張知曉　付文　劉凌　戶連榮　季梅

摘要：牛樟芝是一種珍稀的藥用真菌，因其寄主專一性，野生資源缺乏，人工培育困難，可持續(xù)發(fā)展面臨嚴峻挑戰(zhàn)。本文評述牛樟芝的化學(xué)成分、生物活性和發(fā)酵技術(shù)的研究進展。牛樟芝化學(xué)物質(zhì)多樣，已分離獲得325種化學(xué)物質(zhì)，分屬酯類、酸類和萜類等15類。發(fā)掘這些化學(xué)物質(zhì)和粗提物的生物活性，發(fā)現(xiàn)牛樟芝具有抗癌、免疫調(diào)節(jié)、保肝和消炎等多種藥用功能。為獲得更廣泛的應(yīng)用，以獲得更優(yōu)的菌絲生長，子實體形成和功能活性物質(zhì)產(chǎn)生的椴木栽培、固體發(fā)酵和液體發(fā)酵技術(shù)被不斷完善。但是要以牛樟芝為材料大量生產(chǎn)藥品，臨床試驗須進一步研究，活性物質(zhì)生物功能須進一步發(fā)掘，人工培育技術(shù)須進一步優(yōu)化。

關(guān)鍵詞：牛樟芝;化學(xué)成分;生物活性;發(fā)酵技術(shù)

中圖分類號： R284文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）18-0010-14

收稿日期：2018-06-04

基金項目：云南省科技計劃青年項目（編號：2016FD096）。

作者簡介：張知曉（1988—），女，云南個舊人，碩士，助理研究員，主要從事森林微生物資源開發(fā)與利用研究。E-mail：36062613@qq.com。

通信作者：季?梅，研究員，主要從事生物多樣性與林業(yè)有害生物防治研究。E-mail：meiji.emma@163.com。

中藥是我國傳統(tǒng)文化之瑰寶，我國中藥生物資源豐富，有藥用植物11 146種、藥用動物1 581種，藥用真菌540種[1-2]。我國藥用真菌應(yīng)用歷史悠久，公元102—200年的《神農(nóng)本草經(jīng)》中就有黑木耳（Auricularia auricula）、靈芝（Ganoderma sp.）、雷丸（Mylitta lapidescens）、茯苓（Wolfiporia cocos）和豬苓（Polyporus umbellatus）等5種真菌的藥用記載。近年，藥用真菌的功能活性物質(zhì)發(fā)掘、藥理特性揭示和人工培育成為藥用真菌研究的熱點，在藥用真菌中已發(fā)現(xiàn)126種新奇的功能活性，如抗癌、止血、抗菌、解毒、消炎和提高免疫力等[2]。一些藥用真菌因其功能活性物質(zhì)、藥理特性或人工培育技術(shù)較成熟被普遍應(yīng)用，如冬蟲夏草（Ophiocordyceps sinensis）、赤芝（Ganoderma lucidum）、茯苓等多種藥用真菌已經(jīng)實現(xiàn)大宗商品化貿(mào)易[3];有的還被開發(fā)成中成藥或中藥飲片，如豬苓多糖注射液、靈芝孢子粉和蟲草含片等[4]。因此，發(fā)掘、開發(fā)、利用和保護藥用真菌資源，促進我國傳統(tǒng)中藥文化發(fā)展將是未來中藥學(xué)研究的熱點領(lǐng)域之一。

牛樟芝（Antrodia comphorata）是一種珍稀藥用傘菌，具有抗癌、免疫調(diào)節(jié)、抗衰老、抗病毒、保肝、消炎、治療心血管疾病和神經(jīng)損傷等多種功能，大量的功能活性物質(zhì)被發(fā)掘[5]，其市場需求量極大。牛樟芝專性腐生牛樟樹，生長極為緩慢，且寄主分布區(qū)域狹窄，野生資源緊俏，市場售價已高達15 000美元/kg[6]。非法砍伐牛樟樹采集牛樟芝已經(jīng)威脅到牛樟芝和牛樟樹資源的可持續(xù)發(fā)展，臺灣已經(jīng)把牛樟樹列為保護植物[7]。通過液體發(fā)酵生產(chǎn)加工菌絲商品成為目前牛樟芝資源化利用和野生資源保護的一個關(guān)鍵策略[8];擴大牛樟樹人工栽培面積，再用椴木栽培牛樟芝以獲取子實體是另一個關(guān)鍵策略[9]。本文系統(tǒng)地綜述牛樟芝的化學(xué)組成、藥理特性及培育技術(shù)，目的是為牛樟芝資源保護和利用提供參考。

