李姿其，衣龍達(dá)，米梓萌，于 卓，周沫含，王繼紅，肖 蓉

( 遼寧師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 大連 116081 )

RGD毒素肽是一類具有RGD(Arg-Gly-Asp三肽序列)特征性模體的活性肽，最初發(fā)現(xiàn)于蛇毒中，被稱為去整合素。隨著研究的深入，科研人員在一些吸血類生物諸如蜱、牛虻、水蛭等的唾液腺中也同樣發(fā)現(xiàn)了這種以RGD模體為特征的毒素肽[1-5]。而rLj-RGD3是本課題組在國(guó)際上率先發(fā)現(xiàn)的來(lái)源于日本七鰓鰻(Lampetrajaponica)口腔腺的RGD肽，其一級(jí)結(jié)構(gòu)包含3個(gè)RGD序列[6]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，腫瘤細(xì)胞膜表面的整合素與正常細(xì)胞相比具有表達(dá)上調(diào)的特點(diǎn)，而這種高表達(dá)的整合素與腫瘤細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的RGD序列結(jié)合，能夠使腫瘤微環(huán)境中生長(zhǎng)因子的信號(hào)從細(xì)胞外向細(xì)胞內(nèi)傳遞，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖及遷移等活動(dòng)。當(dāng)外源性RGD毒素肽進(jìn)入到腫瘤組織細(xì)胞附近時(shí)，由于其序列上具有與細(xì)胞外基質(zhì)蛋白相同的RGD模體，故其能競(jìng)爭(zhēng)性地與腫瘤細(xì)胞表面整合素結(jié)合，從而對(duì)整合素介導(dǎo)的信號(hào)通路起到抑制作用，進(jìn)而腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲也受到抑制，最終誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。因此RGD毒素肽具有抑制血管新生、抑制腫瘤生長(zhǎng)的功能[7-10]。本課題組的前期工作證實(shí)rLj-RGD3也同樣具有上述功能[11-16]。

由于Lj-RGD3含有3個(gè)RGD模體，其結(jié)構(gòu)上的這幾個(gè)RGD是否都是其功能所必須，是否以協(xié)同效應(yīng)累加其功能，還是以某個(gè)RGD為功能關(guān)鍵模體，這些問(wèn)題引起了筆者的關(guān)注。為此，筆者進(jìn)行了一系列的突變體構(gòu)建，本研究所涉及的是Lj-RGD3的第Ⅰ及第Ⅱ位RGD同時(shí)缺失的突變體的分子克隆與誘導(dǎo)表達(dá)，并將獲得突變體命名為rLj-115。rLj-115的獲得將對(duì)后續(xù)關(guān)于Lj-RGD3的結(jié)構(gòu)與功能的研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)，并且也可為以rLj-RGD3為原型的抗血栓、抗腫瘤生物制藥研究提供更多可供優(yōu)化篩選的候選素材。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)材料

質(zhì)粒pET23b、大腸桿菌(Eascherichiacoli)BL21為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑

質(zhì)粒提取試劑盒、DNA連接試劑盒、IPTG(寶生物大連公司)；Amp氨芐青霉素(哈藥集團(tuán))；咪唑、Tricine、蛋白質(zhì)marker、CaCl2(Amresco公司)。組氨酸親和層析柱(His·Bind Column,Novagen公司)。

1.1.3 儀器

氣浴恒溫振蕩器(Thermo)；漩渦振蕩器(Scientific Industries)，低溫高速離心機(jī)(Beckman Coulter)；高溫高壓滅菌鍋(博訊)；分光光度計(jì)(Eppendorf)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 突變基因全序列合成

由于Lj-RGD3含有大量重復(fù)序列，無(wú)法對(duì)其基因進(jìn)行定點(diǎn)突變，故采用人工合成方法獲得目的基因(寶生物大連公司完成)。PCR擴(kuò)增時(shí)引入NdeⅠ和HindⅢ雙酶切位點(diǎn)。

1.2.2 陽(yáng)性重組質(zhì)粒構(gòu)建與鑒定

1.2.2.1 陽(yáng)性重組質(zhì)粒構(gòu)建

利用雙酶切法將合成后的rLj-115基因連接到pET23b質(zhì)粒上，雙酶切的酶切位點(diǎn)為NdeⅠ和HindⅢ。酶切反應(yīng)體系見(jiàn)表1及表2。

