宋丹丹，王 龍，魏紅靜，史文競，朱傳坤

( 淮陰師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，江蘇省特色水產(chǎn)繁育工程實驗室，江蘇省區(qū)域現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與環(huán)境保護協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 淮安 223300 )

克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)，俗稱小龍蝦，屬節(jié)肢動物門、甲殼動物亞門、十足目、蝲蛄科、原螯蝦屬，原產(chǎn)于北美，后經(jīng)日本引入我國[1]?？耸显r具有生長迅速、生命力強、數(shù)量增長快、耐運輸、易銷售、市場價值高等優(yōu)點，成為我國重要的水產(chǎn)經(jīng)濟物種[2]。除具有很高的食用價值之外，克氏原螯蝦蝦殼中富含鈣、磷、鐵等多種重要營養(yǎng)元素，可以加工為飼料添加劑；此外，從蝦殼中提取的蝦青素、甲殼素制備的殼聚糖等也是重要的工業(yè)原料，在多個領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用[3]。

微衛(wèi)星又稱簡單序列重復(fù)，它是由少數(shù)幾個核苷酸(大多數(shù)為2～6個)為單位多次串聯(lián)重復(fù)的DNA序列，根據(jù)串聯(lián)重復(fù)是否連續(xù)，微衛(wèi)星序列可以分為完美型、非完美型和復(fù)合型3類[4]。微衛(wèi)星標記具有分布廣泛、多態(tài)性高、PCR擴增簡單、節(jié)約樣品、易檢測、共顯性等優(yōu)點，已在多種水生生物群體遺傳結(jié)構(gòu)分析[5]、親子鑒定[6]、遺傳圖譜構(gòu)建及數(shù)量性狀位點定位[7]等研究中得到廣泛應(yīng)用。常用的微衛(wèi)星獲取方法主要包括：從公共數(shù)據(jù)庫獲取，從近緣物種跨種篩選及從基因組中自主開發(fā)等[8]。目前，克氏原螯蝦中已有微衛(wèi)星標記開發(fā)的報道[9-10]，但是數(shù)量仍然較少，無法滿足當前的研究需求。因此，本研究擬采用磁珠富集法構(gòu)建克氏原螯蝦微衛(wèi)星富集文庫并篩選多態(tài)性微衛(wèi)星標記，以期為今后克氏原螯蝦及其近緣物種的遺傳學(xué)研究及分子標記輔助育種提供有利工具。

1 材料與方法

1.1 基因組DNA提取及檢測

試驗用41尾克氏原螯蝦樣本均購于江蘇省常州市集貿(mào)市場，每尾個體取肌肉組織置于2 mL離心管中，加入無水乙醇后保存在4 ℃冰箱中備用?；蚪MDNA提取采用苯酚—氯仿法進行。用1%瓊脂糖凝膠電泳及NanoDrop2000型微量紫外分光光度計進行DNA質(zhì)量檢測，并將DNA稀釋為50 ng/μL備用。

1.2 基因組酶切及片段回收

取1尾克氏原螯蝦DNA樣本1.5 μL，加入Mse-I限制性內(nèi)切酶，于冰上混勻后在37 ℃水浴中酶切2 h，酶切完畢后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切效果。將等體積的MseI-1(5′-GACGATGAGTCCTGAG-3′)和Mse-2(5′-TACTCAGGACTCAT-3′)接頭混合后，在95 ℃條件下變性5 min后緩慢冷卻至室溫，制備成Mse-I接頭。用T4 DNA連接酶將Mse-I接頭和酶切產(chǎn)物于16 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱中過夜連接。

