孫平 向澤棟 董丹華 高鵬

摘? ? ? 要： 以懸鈴木成熟的球果為原料，通過單因素和正交試驗對超聲波輔助提取懸鈴木總黃酮的工藝進行優(yōu)化;并通過考察總黃酮對DPPH自由基和ABTS自由基的清除率來評價其抗氧化活性。結(jié)果表明，懸鈴木總黃酮的最佳提取條件如下：乙醇體積分數(shù)為60%，料液比為1∶25（g/mL），超聲時間30 min，超聲溫度60 ℃，在此優(yōu)化條件下，總黃酮的含量為21.82 mg/g?？傸S酮質(zhì)量濃度為20 μg/mL時，具有較強的清除自由基能力，清除DPPH自由基和ABTS自由基為85.38%和98.84%。

關? 鍵? 詞：懸鈴木;球果;超聲輔助提取;總黃酮;抗氧化活性

中圖分類號：R284.2? ? ? ?文獻標識碼： A? ? ? ?文章編號： 1671-0460（2019）10-2214-05

Abstract： Using the mature cones of Platanus as raw material， on the basis of single factor tests， the optimum conditions of ultrasonic-assisted extraction of total flavonoids were optimized by orthogonal tests. Meanwhile， the antioxidant activity of total flavonoids from Platanus was evaluated by DPPH and ABTS+ scavenging capacity. The results showed that the optimal extraction conditions of total flavonoids were as follows： the ethanol volume 60%， the ratio of water to raw material 1：25（g/mL），the ultrasonic temperature 60 ℃， the time 30 min. Under these conditions， the total flavonoids content was 21.82 mg/g. When the total concentration of flavonoids was 20 μg/mL， the scavenging rate of total flavonoids on DPPH and ABTS+ were 85.38% and 98.84%， which indicated that the total flavonoids of Platanus had strong antioxidant activity.

Key words： Platanus; Cones; Ultrasonic-assisted extraction; Total flavonoids; Antioxidant activity

懸鈴木為懸鈴木科（Platanaceae）落葉大喬木，亞洲、歐洲和北美洲為其主要栽種地區(qū)[1]。我國引入栽培主要是一球、二球和三球懸鈴木三種，其中雜交種二球懸鈴木[2]是我國的主要栽培品種。懸鈴木被稱為“行道樹之王”，可以凈化空氣微小顆粒、隔音防噪和降低地面溫度，并且在民間還使用樹皮治療腹瀉、牙痛[3]等疾病。經(jīng)現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，懸鈴木擁有多種化學成分，如黃酮、多酚、三萜、糖苷、有機酸及其衍生物等[4-6]，并且分離出新型骨架成分[7]。

此外還從懸鈴木的不同組織器官中提取分離出具有抗氧化、抗炎、細胞毒性、抑菌活性、抑制小鼠妊娠、抗腫瘤、抗HIV、保護肝腎、解偶聯(lián)[4，8-13]等生物活性物質(zhì)。但在4-6月份，懸鈴木成熟球果開始脫落，在外力作用下果毛四處飛散，造成過敏和炎癥[14]和環(huán)境污染。目前對懸鈴木的研究主要集中在樹皮和葉子上，對球果尤其是成熟的球果研究較少。因此，通過超聲輔助溶劑提取法提取懸鈴木中的總黃酮成分，并應用單因素和正交試驗優(yōu)化提取工藝，探究懸鈴木總黃酮對DPPH自由基和ABTS+自由基的清除能力。根據(jù)提取工藝優(yōu)化結(jié)果和抗氧化能力分析，可以為懸鈴木總黃酮的開發(fā)應用提供理論依據(jù)，還為其活性成分和藥理作用的進一步研究奠定基礎。

1? 實驗部分

1.1? 實驗材料

懸鈴木球果 采自山東中醫(yī)藥大學校內(nèi);蘆丁對照品（純度≥98%） 購自上海源葉生物;DPPH、ABTS 購自上海麥克林公司;乙醇 購自天津市四通化工廠;維生素C（Vc） 購自國藥集團;其他試劑 均為國產(chǎn)分析純。

1.2? 實驗儀器

KQ-500E型超聲波清洗機 昆山市超聲儀器有限公司;DFY-600C高速粉碎機 無錫久平儀器有限公司;XS105DU電子天平 梅特勒-托利多集團;752型紫外可見分光光度計 上海舜宇恒平科學儀器有限公司。

2? 實驗方法

2.1? 懸鈴木總黃酮提取

懸鈴木球果干燥后粉碎并過24目篩。取約1.0 g樣品，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，按照不同的考察因素對總黃酮進行超聲輔助溶劑提取，離心取得上清液，制得總黃酮提取液。