1?分類描述

牛樟芝的分類歷經(jīng)多次鑒定，目前得出的科學(xué)結(jié)論有（1）分類地位：隸屬真菌界（Fungi）擔(dān)子菌門（Basidiomycota）傘菌綱（Agaricomycetes）多孔菌目（Polyporales）多孔菌科（Polyporaceae）薄孔菌屬（Antrodia）[10]。（2）別稱：Ganoderma comphoratum，Antrodia cinnamomea和Taiwanofungas camphortus[11]。（3）寄主和分布：牛樟樹（Cinnamomum kanehirai）是牛樟芝的自然唯一寄主，主要分布于臺灣西北部的桃園和新竹，中部的南投和嘉義，東南部的花蓮、高雄和臺東等縣（區(qū)、市）的海拔200～2 000 m的山嶺地區(qū)[12]。（4）系統(tǒng)發(fā)育特點：地理來源不同的牛樟芝菌落內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）序列高度穩(wěn)定相似，相似長度介于592～596 bp之間，相似性為100%。其中，ITS2序列和5.8S序列高度穩(wěn)定，長度分別是217 bp和158 bp，但ITS1序列具有變異性[13]。（5）形態(tài)特征：子實體多年生，片狀、鐘形、蹄形或塔形，生長初期平伏，后邊緣上翹到卷成蝶形或鐘形，嘗之味苦澀，聞之有樟腦芳香。表面有光澤和不明顯的皺褶，黃色至深褐色，邊緣平鈍;腹面被0.3～0.5 cm長的圓形菌孔，橘紅色或橘黃色。生殖菌絲無色或淺褐色，具鎖狀聯(lián)合，直徑2.0～3.5 μm;骨架菌絲淺褐色或深褐色，有少量的淀粉體，直徑25～4.5 μm;纏繞菌絲淺褐色或深褐色，有分枝，直徑0.1～0.2 μm。擔(dān)子棒狀，具有4個擔(dān)孢子梗，并在基部有一簡單分隔，大小（12～14） μm×（3.0～5.0） μm。擔(dān)孢子無色，圓柱形或彎曲圓柱形，表面平滑，大小（3.5～5.0） μm×（1.5～2.0） μm[14]。

2?化學(xué)組成

牛樟芝化學(xué)組成物質(zhì)豐富，已分離鑒定出325種化合物，有酸類物質(zhì)20種、醇類48種、醛類12種、烷烴類12種、苯類43種、酯類57種、雜環(huán)類9種、酮類23種、木脂素類3種、含氮類10種、類固醇3種、琥珀酸和馬來酸衍生物15種、單萜41種、多萜類21種及其他類8種。牛樟芝藥用化學(xué)物質(zhì)豐富，上述化合物中有57種具有藥用功能，其中苯類13種、酯類1種、單萜22種、多萜1種、琥珀酸和馬來酸衍生物13種，其他類7種，實驗室數(shù)據(jù)已揭示其功能活性包括細胞毒性、抗衰老、消炎、抗癌、抗病毒和神經(jīng)保護等[15-21]（表1）。

