陳露露 柴藝匯 田興中 劉春艷 謝宇 周雯 牛建均 張麗艷

【摘 要】 目的：研究天麻普通粉、破壁粉、凍干粉對戊四唑誘導(dǎo)驚厥大鼠海馬組織γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶（7-Aminobutyrate transaminase，GABA-T） mRNA及蛋白表達(dá)的影響，初步探討天麻破壁粉、凍干粉對神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用機(jī)制，并對3種不同加工工藝的天麻的效應(yīng)差異性進(jìn)行對比，為合理使用不同加工工藝的天麻提供實(shí)驗(yàn)參考。方法：利用戊四唑驚厥模型，將SD大鼠隨機(jī)分為正常組，模型組，陽性對照組，天麻（普通粉、破壁粉、凍干粉）低、中、高劑量組（0.5、1.0、2.0 g/kg）。用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法（Real-time PCR）檢測不同工藝的天麻對戊四唑誘導(dǎo)驚厥大鼠海馬組織GABA-T mRNA表達(dá)的情況;用蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測不同工藝的天麻對戊四唑誘導(dǎo)驚厥大鼠海馬組織GABA-T蛋白表達(dá)情況。結(jié)果：RT-PCR和WB檢測顯示，模型組大鼠海馬組織GABA-T mRNA和蛋白相對表達(dá)量顯著升高（P<0.05）;與模型組比較，陽性對照組和天麻各組均可顯著降低大鼠海馬組織GABA-T mRNA和蛋白相對表達(dá)量（P<0.05），天麻凍干粉和破壁粉抗驚厥效果不同程度優(yōu)于天麻普通粉，其中凍干粉的效果優(yōu)于破壁粉，破壁粉的效果優(yōu)于普通粉，且在一定范圍內(nèi)呈量效關(guān)系。結(jié)論：天麻凍干粉和破壁粉對戊四唑誘導(dǎo)驚厥大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用效果強(qiáng)于普通粉，與加工方式有關(guān)，且呈量效關(guān)系，其作用機(jī)制可能與大鼠海馬組織GABA-T mRNA及蛋白表達(dá)水平有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 天麻;破壁粉;凍干粉;抗驚厥;GABA-T

【中圖分類號】R285.5?? 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A??? 【文章編號】1007-8517（2019）16-0019-05

Abstract：Objective The effects of Tianma ordinary powder， broken wall powder and freeze-dried powder on the expression of GABA-T mRNA and protein in hippocampus of rats induced by pentylenetetrazol were studied. The protective mechanism of Tianma broken wall powder and freeze-dried powder on nerve cells was discussed. The effect difference of the gastrodia elata is compared， and an experimental reference is provided for the reasonable use of different processing techniques. Provide experimental reference for Tian-Ma for rational of differentin processing techniques. Methods The pentylenetetrazol-induced convulsion model was established and the SD rats were randomly divided into normal group， model group， positive control group， Tianma ordinary powder， broken wall powder， freeze-dried powder low， medium and high dose group （0.5， 1.0， 2.0 g/kg）. Real-time PCR was used to detect the expression of GABA-T mRNA in different hippocampus induced by pentylenetetrazol-induced convulsion rats. Detection of GABA-T protein expression in hippocampus of pentylenetetrazol-induced convulsion rats by WB with different techniques. Results RT-PCR and WB showed that the expression of GABA-T mRNA and protein in the hippocampus of the model group was significantly increased （P<0.05）. Compared with the model group， the positive control group and the gastrodia elata group were significant. The relative expression of GABA-T mRNA and protein in hippocampus of rats was decreased （P<0.05）. The anticonvulsant effect of Tianma freeze-dried powder and wall-breaking powder was better than that of Tianma ordinary powder. The effect of freeze-dried powder was better than that of wall-breaking powder. The effect of wall-breaking powder is better than ordinary powder， and it is dose-effect relationship within a certain range. Conclusion The effects of Tianma freeze-driedpowder and wall-breaking powder on the neuroprotective effect of pentylenetetrazol-induced convulsion rats are stronger than those in common powders， which are related to the processing method and have ahippocampus of rats.