表1 HindⅢ的酶切反應(yīng)體系

表2 NdeⅠ的20 μL酶切反應(yīng)體系

以3倍體積的無(wú)水乙醇沉淀回收雙酶切后的DNA片段與pET23b載體，以T4 DNA連接酶進(jìn)行16 ℃的過(guò)夜連接(表3)。

表3 20 μL連接酶反應(yīng)體系

1.2.2.2 陽(yáng)性重組質(zhì)粒鑒定

采用CaCl2法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21中：宿主菌大腸桿菌BL21接種于20 mL Amp-LB中培養(yǎng)過(guò)夜，次日將部分菌液移至50 mL LB培養(yǎng)液中于37 ℃下繼續(xù)培養(yǎng)至600 nm吸光值達(dá)到0.2～0.3。培養(yǎng)物置于冰上10 min，5000 r/min，4 ℃離心10 min。棄上清液，倒置離心管1 min，加入5 mL冰預(yù)冷的0.1 mol/L CaCl2溶液致敏并懸浮細(xì)胞，冰上10 min。5000 r/min 4 ℃離心10 min回收細(xì)胞，棄上清液，每25 mL的原培養(yǎng)物再加入2 mL冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液，懸浮細(xì)胞并置于冰上3 h，每份200 μL分裝細(xì)胞。加10 μL含40 ng的DNA溶液至200 μL感受態(tài)細(xì)胞中溫和混勻，于42 ℃熱休克90 s后迅速放回冰中，將細(xì)胞冷卻1～2 min后，加入800 μL LB(Amp-)培養(yǎng)基，37 ℃ 225 r/min搖蕩培養(yǎng)細(xì)菌45～90 min。取100 μL轉(zhuǎn)化產(chǎn)物鋪于90 mm的LB(Amp+)瓊脂平板上，室溫下放置20～30 min后，倒置平皿于37 ℃培養(yǎng)12～16 h，待LB(Amp+)瓊脂平板上長(zhǎng)出菌落后即可進(jìn)行陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的篩選鑒定。

采用滅菌牙簽挑取轉(zhuǎn)化菌于10 μL雙蒸水中并煮沸10 min作為PCR模板，運(yùn)用通用T7引物PCR法進(jìn)行鑒定。T7通用引物序列為：P1-XXaaattaatacgactcactata，P2-XXgctagttattgctcagcggtg。DNA測(cè)序由寶生物大連公司完成。

1.2.3 重組蛋白rLj-115的誘導(dǎo)表達(dá)與純化

1.2.3.1 重組蛋白rLj-115的誘導(dǎo)表達(dá)

挑取陽(yáng)性重組單菌落接種于含氨芐的LB培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)至600 nm吸光值為0.4～0.6時(shí)，達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。加IPTG至終濃度1 mmol/L，分別進(jìn)行3、4、5 h的37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)與30 ℃的低溫過(guò)夜誘導(dǎo)表達(dá)。取上述培養(yǎng)液5000 r/min離心5 min，于沉淀中加100 μL的上樣緩沖液100 ℃加熱3 min, 上樣行Tricine-SDS電泳。

1.2.3.2 重組蛋白rLj-115的純化

由于rLj-115含有組氨酸標(biāo)簽，故可采用組氨酸親和層析柱進(jìn)行純化。組氨酸標(biāo)簽可與固相化于Ni-NTA His·Bind樹(shù)脂上的Ni2+結(jié)合，雜蛋白被洗掉后，目標(biāo)蛋白可通過(guò)濃度逐漸提高的咪唑洗脫而重新獲得。采用Trincine SDS-PAGE法電泳，采用考馬斯亮藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行濃度測(cè)定。

1.2.4 對(duì)ECV304增殖抑制作用的測(cè)定

將ECV304接種于96孔板，于M199培養(yǎng)液中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。加入梯度濃度的 rLj-115繼續(xù)培養(yǎng)24 h后加入MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去培養(yǎng)液并加入等體積的二甲基亞砜，搖床振蕩使結(jié)晶充分溶解，使用酶標(biāo)儀于490 nm下測(cè)定吸光度。計(jì)算細(xì)胞殺傷率：