3?藥理作用

3.1?抗腫瘤作用

牛樟芝已被發(fā)現(xiàn)具有多種抗癌活性。（1）抗肝癌活性。牛樟芝粗提取物對肝癌細胞HEP G2、HEP 3B、PLC/PRF/5等都具有明顯的細胞毒性[22]。其甲醇提取物能上調(diào)表達半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase-3）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8（caspase-8），阻止癌細胞Hep G2由G0向G1正常分裂，引起畸變死亡[23];其乙酸乙酯提取物能調(diào)控Bcl家族蛋白表達，產(chǎn)生細胞色素c（cytochrome c）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9（caspase-9），引起癌細胞HEP G2、HEP 3B和PLC/PRF/5的死亡，或通過增加癌細胞HEP 3B的胞內(nèi)鈣離子濃度，激活鈣蛋白酶和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶12（caspase-12），引起癌細胞HEP 3B死亡[24]。牛樟芝粗提取物能激活肝癌免疫系統(tǒng)活性，用1 000 mg/（kg·d）的劑量連續(xù)處理攜帶肝癌細胞H22的小鼠發(fā)現(xiàn)，其巨噬細胞的吞噬作用、T細胞的增殖活性、B細胞的形成能力以及自然殺傷細胞（NK細胞）、淋巴因子活化殺傷細胞（LAK細胞）的毒性顯著增強，CD4+/CD8+指標恢復(fù)正常，重組白細胞介素-2（IL-2）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）含量增加，對肝癌細胞H22的抑制率達74.24%[25]。牛樟芝粗提物能抑制肝癌細胞轉(zhuǎn)移和擴散，用300 mg/（kg·d）的牛樟芝乙酸乙酯提取物處理小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其能誘導(dǎo)核轉(zhuǎn)錄因子-κB信號通路（NF-κB）形成，降低血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）的表達水平，增加金屬蛋白酶組織抑制因子1（TIMP-1）、金屬蛋白酶組織抑制因子2（TIMP-2）的表達水平，抑制肝癌細胞侵染和擴散[26]。牛樟芝還可以作為抗肝癌的輔助治療藥劑。1 μg/mL牛樟芝發(fā)酵菌絲與10 μmol/L鉑化合物或10 μmol/L絲裂霉素共用，可以提高肝癌細胞C3A和PLC/PRF/5專性治療藥劑的療效[27]。（2）抗乳腺癌活性。牛樟芝發(fā)酵液能抑制細胞周期蛋白D1（cyclin D1）、細胞周期蛋白A（cyclin A）、細胞周期蛋白E（cyclin E）、周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）、環(huán)氧合酶-2（COX-2）、前列腺素E2（PGE2）和增殖細胞核抗原（PCNA）的產(chǎn)生，增加周期蛋白依賴性激酶（CDK）抑制因子、上調(diào)細胞周期抑制蛋白（P27/KIP）和重組周期蛋白依賴蛋白激酶抑制劑1（P21/WAF1）基因表達，激活caspase-3、caspase-8、caspase-9，降解DNA修復(fù)酶（PARP），釋放cytochrome c，停滯細胞分裂于G1期，限制乳腺癌細胞MDA-MB-231 增殖，引起細胞死亡[28]。牛樟芝發(fā)酵液在25～150 μg/mL劑量下能激活caspase-3，降解多聚ADP核糖聚合酶（PARP），調(diào)控Bcl-2基因和Bax（一種兔抗人單克隆抗體）的表達，釋放cytochrome c，引起乳腺癌細胞MCF-7死亡[29]。（3）抗前列腺癌活性。牛樟芝粗提物在150 μg/mL劑量下能激活蛋白激酶B（AKT），上調(diào)表達P53和P21基因，抑制cyclin D1和CDK4的產(chǎn)生，阻止細胞由G1期向S期分裂，引起前列腺癌細胞LNCaP死亡;也可以在100～200 μg/mL 劑量下，激活A(yù)KT，上調(diào)表達P53和P21基因，抑制細胞周期蛋白B1（cyclin B1）和蛋白激酶Cdc2的產(chǎn)生，阻止細胞由G2期向M期分裂，引起前列腺癌細胞PC-3死亡[30]。（4）抗膀胱癌活性。牛樟芝粗提物在50 μg/mL劑量下，能抑制MMP-9、cyclin B1和Cdc2的產(chǎn)生，使膀胱癌細胞T24的轉(zhuǎn)移和增殖活性顯著下降[31]。（5）抗肺癌活性。牛樟芝乙醇提取物能下調(diào)重組人半乳糖凝集素-1（galectin-1）、翻譯啟動子（TIF 5A）和裂解抑制子（Rho GDP DI α）、鈣蛋白亞基（CaDPSS）和膜聯(lián)蛋白V（Annexin V）的表達，引起肺癌細胞A549死亡[32]。（6）其他抗癌活性。牛樟芝子實體乙醇提取物能上調(diào)組蛋白去乙?；?（HDAC 1）的表達，下調(diào)組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（GCN 5、CBP、PCAF）的表達，引起癌細胞HL60的死亡[33];25～150 μg/mL發(fā)酵菌絲水提物能引起癌細胞HL60染色體凝結(jié)，核小體間DNA斷裂，造成癌細胞HL60失活[34];100 μg/mL 粗提物能上調(diào)表達P21，下調(diào)表達腫瘤抑制因子（pRb），顯著抑制癌細胞RT4增殖[31];100～200 μg/mL菌絲粉能抑制胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK MAPK）的磷酸化，降低癌細胞MG63的活力，誘導(dǎo)細胞死亡[35]。半抑制細胞濃度（IC50）為4.1 μg/mL的三氯化碳和甲醇提取物對癌細胞P388具有明顯的細胞毒性，相應(yīng)地，癌細胞Jurkat的細胞毒性IC50為40 μg/mL，癌細胞Colon 205的三氯化碳提取物IC50為60 μg/mL[36]。

