揮重要作用[26]。

Singh等[27]研究指出，植物細(xì)胞膜是重金屬毒害作用的主要位點(diǎn)，即發(fā)生膜脂過(guò)氧化。丙二醛是發(fā)生膜脂過(guò)氧化的產(chǎn)物之一，其含量的高低可用于衡量植物細(xì)胞膜脂過(guò)氧化程度和對(duì)逆境條件耐受的強(qiáng)弱[28-29]。本試驗(yàn)中，鼠尾藻在鎘脅迫下，由于藻體內(nèi)的自由基累積量增加, 直接導(dǎo)致了膜脂過(guò)氧化, 從而使膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛含量也隨之增加，說(shuō)明此質(zhì)量濃度鎘對(duì)鼠尾藻造成明顯的氧化損傷。隨著適當(dāng)質(zhì)量濃度抗壞血酸的加入，鼠尾藻對(duì)鎘的吸收顯著降低，同時(shí)藻體內(nèi)抗氧化酶的活性升高(圖4)，因此抑制了脂質(zhì)過(guò)氧化和膜系統(tǒng)傷害程度, 從而降低了丙二醛的含量，這與在一些高等植物上的研究結(jié)果是一致的[30-31]。

4 結(jié) 論

綜上所述，加入適當(dāng)質(zhì)量濃度的抗壞血酸使5.0 mg/L 鎘脅迫下鼠尾藻的比生長(zhǎng)速率增加，體內(nèi)富集鎘的含量顯著降低，提高了葉綠素a、類胡蘿卜素及可溶性蛋白的含量和抗氧化酶(超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶)活性，同時(shí)降低細(xì)胞內(nèi)可溶性糖大量累積和膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛的含量，能在一定程度上緩解重金屬鎘脅迫對(duì)藻體的毒害，從而增強(qiáng)了鼠尾藻對(duì)重金屬鎘脅迫的耐受性，且以80 mg/L 抗壞血酸的緩解效果最好。