R=(C-T)/C×100%

式中,R為細(xì)胞增殖抑制率，C為空白對(duì)照組的吸光度，T為加藥組的吸光度。

用SPSS軟件統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，n=3。

2 結(jié) 果

2.1 Lj-115突變方案及基因全序列合成

Lj-RGD3的一級(jí)結(jié)構(gòu)由118個(gè)氨基酸組成，含有3個(gè)RGD模體且富含組氨酸。將Lj-RGD3前兩個(gè)RGD模體缺失、保留第3個(gè)RGD的突變體命名為L(zhǎng)j-115(圖1)，其基因序列采用人工合成(寶生物公司完成)方法獲得。

圖1 源于Lj-RGD3的突變體Lj-115的基因序列及其氨基酸序列

2.2 陽(yáng)性重組質(zhì)粒鑒定

Lj-115的333 bp基因片段插入pET23b質(zhì)粒后，T7通用引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度應(yīng)該為526 bp，而pET23b空質(zhì)粒因沒(méi)有外源基因片段的插入，其T7通用引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物僅有193 bp，故可依據(jù)T7通用引物的結(jié)果進(jìn)行陽(yáng)性重組子的判斷。試驗(yàn)結(jié)果顯示，重組菌為陽(yáng)性克隆菌(圖2)。

圖2 利用T7通用引物對(duì)陽(yáng)性重組子進(jìn)行的PCR鑒定1.DL2000 DNA Marker(Takara); 2.陽(yáng)性重組子.

2.3 陽(yáng)性重組質(zhì)粒測(cè)序鑒定

重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖3，表明構(gòu)建序列完全正確，Lj-115基因克隆成功完成。

2.4 重組蛋白rLj-115的誘導(dǎo)表達(dá)和純化

通過(guò)CaCl2轉(zhuǎn)化法將pET23b-115轉(zhuǎn)入BL21表達(dá)菌內(nèi)，通過(guò)終濃度1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)，在37 ℃ 3～5 h誘導(dǎo)及30 ℃低溫誘導(dǎo)表達(dá)過(guò)夜條件下都成功誘導(dǎo)表達(dá)了基因重組肽rLj-115。結(jié)果表明，37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)4～5 h蛋白產(chǎn)生量最高，為最佳誘導(dǎo)條件(圖4)。

圖3 pET23b-115重組質(zhì)粒測(cè)序圖

圖4 突變體rLj-115 BL21/pET23b菌體的IPTG誘導(dǎo)的Tricine SDS-PAGE電泳圖1.30 ℃過(guò)夜未誘導(dǎo)； 2.30 ℃過(guò)夜誘導(dǎo)； 3.37 ℃ 3 h未誘導(dǎo)； 4.37 ℃誘導(dǎo)3 h； 5.MAKER; 6.37 ℃未誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h; 7.37 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h; 8.37 ℃未誘導(dǎo)培養(yǎng)5 h; 9.37 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)5 h. 目的條帶以箭頭標(biāo)示.

經(jīng)過(guò)菌體收集、超聲破碎和Ni2+親和層析純化等試驗(yàn)步驟，獲得了純化的基因重組肽rLj-115。Tricine-SDS-PAGE電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，rLj-115的分子量為13.7 ku，電泳遷移率由于序列帶有大量堿性氨基酸，所以比預(yù)期滯后。rLj-115純度超過(guò)98%(圖5)。通過(guò)Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度為3 mg/mL。

2.5 rLj-115對(duì)ECV304細(xì)胞增殖的抑制作用

MTT能還原存在于活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶從而形成甲瓚，其在呈藍(lán)紫色沉淀于細(xì)胞中。死細(xì)胞由于酶的失活而無(wú)此現(xiàn)象。所以形成的藍(lán)紫色甲瓚結(jié)晶的量與活細(xì)胞的數(shù)目成正比。rLj-115作用于ECV304細(xì)胞的結(jié)果顯示，其可以劑量依賴方式抑制ECV304細(xì)胞的增殖(圖6)，其抑制細(xì)胞增殖的半數(shù)抑制濃度為0.15 μmol/L，說(shuō)明重組表達(dá)的蛋白具有抑制血管新生的活性，為后續(xù)試驗(yàn)奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。

圖5 鎳離子親和層析純化得到rLj-115肽的Tricine-SDS-PAGE電泳1.Marker; 2～4.rLj-115純化蛋白.