將連接產(chǎn)物稀釋10倍后作為模板，以MseI-N(5′-GATGAGTCCTGAGTAAN-3′)作為引物，進行預(yù)擴增。預(yù)擴增反應(yīng)體系如下：總體積為25 μL，包含10×PCR Buffer(不含Mg2+)2.5 μL，MgCl21.6 μL，dNTPs 0.4 μL，MseI-N 0.8 μL，DNA模板1.0 μL，Taq DNA 聚合酶0.2 μL。為確定最佳預(yù)擴增效果，在進行PCR反應(yīng)過程中，設(shè)置了20、22、24、26和28共5個不同循環(huán)梯度，PCR反應(yīng)程序如下：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，53 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，72 ℃終延伸20 min。預(yù)擴增完成后，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測各循環(huán)梯度的擴增效果，確定最佳循環(huán)數(shù)。循環(huán)數(shù)確定后，將PCR反應(yīng)體系擴大至50 μL，依照上述PCR程序設(shè)定及最佳循環(huán)數(shù)進行PCR擴增，并對擴增產(chǎn)物進行純化回收。

1.3 生物素探針雜交

取“1.2”中回收產(chǎn)物29 μL與70 μL雜交液(6×SSC+0.1% SDS)混合，加入生物素標記的(GT)13探針1 μL，配制成100 μL雜交反應(yīng)混合液。雜交反應(yīng)在PCR儀中進行，程序設(shè)定如下：95 ℃變性5 min，65 ℃退火1 h，緩慢降溫至室溫，使混合液充分雜交。

1.4 磁珠富集

吸取150 μL鏈霉親和素包被的磁珠于1.5 mL離心管中，于室溫下用300 μL TEN100溶液洗滌3次，每次洗滌5 min，之后，向含磁珠的管內(nèi)加入300 μL TEN100溶液及“1.3”中所得雜交產(chǎn)物混勻，室溫下靜置30 min后，用磁力架固定磁珠并棄去雜交混合液。加入400 μL TEN100溶液對磁珠進行3次非嚴謹洗脫，每次5 min。再用400 μL 0.2×SSC和0.1% SDS混合的洗滌液對磁珠進行3次嚴謹洗脫，每次5 min。最后向管中加入50 μL pH8.0的TE緩沖液，并在100 ℃沸水中水浴5 min，得到第一次洗脫片段，重復(fù)該操作一次，獲得第二次洗脫片段，對兩次洗脫產(chǎn)物進行電泳檢測。

1.5 洗脫片段預(yù)擴增及純化

對得到的洗脫產(chǎn)物進行預(yù)擴增，預(yù)擴增體系與PCR程序設(shè)定同“1.2”，擴增30個循環(huán)。根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳后的結(jié)果選擇第二次洗脫產(chǎn)物并利用快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進行純化。

1.6 目的片段克隆及陽性檢測

將“1.5”中所得純化產(chǎn)物連接到pMD18-T載體后轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)大腸桿菌(Escherichiacoli)細胞，并涂布在含氨芐青霉素的固體LB培養(yǎng)基上于37 ℃培養(yǎng)16 h。

用無菌牙簽挑選單個克隆于含氨芐青霉素的50 μL液體LB培養(yǎng)基的離心管中，在37 ℃恒溫搖床中以200 r/min速度振蕩培養(yǎng)24 h。利用通用引物M13對培養(yǎng)的各克隆進行PCR擴增及瓊脂糖凝膠電泳檢測，挑選出片段大小在250～800 bp的克隆送至武漢艾康健生物技術(shù)有限公司測序。

1.7 同源序列查找

將各克隆測序所得序列在GenBank(https:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov)中利用BLASTn進行同源序列比對，當E值小于10-10時，認為是同源序列，當序列有多個同源序列時，取E值最低的序列作為相應(yīng)克隆的同源序列。