2.2? 蘆丁標準曲線繪制

采用硝酸鈉-亞硝酸鋁比色法測定懸鈴木總黃酮含量，精密稱定20 mg蘆丁對照品，用60%乙醇配置成0.20 mg/mL的蘆丁標準品溶液。準確吸取0.0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 mL的標準品溶液于25 mL量瓶中，加入1.0 mL 5 %亞硝酸鈉溶液、1.0 mL 10%硝酸鋁溶液，震蕩均勻后放置5 min，再加10.0 mL 4%氫氧化鈉溶液，用60%乙醇加至刻度線，震蕩均勻后放置15 min[15]。以蘆丁試劑空白作為參比液，在505 nm波長下測吸光度，根據(jù)蘆丁濃度和吸光度繪制標準曲線。

2.3? 單因素試驗

采用2.1下法提取懸鈴木總黃酮，提取條件為：料液比1∶20 g/mL、超聲時間30 min、超聲溫度60 ℃、使用不同乙醇體積分數(shù)（40、50、60、70、80%）提取，測定總黃酮的提取率;乙醇體積分數(shù)60%、超聲時間30 min、超聲溫度60 ℃、根據(jù)總黃酮的提取率考察不同料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 g/mL）的影響;乙醇體積分數(shù)60%、料液比1∶20 g/mL、超聲溫度60 ℃、使用不同超聲時間（20、25、30、35、40 min）提取，測定總黃酮的提取率;乙醇體積分數(shù)60%、料液比1∶20 g/mL、超聲時間30 min、使用不同超聲溫度（40、50、60、70、80 ℃）提取，測定總黃酮的提取率。

2.4? 正交優(yōu)化試驗設計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，L9（34）正交試驗見表1。

2.5? 抗氧化活性測定

將懸鈴木總黃酮配制成0、2.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20μg/mL質(zhì)量濃度，以Vc為對陽性照，分別測定其對DPPH自由基和ABTS+自由基的清除率，評價其抗氧化活性。

2.5.1? 懸鈴木總黃酮對DPPH自由基清除能力測定

參照文獻[16，17]的測定方法并稍加修改。配制50μg/mL的DPPH乙醇溶液，取1與1 mL不同濃度的樣品溶液或Vc溶液充分混勻，室溫下暗處放置30 min，在517 nm波長處測吸光度。計算公式如下：

DPPH自由基清除率=1-（A1-A2）/A0

式中： A1 —樣品組吸光度;

A2 —樣品本底吸光度（以等體積無水乙醇代替DPPH溶液）;

A0 —空白對照組吸光度（以等體積蒸餾水代替樣品溶液）。

2.5.2? 懸鈴木總黃酮對ABTS+自由基清除能力測定

參照文獻[18，19]的測定方法并稍加修改。配制7 mmol/mL的ABTS+溶液，室溫下與等體積的4.9 mmol/mL過硫酸鉀溶液混合后暗處放置12 h，制成ABTS+儲備液，用pH=7.4的磷酸緩沖液稀釋儲備液20倍制成ABTS+工作液。取不同濃度的樣品溶液和Vc溶液1 mL，加入2.0 mL的ABTS+工作液，震搖均勻后常溫暗處放置10 min，在734 nm波長處測吸光度。計算公式如下：

ABTS+自由基清除率=1-（A1-A2）/A0

式中： A1 —樣品組吸光度;

A2 —樣品本底吸光度（以等體積蒸餾水代替ABTS+溶液）;

A0 —空白對照組吸光度（以等體積蒸餾水代替樣品溶液）。

2.6? 數(shù)據(jù)處理

所有試驗均重復進行3次，采用GraphPad Prism 8.0.2對結(jié)果進行分析，結(jié)果表示為平均值±標準偏差（mean±SD）。

3? 結(jié)果分析

3.1? 蘆丁標準曲線

以蘆丁為對照品，根據(jù)蘆丁濃度和吸光度的測定結(jié)果繪制標準曲線如圖1。線性回歸方程為Y=11.95X+0.005 7，R2=0.999 4，其中Y為吸光度，X為蘆丁濃度。

3.2? 單因素試驗結(jié)果

3.2.1? 乙醇體積分數(shù)對總黃酮提取率的影響

由圖2可知，在乙醇體積分數(shù)較小時，乙醇體積分數(shù)增加會導致總黃酮提取率增加，在60%時黃酮提取率最大，之后呈現(xiàn)急劇下降趨勢。推測這是由于懸鈴木總黃酮極性較大，當乙醇體積分數(shù)過高時，不利于溶解黃酮物質(zhì)。當乙醇體積分數(shù)較低時，會有部分多糖等水溶性雜質(zhì)溶出[20]。因此選擇乙醇體積分數(shù)為60%。