圖6 rLj-115對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ECV304增殖的抑制作用

3 討 論

3.1 rLj-RGD突變體設(shè)計(jì)

RGD(Arg-Gly-Asp三肽序列)毒素肽是一類具有RGD特征性模體的活性肽，最初發(fā)現(xiàn)于蛇類唾液腺分泌物中。蛇類體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的RGD肽稱為去整合素。此外在水蛭、牛虻、虱等吸血類生物唾液腺中液也發(fā)現(xiàn)這種特征蛋白。rLj-RGD3是本實(shí)驗(yàn)室在七鰓鰻口腔腺cDNA文庫(kù)中發(fā)現(xiàn)，并成功進(jìn)行原核表達(dá)的可溶性RGD活性肽,結(jié)構(gòu)中包含3個(gè)RGD模體。在之前的研究中，rLj-RGD3顯示出具有抑制血小板聚集、體內(nèi)外抑制多種腫瘤(乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、喉癌)、體外抑制內(nèi)皮細(xì)胞和體內(nèi)抑制血管新生的功能[6,11-16]。由于rLj-RGD3具有3個(gè)RGD模體，因此其結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系引起了研究者的關(guān)注。課題組設(shè)計(jì)了一系列的結(jié)構(gòu)突變體，如保留第1個(gè)RGD模體的和保留第2個(gè)RGD模體的突變體，而本研究的rLj-115是保留第3個(gè)RGD模體的突變體。這幾個(gè)突變體獲得后，本課題組將對(duì)其進(jìn)行全面的功能比較，所以突變體純化蛋白的獲得成為關(guān)鍵。

3.2 突變體基因的人工合成

在進(jìn)行重組蛋白基因克隆與表達(dá)時(shí)，在未知其蛋白mRNA全長(zhǎng)序列的情況下，通常采用5′-Race及3′-Race的方法釣取mRNA，然后采用RT-PCR方法獲得蛋白的雙鏈DNA基因并進(jìn)行質(zhì)粒構(gòu)建，而相關(guān)突變體的構(gòu)建往往是直接通過(guò)點(diǎn)突變完成[17-18]。本課題的Lj-RGD3野生型基因就是通過(guò)mRNA的RT-PCR方法獲得[6]。然而，在設(shè)計(jì)突變體克隆方案時(shí)發(fā)現(xiàn)，由于Lj-RGD3基因具有大量重復(fù)序列，無(wú)法采用定點(diǎn)突變完成。但前期本課題組已知Lj-RGD3的基因序列，故可在基因突變方案形成后采用全突變基因序列合成獲得目的基因。由試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，合成基因構(gòu)建成功，所表達(dá)的蛋白具有活性。這說(shuō)明完全可以通過(guò)基因合成的方式進(jìn)行重組蛋白的質(zhì)粒構(gòu)建。

3.2 突變體rLj-115的電泳遷移率及活性

突變體rLj-115含有大量堿性氨基酸，其等電點(diǎn)為10，故電泳遷移位置比預(yù)期滯后，這種現(xiàn)象在其野生型rLj-RGD3也同樣存在。MTT試驗(yàn)結(jié)果表明，rLj-115抑制臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的半數(shù)抑制濃度為0.15 μmol/L，而野生型rLj-RGD3作用于ECV304的半數(shù)抑制濃度為0.889 μmol/L[6]，rLj-115的活性是rLj-RGD3的6倍，這表明rLj-RGD3并未因3個(gè)RGD模體的同時(shí)存在而活性更強(qiáng)，這為后續(xù)進(jìn)一步關(guān)于rLj-RGD3結(jié)構(gòu)與功能的研究提供了試驗(yàn)基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)成功地對(duì)rLj-RGD3的第Ⅰ、Ⅱ位RGD模體進(jìn)行了缺失突變，獲得了僅含有第Ⅲ位RGD模體的rLj-115純化蛋白，并且rLj-115具有高于野生型6倍的生物活性，這為進(jìn)一步的rLj-RGD3構(gòu)效關(guān)系測(cè)定奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)，也為以rLj-RGD3為原型的抗腫瘤藥物優(yōu)化篩選提供了候選素材。