1.8 微衛(wèi)星引物設(shè)計及多態(tài)性篩選

克隆測序完成后，利用SSRHunter軟件從已獲得的序列中查找微衛(wèi)星序列，并輔以人工校對。對于含微衛(wèi)星的片段，通過Primer premier 5.0軟件設(shè)計引物并送生工生物工程(上海)股份有限公司進行合成。合成的引物在10尾克氏原螯蝦中進行擴增效果檢測與多態(tài)性篩選。將篩選出的多態(tài)性引物在含有30尾個體的克氏原螯蝦群體中進行多態(tài)性特征分析。檢測過程中所用PCR反應(yīng)體系總體積為12.5 μL：包括10×PCR buffer(含Mg2+)1.3 μL，dNTPs 0.4 μL，上、下游混合引物 0.4 μL，DNA模板 1 μL，Taq DNA聚合酶 0.1 μL，無菌超純水9.3 μL。PCR擴增產(chǎn)物用10%的聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，經(jīng)GoldviewⅠ型染色劑染色后通過紫外凝膠成像系統(tǒng)成像，并以Super DNA marker的梯度大小為標準，判斷各微衛(wèi)星標記的等位基因，并將分型數(shù)據(jù)輸入Excel表格中備用。

1.9 多態(tài)性數(shù)據(jù)分析

利用Arlequin 3.01軟件分析各多態(tài)性微衛(wèi)星標記的等位基因數(shù)、期望雜合度、觀測雜合度、連鎖不平衡以及哈迪—溫伯格平衡的偏離情況，所涉及參數(shù)的顯著值通過Bonferroni法進行校正[11]。此外，多態(tài)信息含量采用基于Excel的軟件MS-TOOLS[12]進行計算，而標記中的潛在零等位基因則利用軟件Micro-Checker 2.2.3[13]進行預(yù)測。各軟件分析多態(tài)位點分型數(shù)據(jù)時所涉及的格式轉(zhuǎn)換均通過CONVERT軟件進行。

2 結(jié) 果

2.1 微衛(wèi)星富集文庫陽性克隆檢測

本研究中所構(gòu)建的克氏原螯蝦微衛(wèi)星富集文庫獲得克隆約1000個，隨機選擇其中的82個克隆進行陽性檢測(圖1)。檢測結(jié)果顯示，挑選的克隆中含陽性單克隆75個，陽性雙克隆3個，假陽性克隆4個，因此，該文庫的陽性率達到95.1%。

圖1 克氏原螯蝦微衛(wèi)星富集文庫部分克隆電泳檢測圖1～24號為克隆泳道，M為Marker.

2.2 微衛(wèi)星富集效率

將檢測出的75個陽性單克隆送交武漢艾康健生物科技有限公司測序后，有8個克隆因質(zhì)粒抽提失敗未進行測序，另外的10個因含有高級結(jié)構(gòu)而未能成功測序，因此，成功測序的克隆有57個。在這57條克隆序列中，含微衛(wèi)星重復(fù)序列的有43條，因而本文庫的微衛(wèi)星富集效率為75.4%。

2.3 微衛(wèi)星特征分析

在含有微衛(wèi)星的43條序列中，完美型微衛(wèi)星序列有25條(58.1%)，非完美型序列有8條(18.6%)，復(fù)合型序列有7條(16.2%)，3條為重復(fù)單元大于6堿基的小衛(wèi)星序列(7.0%)(圖2a)。在測得43條微衛(wèi)星序列中共含51個微衛(wèi)星位點，平均每條序列含1.2個，33條(76.7%)序列中含一個微衛(wèi)星位點，10條(23.3%)序列含一個以上微衛(wèi)星位點，最多的序列具有3個微衛(wèi)星位點(圖2b)。

本研究中所用的探針重復(fù)類型為GT，因而獲得的微衛(wèi)星序列重復(fù)單元多為CA/AC與GT/TG(66.7%)，但也有GA、ACC等其他堿基重復(fù)類型(圖2c)，甚至還有以13、38和30堿基為重復(fù)單元的3條小衛(wèi)星序列(圖2a)。在51個微衛(wèi)星位點中，重復(fù)次數(shù)最少為4次，最多為161次，有22個位點(43.1%)重復(fù)次數(shù)大于10次，其中有10個(19.6%)重復(fù)次數(shù)大于20次(圖2d)。

圖2 克氏原螯蝦文庫所得微衛(wèi)星基本情況a：不同類型微衛(wèi)星分布情況；b：序列所含微衛(wèi)星位點個數(shù)分布；c：微衛(wèi)星不同重復(fù)單元分布情況；d：微衛(wèi)星重復(fù)次數(shù)分布情況.