Keywords：Tianma;Broken Wall Powder; Freeze-dried Powder;Anticonvulsant;GABA-T

驚厥是由多種原因引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)過度興奮，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞異常運(yùn)動，臨床表現(xiàn)為對稱性、全身性和陣發(fā)性的肌肉抽動，伴有眼球上翻、意識障礙，主要好發(fā)于兒童的一類神經(jīng)疾病[1]。驚厥發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，通常以神經(jīng)遞質(zhì)之間的平衡紊亂為主。神經(jīng)遞質(zhì)包括抑制性和興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，在抗驚厥方面發(fā)揮重要作用[2]。GABA受γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨梅（γ-aminobutyrate transaminase，GABA-T）催化降解，GABA-T活性增強(qiáng)已成為驚厥發(fā)病的一個(gè)重要因素[3-4]。天麻化學(xué)成分含有天麻素、天麻甘元、香莢蘭醇多糖等，其活性成分主要以酚類及多糖為主，具有抗驚厥、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗衰老等藥理作用[5]。破壁粉碎技術(shù)是將傳統(tǒng)飲片加工粉碎至D90<45μm的粉體，無需添加任何輔料制成中藥破壁飲片，提高生物利用度的一種技術(shù)[6]。凍干技術(shù)是將中藥材在真空狀態(tài)下冷凍，通過水的升華除去水分，已被國家列入“21世紀(jì)中醫(yī)藥現(xiàn)代化發(fā)展戰(zhàn)略”之一的一種干燥技術(shù)[7]。研究以大鼠為對象，探討天麻（普通粉、破壁粉、凍干粉）對戊四唑誘導(dǎo)驚厥大鼠海馬組織GABA-T mRNA及蛋白表達(dá)的影響，初步探討不同工藝的天麻治療驚厥的療效和作用機(jī)制，為后期臨床和實(shí)驗(yàn)研究使用天麻破壁粉和凍干粉提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 動物 72只清潔級SD大鼠，體重為（200±20）g，購自于慶騰鑫比爾實(shí)驗(yàn)動物銷售有限公司，動物許可證號：SCXK（軍）2012-0011。

1.2 藥物 天麻來源為自采，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)植物栽培教研室魏升華教授鑒定為蘭科植物天麻Gastrodia elata Bl.的干燥塊莖。普通粉：60℃中烘干，研磨粉碎后過6號篩制成;破壁粉：60℃中烘干，應(yīng)用破壁粉碎技術(shù)加工、干壓制成粉粒;凍干粉：真空干燥機(jī)將切制、滅菌的新鮮天麻凍干，小鋼磨粉碎后，最后過藥典6號篩篩選制成。

1.3 試劑 丙戊酸鈉（批號：8HG0385，賽諾菲制藥有限公司）;戊四唑 （批號：#L16185，深圳市華宇能通訊科技有限公司）;TRNzol總RNA提取試劑（批號：DP405-02，天根生化科技（北京）有限公司）;DL2000 DNA Marker（批號：3427Q，寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司）;Ultrapure RNA Kit（批號：CW0581M，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）;HiScript II One Step qRT-PCR SYBR Green Kit（批號：Q221-01，南京諾唯贊生物科技有限公司）;一步法快速WB（HRP）試劑盒（兔）（批號：CW02029）、一步法快速WB（HRP）試劑盒（鼠）（批號：CW02030）、BCA蛋白定量試劑盒（批號：CW0014）均購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.4 儀器 Step One Plus型熒光定量PCR儀（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）;C2500型低溫離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器廠）;ZS-2型板式酶標(biāo)儀（北京新風(fēng)機(jī)電有限公司）;164-5050型電泳儀（伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司）;Mini-PROTEAN Tetra Electrophoresis System型蛋白電泳槽（伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司）;Mini Trans-Blot型蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司）;Tanon 1600型凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）。

2 方法

2.1 分組 72只健康成年SD大鼠，將大鼠適應(yīng)性養(yǎng)7d，隨機(jī)分為12組，每組6只，然后稱重、標(biāo)記。分組：正常組，模型組（戊四唑），陽性對照組（丙戊酸鈉）組，天麻普通粉低、中、高劑量組（0.5g/kg、1.0 g/kg、2.0 g/kg），天麻破壁粉低、中、高劑量組（0.5 g/kg、1.0 g/kg、2.0 g/kg），天麻凍干粉低、中、高劑量組（0.5 g/kg、1.0 g/kg、2.0 g/kg）。

2.2 造模及給藥 正常對照組用生理鹽水灌胃（4 mL/kg）;模型組用戊四唑腹腔內(nèi)注射（0.08g/kg）;陽性對照組戊四唑腹腔內(nèi)注射 （0.08 g/kg），再給予丙戊酸鈉灌胃（0.12g/kg），持續(xù)10d;藥物組戊四唑腹腔內(nèi)注射 （0.08 g/kg），分別給予天麻（普通粉、破壁粉、凍干粉）低、中、高劑量組（0.5g/kg、1 g/kg、2 g/kg）灌胃，使藥物均勻溶解，連續(xù)給藥10d，并給予適宜環(huán)境生長，自由進(jìn)水進(jìn)食。在給藥之后把大鼠單獨(dú)放在鼠籠里并觀察大鼠30 min的形力學(xué)改變，驚厥診斷參照Racine標(biāo)準(zhǔn)記錄發(fā)作等級，選擇發(fā)作等級大于Ⅳ的進(jìn)入下一步實(shí)驗(yàn)。[8]