牛樟芝含有多種抗癌活性物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，戰(zhàn)奎酸A（Zhankuic acids A）、戰(zhàn)奎酸C（Zhankuic acids C）對癌細胞P-388 具有細胞毒性，IC50分別是1.8、5.4 μg/mL[37]。Antrodins B、Antrodins C也具有細胞毒性，半數(shù)有效量（ED50）分別是7.5、3.6 μg/mL[38];Antcin A、Antcin C和Methylantcinate A能抑制肝癌細胞Huh7、Hep G2和Hep 3B增殖，而對正常肝細胞無影響[39];Antroquinonol對乳腺癌細胞（MCF-7、DA-MB-231）、肝癌細胞（Hep 3B、Hep G2）、前列腺癌細胞（DU-145和LNCaP）具有細胞毒性，其IC50介于（0.13±0.02）～（6.09±0.07） μmol/L之間[40];Zhankuic acid A、Zhankuic acid C、Methylantcinate B對結(jié)腸癌、乳腺癌、肝癌和肺癌細胞具有專一的細胞毒性，IC50介于22.3～75.0 μg/mL 之間[41];4-acetylantroquinonol B能使癌細胞U937、BxPC3產(chǎn)生細胞分裂障礙，抑制癌細胞增殖[42]。Antrocin能引起乳腺癌細胞MMCS死亡，IC50為0.6 μmol/L[43];4 μmol/L的Zhankuic acid A、Zhankuic acid C、Methyl antcinate可引發(fā)癌細胞HT-29死亡[41];50～150 μmol/L 4，7-Dimethoxy-5-methyl-l，3-benzodioxole能干擾結(jié)腸癌細胞COLO205由G0向G1期正常分裂，同樣的劑量則對上皮細胞無害，150 μmol/L以上的劑量則能引起細胞死亡[44];Zhankuic acids能引起癌細胞HT-29和SW-480死亡[41];具有抗癌活性的多糖是β-D葡聚糖，其一般具有β-（1→3）-D-glucopyranans和β-（1→6）-D-glucosyl分枝結(jié)構(gòu)，對癌細胞U937、S180表現(xiàn)出顯著的抑制作用[45]。

3.2?增強免疫力

牛樟芝免疫刺激和免疫調(diào)節(jié)效果相關(guān)研究證明，胞外刺激能激活不同的免疫系統(tǒng)。口服3～6周牛樟芝多糖衍生物能增加轉(zhuǎn)基因鼠脾臟中CD4+-T細胞和B細胞的數(shù)量和比例，誘導(dǎo)產(chǎn)生Th1型細胞激素（IFN-γ和TNF-α），降低曼氏血吸蟲（Schistosoma mansoni）的感染率，表明牛樟芝可以激活小鼠Th1免疫系統(tǒng)[46]。用4 μg/g牛樟芝發(fā)酵液處理巨噬細胞和NK細胞，能增強其吞噬作用和靶向殺死作用[47]，牛樟芝多糖、腺苷酸、25～100 μg/mL水提物和3～25 μg/mL三氯化碳子實體提取物能提高單核吞噬細胞的TNF-α、PGE2、重組人白細胞介素-12（IL-12）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）、重組人白細胞介素-6（IL-6）產(chǎn)生能力，抑制NO誘導(dǎo)形成脂多糖，增強其吞噬作用[48];5～60 μg/mL發(fā)酵菌絲和濾液的熱水提取物在溶血培養(yǎng)試驗中也顯示了TNF-α、IL-6的誘導(dǎo)活性，牛樟芝粗體物能誘導(dǎo)小鼠淋巴結(jié)細胞的IFN-γ mRNA上調(diào)表達，產(chǎn)生IL-12、IFN-α，增加細胞毒性T淋巴細胞（CTLs）數(shù)量，增強CD4+和CD8+T細胞滲透性，提高引流淋巴結(jié)DC的活化作用，增強小鼠對牛痘DNA的抗性[49]。這些結(jié)果證明，牛樟芝具有激發(fā)先天免疫活性的效果，是一種具有潛力的免疫調(diào)節(jié)輔劑。