2.4 同源序列查找

在美國國立生物技術(shù)信息中心上將克隆所得的57條序列通過BLASTn搜索，共匹配出12條同源序列，匹配相似度為87%～100%(表1)。其中，克隆PcGT01序列與信號小龍蝦(Pacifastacusleniusculus)血小板衍生生長因子(PDGF)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)相關(guān)受體1(PVR1)mRNA同源；克隆PcGT12序列與曼氏血吸蟲(Schistosomamansoni)的微衛(wèi)星序列具有較高同源性；克隆PcGT08、10、36和48與克氏原螯蝦中已發(fā)表的部分微衛(wèi)星序列同源，而PcGT02、14、15、16、17和20序列則與克氏原螯蝦中的部分基因序列同源(表1)。這在今后的應(yīng)用過程中將具有重要參考價值。

表1 克氏原螯蝦克隆序列同源序列查找結(jié)果

2.5 微衛(wèi)星引物設(shè)計及多態(tài)性篩選分析

在含微衛(wèi)星位點的43條序列中，有22條側(cè)翼序列太短或者是GC含量過低，無法設(shè)計引物，最終，對剩余的21條序列設(shè)計了引物(表2)。將這21對引物在10尾克氏原螯蝦中進行PCR及電泳檢測，結(jié)果表明，這21對引物中的18對可擴增出穩(wěn)定、清晰的條帶，其中有9對表現(xiàn)出良好的多態(tài)性，多態(tài)性比例為50%(表2)。

表2 本研究所設(shè)計克氏原螯蝦微衛(wèi)星引物的基本信息及檢測結(jié)果

續(xù)表2

引物名稱GenBank號引物序列(5′→3′)產(chǎn)物大小/bp退火溫度/℃是否成功是否多態(tài)PcGT08MH998135F:GCTATTGAGATGTGCCATTGR:TGTTGATTGACAGTTGCGAG10851是否PcGT09MH998136F:AGTAGTGATACATACAACACAGCR:TAACCCCCTGACCTAACCTA14149是是PcGT10MH998137F:TCACATGAACAACCAAAGAATR:ATGACAGAACCCGATAGGC22351是是PcGT11MH998138F:GTCTGCTTGCCTGGGAGTATR:TCGTTCACACAGCTGTAACATG26654是否PcGT12MH998139F:TGATTGACAGTTGAGAGGCGR:CAAGCAAGGCTGGTTCATC42054否否PcGT13MH998140F:GCAGAATACCCCCGTTGAR:TGTGTAGTGGAAGCGTGTTG10251是否PcGT14MH998141F: TGTCCCACACTTTGCTTCCR: GCCATTCCCATCACCACTA21352是否PcGT15MH998142F: CCTATCACGAAACCTCCTGTR: CCTGCCATCCTTAAACCTAC17852是是PcGT16MH998143F: AACTGTCGGCAAGTAAGGTGR: AGGTGCTCAGAAGTGCGTAG30656否否PcGT17MH998144F: CTGTCGCCATTCCATTGTGTR: TAAACTCCCCCCTCATCTACTG22850是是PcGT18MH998145F: GGGTGGCGTCCTTGATTGATR: ATTTGGCGGGTAGGTCTCTCC17255是否PcGT19MH998146F: GACAACACCATCACGGGCTCR: CTTCCACAGTAGCAAGGTCTCG28657否否PcGT20MH998147F: TATTCTTCCCCATTTTGTCCR: TTTGCCCCATATCTAAGTCAT18952是是PcGT21MH998148F: GTTGATTGACGGTTGAGAGR: TAATCTACCTGGTCTGTTGC15752是是