2.3 檢測指標(biāo)

2.3.1 對戊四唑誘導(dǎo)驚厥大鼠GABA-T mRNA表達(dá)量的影響 按照超純RNA試劑盒說明從大鼠海馬組織制備總RNA，分光光度計(jì)測定總RNA濃度和純度，并用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，按cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。PCR擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性30s，95℃變性5s，60℃退火40s，60℃延伸1min，循環(huán)次數(shù)40個(gè)。目的基因作為引物和以GAPDH作為內(nèi)參基因，引物列為GAPDH，上游引物序列5′-TTCCTACCCCCAATGTATCCG-3′，下游引物序列5′-CCACCCTGTTGCTGTAGCCATA-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長度270 bp;GABA-T上游引物序列5′-CTTTCTGTTCTCAACTC-3′，下游引物序列5′-TGAATACTCTGCCCTGCTCT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長度138 bp。PCR實(shí)驗(yàn)需重復(fù)3次，每次3個(gè)復(fù)孔，根據(jù)Real-time PCR原始數(shù)據(jù)Ct值，并計(jì)算相對定量值。

2.3.2 對戊四唑誘導(dǎo)驚厥大鼠海馬組織樣本中GABA-T蛋白表達(dá)量的影響 稱取適量大鼠海馬組織加入適量RIPA（細(xì)胞裂解液）裂解液勻漿后，10000 rpm離心20 min，然后取上清液，按BCA 試劑盒測定蛋白濃度。在凝膠電泳槽中加入制備好的蛋白樣品，轉(zhuǎn)膜，取膜。封閉液封閉后，使一抗與二抗充分混勻，于室溫條件下孵育5 min，加入一步法抗體稀釋液（一抗GABA-T濃度（1∶ 1000）、二抗GABA-T濃度（1∶ 200），一抗內(nèi)參β-actin濃度（1∶ 5000）、二抗內(nèi)參β-actin濃度（1∶ 200）?；靹?，放入PVDF（聚偏氟乙烯）膜，ECL（電致化學(xué)發(fā)光）化學(xué)發(fā)光試劑顯色，開始曝光。掃描膠片并保存，凝膠成像系統(tǒng)對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。目的蛋白表達(dá)量與同一樣本內(nèi)參表達(dá)量之比可以計(jì)算出目的蛋白相對表達(dá)量。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件統(tǒng)計(jì)，用（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 戊四唑誘導(dǎo)驚厥大鼠海馬組織GABA-T mRNA表達(dá)量的變化 與正常組比較，模型組GABA-T mRNA相對表達(dá)量顯著上升（P<0.05）;與模型組比較，陽性藥對照組和不同工藝的天麻組均可顯著降低GABA-T mRNA相對表達(dá)量（P<0.05），在一定范圍內(nèi)呈量效關(guān)系，且天麻凍干粉高劑量組與陽性對照組的GABA-T mRNA表達(dá)無明顯差異（P>0.05）。天麻凍干粉中劑量組對GABA-T mRNA表達(dá)的抑制作用高于天麻破壁粉高劑量組（P<0.05）。見表1。

3.2 戊四唑誘導(dǎo)驚厥大鼠海馬組織GABA-T蛋白表達(dá)量的變化 與正常組比較，模型組GABA-T蛋白相對表達(dá)量顯著提高（P<0.05）;與模型組比較，陽性對照組和不同工藝的天麻組均可不同程度降低GABA-T蛋白相對表達(dá)量（P<0.05）。相同劑量下，天麻因加工工藝不同對大鼠海馬組織GABA-T蛋白表達(dá)量也不同，整體蛋白表達(dá)量呈現(xiàn)：普通粉>破壁粉>凍干粉。見圖1、2。