牛樟芝免疫調(diào)節(jié)功能活性物質(zhì)多樣。研究發(fā)現(xiàn)，Me-AntK和Methyl antcinate K能誘導(dǎo)Ag-專性T-細胞增殖，促進輔助性T細胞（Th2細胞）分化，促使DC化膿，增加主要組織相容性復(fù)合體（MHC）家族二型和誘導(dǎo)T細胞增殖協(xié)同因子（CD86）的上調(diào)表達，增強DC和Th2免疫調(diào)節(jié)作用[50]。Antcin A、Antcin B、齒孔醇（Eburicol）能抑制中性粒白細胞產(chǎn)生超氧化物，具有免疫調(diào)節(jié)活性，IC50分別是8.5、9.8、50.5 μg/mL[51]。Antcin C（IC50=16.9 μg/mL）、Antcin K（1～25 μmol/L）、脫氫齒孔酸（dehydroeburicoic acid）（IC50=144.8 μg/mL）和齒孔酸（eburicoic acid）（IC50=43.9 μg/mL）、Zhankuic acid A、Zhankuic acid B、Zhankuic acid C能降低中性粒白細胞的產(chǎn)活性氧（ROS）活性[52]。trans-3-isobutyl-4-[4-（3-methyl-2-butenyloxy） phenyl]pyrrolidine-2，5-dione（IC50=10 μg/mL）能刺激中性粒白細胞產(chǎn)生TNF-α，降低細胞脂多糖（LPS）誘導(dǎo)細胞分泌的IL-6（IC50=10 μg/mL）的量?；衔颿is-3-（4-hydroxyphenyl）-4-isobutyldihydrofuran-2，5-dione、3-（4-hydroxyphenyl）-4-isobutyl-1hpyrrole-2，5-dione、dimethyl 2-（4-hydroxyphenyl）-3-isobutylmaleate抑制細胞LPS產(chǎn)生IL-6（IC50分別是17、18、25 μg/mL）[53]。antrocinnamomins A能抑制巨噬細胞中NO的產(chǎn)生[54]。γ-十二內(nèi)酯（γ-dodecalactone）能刺激NK細胞分泌人凋亡相關(guān)因子配體（FasL）、人顆粒酶B（Granzyme B）、TNF-α、INF-γ[55]。蛋白ACA能介導(dǎo)TLR2/MyD88依賴型巨噬細胞的極化和分化，上調(diào)表達CD86，刺激產(chǎn)生TNF-α和IL-1β，提高吞噬活性，增強其吞噬作用[56]。多糖GF2可誘導(dǎo)酯多糖激活DCs，產(chǎn)生IL-10和IL-12，抑制CD4+T細胞增殖，具有輔助治療過敏性哮喘的潛力[57]。菌絲多糖蛋白AC-1、AC-2、AC-3、AC-4、AC-5（分子量在394～940 ku之間）都表現(xiàn)出免疫活性，1 μmol/L多糖蛋白AC-1和AC-2能清除745%和50.5%的1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基，50～200 μg/mL多糖蛋白AC-2能抑制巨噬細胞產(chǎn)生NO和iNOS[58]。

3.3?預(yù)防和治療肝病

乙型肝炎病毒（HBV）、活性自由基氧化作用、乙醇、四氯化碳、痤瘡丙酸桿菌是肝病的重要誘因[59]。牛樟芝能清除自由基，增強抗氧化酶活性，誘導(dǎo)肝細胞再生，發(fā)揮保肝作用。研究發(fā)現(xiàn)，牛樟芝菌株B86的多糖（50 μg/mL）無細胞毒性，但具有較高的抗乙型肝炎病毒活性，效果優(yōu)于1 000 U/mL的α-干擾素[45];牛樟芝乙醇提取物對乙肝表面抗原（HBsAg）和乙型肝炎E抗原（HBeAg）野生型HBV都具有抗性活性，說明牛樟芝具有抗HBV活性[60]。研究數(shù)據(jù)顯示，牛樟芝是一個有效的自由基直接清除劑，其提取物（IC50=3.1 mg/mL）能清除DPPH、羥基和超氧陰離子自由基，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，降低低密度脂蛋白的氧化修飾活性，降低鐵離子的螯合和還原能力、抗γ射線（20 kgy）輻射氧化能力[61]。用牛樟芝處理急性乙醇中毒小鼠，其谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、堿性磷酸酶和膽紅素含量顯著降低，其效果與水飛薊素相當(dāng)，說明牛樟芝可以預(yù)防乙醇性肝損傷[62]。四氯化碳在常態(tài)下會釋放三氯化碳自由基，干擾細胞膜上脂肪和蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致肝中毒和肝纖維化，口服牛樟芝子實體水提物的四氯化碳處理小鼠，其肝膠原蛋白1、轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）、TIMP-1表達水平下調(diào)，總谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽（GSH/GSSG）比值升高，谷胱甘肽過氧化物酶、谷胱甘肽還原酶、谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶活性顯著降低，由四氯化碳引起的中性白細胞浸潤、水腫、壞死等癥狀少見，微纖維化結(jié)節(jié)消失，肝纖維化逐步逆轉(zhuǎn)[63]，說明牛樟芝能治療由四氯化碳導(dǎo)致的肝損傷和肝纖維化。用痤瘡丙酸桿菌+脂多糖處理小鼠，會誘發(fā)急性肝炎，服用牛樟多糖ACN2a[0.4～0.8 g/（kg·d）]后，其血清中AST和ALT活性顯著降低，說明牛樟芝能治療痤瘡丙酸桿菌+脂多糖誘發(fā)的急性肝炎[64]。