2.6 多態(tài)性標記特征分析

篩選所得9個微衛(wèi)星標記共得到等位基因36個，其中PcGT15和PcGT21等位基因數(shù)最多，均為6個；PcGT03和PcGT10只獲得了較少的兩個等位基因(表3)。9個多態(tài)位點的平均觀測雜合度為0.5856，其中PcGT17的最高(0.6667)，其次為PcGT15(0.6000)，而PcGT10的最低(0.3522)(表3)；平均期望雜合度為0.6291，其中最高的為PcGT21(0.8390)，最低的為PcGT10(0.3704)(表3)。多態(tài)信息含量最高為PcGT21中的0.8001，最低為PcGT10中的0.2859(平均為0.5584)，其中PcGT07、PcGT15、PcGT17、PcGT20和PcGT21的多態(tài)信息含量大于0.5，表明這些位點具有高度多態(tài)性，其余4個標記表現(xiàn)出中度多態(tài)性(表3)。通過Bonferroni校正后，PcGT03、PcGT07和PcGT21仍然偏離哈迪—溫伯格平衡(P<0.01)(表3)。連鎖不平衡分析結(jié)果經(jīng)Bonferroni校正后(P<0.001)未發(fā)現(xiàn)標記間的連鎖現(xiàn)象。通過Micro-Checker軟件檢測的結(jié)果顯示，標記PcGT07、PcGT17、PcGT20和PcGT21中可能存在零等位基因。

3 討 論

3.1 微衛(wèi)星富集效果與組成特征

在真核基因組中，微衛(wèi)星廣泛分布，其中重復(fù)類型為(CA)n或是(GT)n的含量尤為豐富，如中國明對蝦(Fenneropenaeuschinensis)[14]、日本蟳(Charybdisjaponica)[15]等。與先前的研究報道類似，本研究獲得的微衛(wèi)星重復(fù)單元以CA/AC和GT/TG為主，但同時也發(fā)現(xiàn)了GA、ACC和TAACC等其他重復(fù)類型。目前，微衛(wèi)星分子標記技術(shù)已廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)動物的遺傳學(xué)和分子生物學(xué)研究中，如陳萬光等[16]用微衛(wèi)星標記分析及檢測一個日本錦鯉(Cyprinuscarpiokoi)人工養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性。孫成飛等[17]利用微衛(wèi)星分子標記技術(shù)比較了中、泰兩國羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)養(yǎng)殖群體的遺傳結(jié)構(gòu)及遺傳多樣性。朱傳坤等[18]構(gòu)建了鳙魚(Aristichthysnobilis)的微衛(wèi)星標記遺傳連鎖圖譜。

表3 克氏原螯蝦9個微衛(wèi)星位點多態(tài)性分析

注：*表示偏離哈迪—溫伯格平衡.

獲取微衛(wèi)星標記的方法有多種，目前常用的有從公共數(shù)據(jù)庫獲取微衛(wèi)星分子標記、從近緣物種中獲取微衛(wèi)星標記及從基因組中自主開發(fā)新的微衛(wèi)星標記這3種方法。從公共數(shù)據(jù)庫中獲取微衛(wèi)星標記較為簡單方便，但公共數(shù)據(jù)庫中包含的物種微衛(wèi)星標記數(shù)據(jù)量較少，覆蓋面低，具有一定局限性；微衛(wèi)星序列包含側(cè)翼序列及核心序列，核心序列的重復(fù)次數(shù)決定了微衛(wèi)星的多態(tài)性，側(cè)翼序列則具有保守性，因此已獲得的微衛(wèi)星標記可用于近緣物種的研究分析，如部分牛微衛(wèi)星標記在羊的基因組中也表現(xiàn)出多態(tài)性[19]，鯉魚微衛(wèi)星標記在鰱魚(Hypophthalmichthysmolitrix)中跨種應(yīng)用[20]等。盡管上述方法操作簡便、成本低，但由于可用數(shù)據(jù)信息較為有限，無法大量篩選所需標記。因此，最主要的方法是從目標物種基因組中自主開發(fā)微衛(wèi)星標記，其中磁珠富集法獲得微衛(wèi)星標記的效率較高，已在多種水產(chǎn)動物中成功應(yīng)用[21-22]。