4 討論

驚厥是以神經(jīng)細(xì)胞反復(fù)放電、大腦功能暫時(shí)性失常為特征的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。廣泛分布于腦內(nèi)的GABA作為抑制性神經(jīng)遞質(zhì)在抗驚厥中發(fā)揮著重要作用，GABA經(jīng)谷氨酸合成，通過GABA-T催化生成琥珀酸半醛，琥珀酸半醛在琥珀酸半醛脫羧酶的催化下生成琥珀酸，進(jìn)入三羧酸循環(huán)，GABA-T是GABA的代謝過程中的關(guān)鍵酶[9]。研究表明，GABA-T抑制劑可以提高機(jī)體腦內(nèi)的GABA濃度，且這類抑制劑對驚厥機(jī)體大腦有高度選擇性作用，所以GABA-T可以作為治療驚厥的一個(gè)重要靶點(diǎn)[10]。目前驚厥的治療集中于對癥治療和控制療法，難于對因治療和根治，臨床療效較差，西醫(yī)藥物治療一般使用苯二氮卓類、苯巴比妥類等藥物，但不良反應(yīng)較多。天麻具有祛風(fēng)止痙、平肝熄風(fēng)等功效，其在改善驚厥的臨床癥狀、恢復(fù)神經(jīng)細(xì)胞功能、延長發(fā)作間歇期、減少復(fù)發(fā)等方面占有獨(dú)特優(yōu)勢[11]?？拱B膠囊（主要藥物含有天麻）可以明顯降低GABA-T的活性而達(dá)到治療驚厥的作用[12]。

天麻破壁粉是利用現(xiàn)代超微粉碎技術(shù)將傳統(tǒng)飲片粉碎成D90<45 μm的粉體，以不同濃度的乙醇或水作為黏合劑制成30～100目的一種新型飲片。中藥飲片發(fā)揮治療作用的基礎(chǔ)主要是藥物中的有效活性成分，但大多藥物的活性成分在細(xì)胞內(nèi)部。當(dāng)天麻經(jīng)破壁技術(shù)加工后，其細(xì)胞壁被打破，提高天麻在體內(nèi)的釋放速度和吸收程度;天麻粒徑減小、表面積增大，提高有效成分的溶出，因此與傳統(tǒng)飲片相比更利于細(xì)胞內(nèi)的有效成分的釋放，從而大大提高了藥物活性成分的溶出率 [13]。鄧銀愛等[14]研究在大鼠體內(nèi)藥代動力學(xué)變化，黃芪破壁飲片的生物利用度較黃芪傳統(tǒng)飲片高。林偉波[15]研究參芪固本方對大腸癌化療后造血系統(tǒng)改善作用，發(fā)現(xiàn)同等劑量時(shí)破壁飲片療效明顯優(yōu)于傳統(tǒng)飲片。

天麻凍干粉是將其在低溫條件下經(jīng)現(xiàn)代提取工藝制備而成的新劑型，其制備過程中隔絕空氣。因此凍干技術(shù)有效地抑制了熱敏性物質(zhì)發(fā)生生物、化學(xué)或物理變化，保存了天麻的活性物質(zhì)，使天麻成分穩(wěn)定性增高，不易發(fā)生化學(xué)變質(zhì)，改善了鮮天麻不易保存的缺點(diǎn)[16]。研究表明，新鮮天麻經(jīng)過真空冷凍干燥工藝研究，其天麻素保留率可達(dá)0.67%。陳艷芬等[17]在研究決明子配方顆粒的藥效學(xué)，結(jié)果顯示決明子配方顆粒藥效總體優(yōu)于傳統(tǒng)水煎液，其中以冷凍顆粒藥效最好。張興盈[18]在不同加工工藝的云當(dāng)歸抗凝血作用比較中，發(fā)現(xiàn)真空干燥成的凍干云當(dāng)歸抗凝血作用比其它加工工藝（鼓風(fēng)干燥、微波干燥、自然曬干）的云當(dāng)歸效果好，同等劑量時(shí)其利用率提高。

研究發(fā)現(xiàn)，天麻凍干粉中劑量組對GABA-T mRNA表達(dá)的抑制作用高于天麻破壁粉高劑量組（P<0.05）;同等劑量下，天麻破壁粉對GABA-T mRNA及蛋白表達(dá)的抑制作用高于天麻普通粉。因此，天麻破壁粉、凍干粉均能提高對驚厥大鼠海馬組織神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用，且整體效果呈現(xiàn)凍干粉的效果優(yōu)于破壁粉，破壁粉的效果優(yōu)于普通粉，其作用機(jī)制可能是不同加工工藝的天麻調(diào)節(jié)GABA-T mRNA及蛋白表達(dá)的差異與天麻粉碎粒徑大小和干燥方式有關(guān)，本研究為天麻凍干粉、破壁粉的臨床應(yīng)用提供理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。但不同干燥和粉碎技術(shù)對天麻抗驚厥有效成分的差異性，有待進(jìn)一步研究證實(shí)明確。

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（收稿日期：2019-06-03 編輯：陶希睿）