2，2′，5，5′-tetramethoxy-3，4，3′，4′-dimethlylenedioxy-6，6′-dimethyl biphenyl對野生型和突變型乙型肝炎病毒都具有抗性活性，聯(lián)苯對野生型HBV細胞ES2的抗性與1 000 U/mL 的α-2a干擾素相當(dāng)，對突變型HBV細胞M33的抗性則與250 U/mL的α-2a干擾素相當(dāng)[65]。最近，從牛樟芝中又分離到Camphorataimide B，該物質(zhì)在50 μmol/L 的劑量下，對乙肝表面抗原（HBsAg）和乙型肝炎E抗原（HBeAg）的抑制表達效率分別是35.2%和12.8%。牛樟芝菌絲和子實體中的環(huán)己烯酮Antroquinonol具有抑制HBsAg和HBeAg合成的作用，從而具有抑制HBV的功能[60]。

3.4?消炎功能

炎癥是移除生物毀壞、物理創(chuàng)傷、ROS過氧化反應(yīng)和化學(xué)創(chuàng)傷等傷害刺激，恢復(fù)正常生理功能的生化反應(yīng)過程[39]?；钚匝跏茄装Y的主要介質(zhì)，研究發(fā)現(xiàn)，1～50 μg/mL牛樟芝預(yù)處理可以減少活性氧的形成[66]。Chen等研究發(fā)現(xiàn)，牛樟芝菌絲含量為25～100 μg/mL的牛樟芝純培養(yǎng)物可以抑制NO和PGE2的產(chǎn)生[53]，牛樟芝甲醇提取物可以抑制神經(jīng)膠質(zhì)細胞中iNOS和COX-2的表達，減輕耳腫[67]。牛樟芝正己烷提取物能抑制小鼠尿蛋白的表達（100 μg/g），降低血尿氮素含量水平（200 μg/g），降低腎小球基膜厚度（400 μg/g），從而預(yù)防腎炎[68]。牛樟芝培養(yǎng)液能抑制TNF-α和NO的產(chǎn)生，降低丙二醛（MDA）、iNOS、COX-2含量水平，增加過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）活性，消除肝部水腫[69]。許多牛樟芝化合物顯示消炎活性，例如Zhankuic acids A、 B、C和Antcin K可以減少趨化肽（FMLP）和佛波酯（PMA）誘導(dǎo)的活性氧產(chǎn)生量[70]。Antrocamphin A、Antcin A、Antcin B在劑量<10 μmol/L時就能抑制超氧化物產(chǎn)生。牛樟芝的多糖和腺苷能促進自發(fā)性分泌TNF-α，抑制IL-6產(chǎn)生，激活巨噬細胞，發(fā)揮消炎活性[51]。dimethyl 2-（4-hydroxyphenyl）-3-isobutylmaleate可抑制IL-6的產(chǎn)生，IC50為25 μg/mL[54]。Ergostatrien-3β-ol能抑制TNF-α和NO的產(chǎn)生，降低與MDA、iNOS、COX-2含量水平、增加CAT、SOD和GPx活性，消除肝部水腫[71]。

3.5?其他功能

除上述功能外，牛樟芝還被發(fā)現(xiàn)具有神經(jīng)保護、預(yù)防和治療心血管疾病、干擾幽門螺旋桿菌侵染、提高專性藥劑藥效和殺蟲等功能。牛樟芝發(fā)酵液能抑制c-Jun氨基末端激酶（JNK）和蛋白激酶P38活性，保持細胞PC-12的活力[72]。從牛樟芝子實體中分離出的具有保護小鼠大腦皮層神經(jīng)元細胞功能活性的化合物有19-hydroxylabda-8（17）-en-16，15-olide、3β，19-dihydroxylabda-8（17）、11E-dien-16，15-olide、13-epi-3β，19-dihydroxylabda-8（17）、19-hydroxylabda-8（17），13-dien-16，15-Olide、14-deoxy-11，12-didehydroandrographolide，活性劑量為5～20 μmol/L[73]。這些結(jié)果說明，牛樟芝具有神經(jīng)保護作用。10 μg/g的牛樟芝子實體及菌絲甲醇提取物能夠降低小鼠的舒張壓和收縮壓[74];菌落B85發(fā)酵菌絲具有舒張血管的作用，最大舒張率為40.34%±7.53%[75]。這些結(jié)果預(yù)示，牛樟芝可能是心血管疾病的保健功能藥品原料。從牛樟芝中分離的化合物Antcin A、Antcin K、Methyl antcinate B能激活胃上皮細胞AGS的NF-κB活性，釋放IL-8z，抑制幽門螺旋桿菌的黏附和侵染作用，發(fā)揮其胃病治療功效[76]。牛樟芝粗提物與鉑化合物及絲裂霉素共用，能抑制肝癌等癌細胞的增殖效率，延長小鼠壽命，降低抗癌藥物的使用劑量[26];牛樟芝發(fā)酵液與黃芪（Astragalus membranaceus）、丹參（Salvia miltiorrhiza）、枸杞（Lycimm chinense）的提取物共用能提高抑制四氯化碳處理動物肝部的ALT水平。這些結(jié)果說明，牛樟芝可作為一種抗癌或肝病治療的輔劑[77]。分離于牛樟芝的化合物Zhankuic acid A、Zhankuic acid C、Methyl antcinate B、Dehydroeburicoic acid、Dehydrosulphurenic acid、15α-Acetyl-dehydrosul-phurenic acid、Sulphurenic acid、3β，15α-Dihydroxylanosta-7，9（11），24-triene-21-oic acid等對草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda）的昆蟲卵巢細胞（Sf 9細胞）具有抑制作用，其中Zhankuic acids A、C和Methyl antcinate B效果較好，同時發(fā)現(xiàn)，牛樟芝多糖能降低Schistosoma mansoni的感染率，這些結(jié)果表明，牛樟芝還具有一定殺蟲效果[78]。