本研究采用生物素標記的(GT)13探針與擴增片段雜交，通過磁珠富集法來構(gòu)建微衛(wèi)星富集文庫，構(gòu)建出的文庫中有57個克隆測序成功，陽性克隆率為95.1%，高于多種已報道水產(chǎn)動物中的陽性率[15,21,24]。影響陽性克隆率的因素有很多，如不同研究者操作程序、物種、基因組質(zhì)量、連接產(chǎn)物回收純化效果等差異均會影響磁珠富集效率。在測序成功的57個克隆中有微衛(wèi)星序列43條，因而微衛(wèi)星富集效率達到了75.4%，其中完美型序列占比最大，達到了58.1%，非完美型占18.6%，復(fù)合型序列占16.2%，這與烏蘇里擬鲿(Pseudobagrasussuriensis)[22]、草魚(Ctenopharyngodonidellus)[23]、合浦珠母貝(Pinctadafucata)[24]、中國鱟(Tachypleustridentatus)[25]等的微衛(wèi)星數(shù)據(jù)類似。

3.2 微衛(wèi)星多態(tài)性

一般微衛(wèi)星重復(fù)次數(shù)越多，反映出該位點的多態(tài)性也就越高[4]，在本研究獲得的51個微衛(wèi)星位點中，有22個(43.1%)位點重復(fù)10次以上，其中有10個(19.6%)重復(fù)次數(shù)高于20次，表明克氏原螯蝦基因組中存在較多潛在的多態(tài)性微衛(wèi)星位點。最終18對能夠擴增出穩(wěn)定條帶的引物中，多態(tài)性比例達到了50%，比先前報道的多種水產(chǎn)動物的多態(tài)性比例都高[21-22]。多態(tài)信息含量能夠反映出一個遺傳標記的多態(tài)性信息量，當多態(tài)信息含量>0.5時，為高度多態(tài)性；多態(tài)信息含量為0.25～0.5時，為中度多態(tài)性[26]。本研究所得9個多態(tài)位點中有5個位點表現(xiàn)為高度多態(tài)性，其余4個為中度多態(tài)性，這也預(yù)示著這些多態(tài)性標記將成為今后克氏原螯蝦遺傳學(xué)分析的有力工具。

零等位基因一般是由微衛(wèi)星引物結(jié)合位點突變或缺失阻礙了微衛(wèi)星的擴增造成的[27]，其對相關(guān)研究結(jié)果的影響尚不清楚，大部分研究將其直接用于結(jié)果的分析[28]。一般情況下，零等位基因可通過哈迪—溫伯格平衡檢驗法或零等位基因檢測軟件如Micro-Checker等檢測出來。本研究所得9個多態(tài)標記中，PcGT03、PcGT07和PcGT21顯著偏離哈迪—溫伯格平衡，而PcGT07、PcGT17、PcGT20和PcGT21中可能存在零等位基因，因此，PcGT07和PcGT21偏離哈迪—溫伯格平衡可能是零等位基因所致。然而，另外一個偏離哈迪—溫伯格平衡的標記PcGT03中未檢測出零等位基因，而符合哈迪—溫伯格平衡的兩個標記PcGT17和PcGT20中反而檢測出零等位基因，這說明零等位基因的產(chǎn)生機制較復(fù)雜，有待更加深入的研究來解釋。

此外，本研究所得57條克隆序列中共檢索出12條匹配程度較高的同源基因，這些同源分析結(jié)果將為豐富克氏原螯蝦的基因組序列信息及進一步的遺傳分析提供參考。

4 結(jié) 論

本研究得到以下結(jié)論：(1)采用磁珠富集法構(gòu)建克氏原螯蝦微衛(wèi)星文庫切實可行；(2)從克氏原螯蝦富集文庫中開發(fā)的微衛(wèi)星標記多態(tài)性比例較高，而且均表現(xiàn)為中度及高度多態(tài)性。