3.2.2? 料液比對總黃酮提取率的影響

由圖3可知，料液比的變化導致總黃酮提取率呈現(xiàn)出先增大后降低的趨勢，在1∶20 g/mL時黃酮提取率最大，之后呈現(xiàn)緩慢下降趨勢。推測由于總黃酮在料液比1∶20 g/mL時基本溶出，繼續(xù)增加溶劑用量會使其他雜質(zhì)增加溶出，使黃酮提取率下降[21]因此選擇料液比為1∶20 g/mL。

3.2.3? 超聲時間對總黃酮提取率的影響

由圖4可知，總黃酮提取率隨著超聲時間的增大呈現(xiàn)出先增大后降低的趨勢，在30 min時黃酮提取率最大，之后呈現(xiàn)緩慢下降趨勢?？赡芤驗檫^長的超聲時間會破壞黃酮類化合物結(jié)構(gòu)，使其容易于分解， 而且超聲時間過長溫度不好控制， 導致乙醇的揮發(fā)， 引起提取率的下降[22]。因此選擇超聲時間為30 min。

3.2.4? 超聲溫度對總黃酮提取率的影響

由圖5可知，總黃酮提取率隨著超聲溫度的增大呈現(xiàn)出先增大后降低的趨勢，在30 min時黃酮提取率最大，之后呈現(xiàn)緩慢下降趨勢?？赡苡捎跍囟仍黾訒裹S酮成分被破壞，而且也會增加雜質(zhì)溶出。因此選擇超聲溫度為60 ℃。

3.3? 正交優(yōu)化試驗設計結(jié)果

由表2正交試驗結(jié)果分析可知，各提取工藝條件對總黃酮提取率影響程度不同，根據(jù)極差分析結(jié)果可知，對總黃酮提取率的影響主次順序為A>B>C>D，即乙醇體積分數(shù)的影響最大，其次是料液比，超聲溫度對提取率的影響最小。懸鈴木總黃酮最佳提取工藝為A2B3C2D2，即乙醇體積分數(shù)60%，料液比1∶25 g/mL，超聲時間30 min，超聲溫度60 ℃。對最優(yōu)組合進行驗證試驗，結(jié)果顯示為21.82 mg/g，大于正交試驗結(jié)果中的最大含量21.39 mg/g，表明此提取方法重復性良好，提取率高，適用于提取懸鈴木總黃酮。

3.4? 對DPPH自由基清除能力的測定結(jié)果

由圖6可知，總黃酮質(zhì)量濃度在0～20μg/mL范圍內(nèi)，隨著總黃酮質(zhì)量濃度的增加，DPPH自由基清除率隨之增加。當總黃酮質(zhì)量濃度為20μg/mL時，對DPPH自由基清除率達到85.38%，陽性對照Vc為77.23%。以上結(jié)果表明懸鈴木總黃酮對DPPH自由基有良好的清除的能力。

3.5? 對ABTS+自由基清除能力的測定結(jié)果

由圖7可知，總黃酮質(zhì)量濃度在0～20μg/mL范圍內(nèi)，隨著總黃酮質(zhì)量濃度的增加，ABTS+自由基清除率隨之增加。當總黃酮質(zhì)量濃度為10μg/mL時，對ABTS+自由基清除率達到98.38%，之后在總黃酮質(zhì)量濃度在10～20μg/mL之間，ABTS+自由基清除率保持相對穩(wěn)定?？傸S酮質(zhì)量濃度在20μg/mL時，對ABTS+自由基清除率達到98.38%，高于同濃度陽性對照Vc對ABTS+自由基清除率66.33%。以上結(jié)果說明懸鈴木總黃酮具有很高的清除ABTS+自由基的能力。

4? 結(jié) 論

通過單因素和正交試驗，對懸鈴木總黃酮的超聲輔助提取工藝進行優(yōu)化確定：乙醇體積分數(shù)60%、料液比1∶25 g/mL、超聲時間30 min、超聲溫度60 ℃，懸鈴木總黃酮提取率為21.82 g/mg。

通過抗氧化試驗，結(jié)果表明在0～20μg/mL范圍內(nèi)，懸鈴木總黃酮對DPPH自由基和ABTS+自由基清除率逐漸增加，總黃酮濃度在20μg/mL時，對DPPH自由基和ABTS+自由基清除率分別達到85.38%和98.84%，說明懸鈴木總黃酮具有較強的抗氧化能力。

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