4?栽培技術(shù)

牛樟芝生長緩慢、寄主單一、難形成子實體等特點是限制其開發(fā)利用的瓶頸問題[71]，目前借鑒食藥用菌傳統(tǒng)栽培方法培育牛樟芝是一種保護和利用牛樟芝的關(guān)鍵策略。牛樟芝的人工培育方法主要有3種。一是椴木栽培法，即用牛樟樹椴木作為牛樟芝的培養(yǎng)基質(zhì)，通過噴灑或浸泡接種液體菌種，將其置于合適的溫濕度環(huán)境中進行培養(yǎng)。該方法能誘導(dǎo)牛樟芝長出活性成分與野生牛樟芝接近的子實體，但牛樟樹數(shù)量稀少，培養(yǎng)成本高;牛樟芝生長速度慢，培養(yǎng)時間長（2～3年）;培養(yǎng)過程中容易污染、質(zhì)量較難控制等缺陷限制其大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用[9]。二是固體培養(yǎng)法，即在太空包中填充入纖維物、谷物、雜糧等培養(yǎng)料，滅菌后接入菌種，待菌絲分散布滿培養(yǎng)料時，再開口通氣培養(yǎng)。該方法能在3個月內(nèi)獲得一定量的菌絲體或與野生牛樟芝外形相似的子實體[79]，但其化學(xué)成分與野生牛樟芝存在較大差別，產(chǎn)品質(zhì)量難以保證，極大地限制了其大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用[80]。三是深層液體發(fā)酵法，即利用營養(yǎng)物質(zhì)制成液體狀培養(yǎng)基，滅菌后接入菌種，振蕩培養(yǎng)特定時間后獲得菌體及代謝產(chǎn)物。該方法周期短、成本低、質(zhì)量可控[81]，但發(fā)酵產(chǎn)生的牛樟芝菌絲體所含化學(xué)成分與子實體有較大區(qū)別，尤其是藥用成分三萜類化合物的種類和數(shù)量都較子實體大量減少，藥用價值較低[82]。

聚焦上述瓶頸問題，牛樟芝發(fā)酵工藝成為一個研究熱點。（1）提高牛樟芝菌體生長速度。田雪梅等發(fā)現(xiàn)，28～32 ℃是最適宜菌絲體生長的溫度范圍，日均生長量長達0.384 cm[83]。姚秀英認為，在4 ∶7的大米和水制成的培養(yǎng)基中，菌絲體干質(zhì)量增長迅速，在55 d可達12.89 g[84]。張寶榮確定以葡萄糖為碳源，大豆水解液和玉米漿為氮源，添加硫酸鎂和磷酸氫二鈉制成的培養(yǎng)基為最佳培養(yǎng)基，以溫度28 ℃、搖床轉(zhuǎn)速120 r/min、pH值5.5為最佳培養(yǎng)條件[85]。許正宏等發(fā)明的二次發(fā)酵技術(shù)可縮短40%的發(fā)酵周期，即用一次發(fā)酵產(chǎn)生的無性孢子作為二次發(fā)酵的接種體，實施2次發(fā)酵[86]。（2）誘導(dǎo)子實體形成。目前已報道用小葉紅心樟為椴木，用蒲公英、虎杖、黃連、陳茵、荷葉提取物及蛋白胨作為添加劑，培養(yǎng)150～180 d，能誘導(dǎo)出與野生型外觀、氣味、成分一致的牛樟芝子實體[87]。另外，用馬鈴薯葡萄糖抽出物、葡萄糖作為主要原料，添加山藥、陳皮、當(dāng)歸、柴胡和檳榔等中藥混合物，培養(yǎng)120～150 d，也能培育出與野生型具有相同藥用成分的子實體[88]。陳永得對馬鈴薯培養(yǎng)基進行改進，通過添加用紅曲霉發(fā)酵大米后的營養(yǎng)物，混合發(fā)酵小麥、麩皮浸出液等，能在50～70 d后收獲黃白色菌膜和紅色的子實體[89]。（3）專性誘導(dǎo)藥物成分。菌株是菌絲體活性功能的一個影響因素。研究發(fā)現(xiàn)，從菌株B71、B85和B86等中分離的多糖抗HBV活性具有差異性;菌株B85的菌絲提取物具有最好的舒張血管作用[90]。營養(yǎng)物質(zhì)是菌絲體活性功能的另一個影響因素。以葡萄糖為碳源、蛋白胨和黃豆粉為氮源，能獲得最多數(shù)量和種類的三萜類物質(zhì)[91];多種柑橘屬植物果皮提取物具有促進牛樟芝產(chǎn)生三萜類化合物的效果，其中橘子皮效果最佳，發(fā)酵28 d能增加三萜類化合物含量10倍以上[92];香樟石油醚提取物能增加牛樟芝三萜含量30.78%左右，其中α-松油醇是促進樟芝萜類化合物合成的主要物質(zhì)[17]。另外，培養(yǎng)條件也影響菌絲體的活性功能。Lin等發(fā)現(xiàn)，表多糖生成的最佳培養(yǎng)條件為溫度28 ℃，pH值5.5，時間14 d，額外添加葡萄糖、硝酸鈣、硫酸亞鐵和煙酸（添加量分別為5%、0.5%、0.1%和0.1%）后，能夠產(chǎn)生最大量的表多糖，含量高達0.49 g/L[93]。此外，朱會霞等研究發(fā)現(xiàn)，溶氧濃度（15%～20%）、裝液量（120 mL）、搖瓶轉(zhuǎn)速（150 r/min）和接種量（15%）也可以影響多糖產(chǎn)量[94]。另外，喻學(xué)淳等發(fā)現(xiàn)，用初始含水量為50%的大米作為基質(zhì)，外加2.0 g葡萄糖碳源和0.3 g大豆粉氮源，在1 L三角瓶中裝料110 g發(fā)酵牛樟芝，可獲得最高的Antroquinonol 產(chǎn)量（696.83 mg/kg）[95]。

5?結(jié)論及展望

牛樟芝（Antrodia comphorata）是一種具有潛在應(yīng)用價值的珍稀藥用真菌，具有抗腫瘤、增強免疫力、預(yù)防和治療肝病以及消炎等生物活性，現(xiàn)已從牛樟芝中分離獲得15類325種化合物，并揭示了其中57種化合物的生物活性功能。但因其寄主專一性、野生資源稀有性和人工培育困難性，牛樟芝可持續(xù)發(fā)展面臨嚴峻挑戰(zhàn)。目前，為獲得牛樟芝的子實體、菌絲以及人類需要的有用代謝物，采用椴木栽培、固體培養(yǎng)和深層液體發(fā)酵等方法生產(chǎn)牛樟芝發(fā)酵物，已成為牛樟芝資源利用和保護的重要策略。

聚焦牛樟芝的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，不同來源的牛樟芝菌株其生物活性具有差異性[96];野生子實體與發(fā)酵菌絲和培養(yǎng)液的生物活性功能和化合物組成存在差異性[15];粗提物與分離獲得的純化合物生物活性間缺少對應(yīng)關(guān)系，不同活性化合物間具有協(xié)同作用[97];培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件等因素會影響牛樟芝生長和代謝，進而影響其生物活性和化合物產(chǎn)量[15]。因此，牛樟芝要實現(xiàn)其藥用價值，大量用于藥品生產(chǎn)，并用于臨床治療，須要進一步借助分子生物學(xué)技術(shù)手段揭示其地理起源，選擇具有工業(yè)應(yīng)用價值的標準菌株，進一步發(fā)展活性物質(zhì)診斷的質(zhì)量參數(shù)和活性分析方法，挖掘其新奇化合物和新奇功能，驗證化合物的生物活性，開展臨床試驗研究，揭示化合物的作用機制，并評估其安全性;進一步揭示和組裝子實體誘導(dǎo)和活性化合物激發(fā)因素，以便在人工栽培條件下獲得大量富含功能活性物質(zhì)的發(fā)酵物[97]。

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