黃柳雯，崔 琰，查雨欣，柏 ●，董發(fā)勤，鄧建軍，張青碧，王國俊

(1. 西南醫(yī)科大學 藥學院， 四川 瀘州 646000； 2. 西南醫(yī)科大學 公共衛(wèi)生學院， 四川 瀘州 646000； 3. 四川省疾病預(yù)防控制中心， 四川 成都 610041； 4. 西南科技大學， 四川 綿陽 621010； 5. 綿陽四〇四醫(yī)院， 四川 綿陽 621000； 6. 西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院藥學部， 四川 瀘州 646000)

溫石棉是性能優(yōu)異、儲量豐富、價格低廉的礦物纖維材料，由于具有耐腐蝕、耐高溫、絕緣性好、抗張力強等優(yōu)良性能，被廣泛應(yīng)用于防火、隔熱、防腐、隔音和絕緣等方面(樊晶光等， 2016)。中國石棉資源絕大部分為溫石棉礦，占石棉總產(chǎn)量的95%以上。溫石棉能以纖維的形式在環(huán)境中擴散沉積，造成污染。石棉纖維的環(huán)境暴露會導(dǎo)致多種人類疾病，包括石棉沉滯癥、胸膜斑、肺癌、間皮瘤和非呼吸系統(tǒng)疾病(Huangetal., 2011)。國際上對溫石棉的安全性存在爭議(Yarborough, 2007； Vanchugovaetal., 2008)，一些非石棉生產(chǎn)國，特別是西方發(fā)達國家提倡使用溫石棉的人工代用纖維，如陶瓷纖維、玻璃纖維和巖棉纖維等。人們往往認為只要無石棉化了,其代用纖維及其制品就是安全的。然而在2002年，國際癌癥研究機構(gòu)(IARC)將陶瓷纖維歸類為人類可疑致癌物的2B組，將玻璃纖維和巖棉纖維歸類為現(xiàn)有證據(jù)不能對人類致癌性進行分類的第3組(Andersenetal., 2002)。有研究發(fā)現(xiàn)，陶瓷纖維可誘導(dǎo)工人產(chǎn)生胸膜斑(Lockeyetal., 2012)，表明其可能仍具有生物活性和致病性，因此，開展溫石棉人工代用纖維的安全性研究同等重要。目前對溫石棉和陶瓷纖維致機體炎癥及氧化應(yīng)激的毒性機制研究尚不清楚，有學者提出細胞內(nèi)ROS(活性氧簇)可以引起細胞凋亡和炎癥反應(yīng)(Funahashietal., 2015)，而溫石棉能夠誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生大量活性氧而致氧化損傷和細胞凋亡(Nagaietal., 2011)，陶瓷纖維可通過潛在產(chǎn)生的自由基活性表現(xiàn)出細胞毒性(Eliasetal., 2002)。

目前有較多溫石棉和陶瓷纖維的體外毒性研究，而體內(nèi)動物研究較少。因此本研究擬采用陶瓷纖維和我國青海茫崖礦區(qū)的天然溫石棉對Wistar大鼠進行多次非暴露式氣管滴注染毒，分別于染毒1、6和12個月時，觀察大鼠肺部的病理變化，支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)中白細胞總數(shù)及類型的變化，肺組織中相關(guān)炎性細胞因子白細胞介素-6(interleukin-6, IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)和核因子-κB(nuclear factor-κB, NF-κB)含量的變化，以及活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)、脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(malondiadehyde, MDA)濃度和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活力的變化，為探討和比較溫石棉和陶瓷纖維毒性提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

實驗主要儀器包括：7200型分光光度計(優(yōu)尼柯上海儀器公司)，Multiskan Spectrum酶標儀(美國Thermo公司)，5810R冷凍離心機(德國Eppendorf公司)，HS-800D恒溫水浴箱(華利達實驗設(shè)備公司)，Ultra55場發(fā)射掃描電子顯微鏡(德國蔡司儀器公司)，Mastersizer2000馬爾文激光粒度分析儀(英國馬爾文儀器公司)，X’Pert PRO熒光衍射分析儀(荷蘭帕納科公司)；主要試劑包括：IL-6、TNF-α酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(美國R&D公司)，NF-κB酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(武漢華美生物工程有限公司)，ROS、MDA和SOD檢測試劑盒(南京建成生物制品研究所)。

1. 2 方法

1.2.1 樣品的制備

采自我國青海茫崖礦區(qū)的天然溫石棉(西南科技大學惠贈)和購買的陶瓷纖維(購于淄博民燁耐火纖維有限公司)作為受試物。用高速粉碎機初步粉碎2～3 min，然后用星球磨機分別濕磨18 h和5 h，收集礦漿，置于150 ℃烘箱內(nèi)烘烤2 h，磨碎備用。

1.2.2 理化特性分析

采用掃描電鏡分析溫石棉和陶瓷纖維粉體形貌結(jié)構(gòu)，激光粒度分析儀測定粒徑，X射線熒光光譜儀分析主要化學組分。

1.2.3 實驗動物與分組

選擇健康初斷乳SPF級(specific pathogen free動物，即無特定病原體動物，是指除清潔動物應(yīng)排除的病原外，不攜帶主要潛在感染或條件致病和對科學實驗干擾大的病原的實驗動物)Wistar雄性大鼠54只，4～6 周齡，體重為180～220 g，由西南醫(yī)科大學實驗動物中心提供(經(jīng)西南醫(yī)科大學動物倫理審查委員會同意，合格證號：201601011)，隨機分為3組，即溫石棉染毒組、陶瓷纖維染毒組和陰性對照組(生理鹽水)，每組18只，分籠喂養(yǎng)。

1.2.4 實驗動物染毒及樣品采集

稱取質(zhì)量為0.02 g充分消毒殺菌的粉體，加入生理鹽水，制備成濃度為2.0 mg/mL的粉塵懸液，每次臨用前超聲震蕩30 min。采用非暴露式氣管滴注法染毒質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL粉塵懸液0.5 mL，染毒頻率1次/月。陰性對照組使用生理鹽水，滴注后自由飲水、進食。分別在滴注1、6和12個月時各取材6只。將大鼠麻醉后仰臥固定，迅速取出右肺組織并稱量，分裝于EP管，置 80℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｓ?7℃生理鹽水灌洗大鼠左肺3～5次收集BALF，每次回收率需達到80%?；厥盏墓嘞匆阂? 000 r/min離心15 min，棄上清液，細胞沉淀制成細胞懸液涂于細胞計數(shù)板，Giemsa染色，光鏡下進行白細胞總數(shù)統(tǒng)計及其細胞分類計數(shù)。

1.2.5 大鼠肺組織病理學檢測

選取主支氣管周圍肺組織，經(jīng)生理鹽水反復(fù)沖洗后，置10%甲醛水溶液中固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片，經(jīng)蘇木素-伊紅(HE)染色后光學顯微鏡下觀察肺組織的病理變化。

1.2.6 大鼠肺組織中IL-6、TNF-α和NF-κB的含量測定

白介素-6(IL-6)是由活化的T細胞和成纖維細胞產(chǎn)生的淋巴因子，其失調(diào)的持續(xù)產(chǎn)生會導(dǎo)致各種自身免疫性和慢性炎性疾病的發(fā)生和發(fā)展；腫瘤壞死因子α(TNF-α)是主要由單核細胞和巨噬細胞產(chǎn)生的一種單核因子，具有強大的促炎和免疫調(diào)節(jié)作用；核因子κB(NF-κB)蛋白選擇性的結(jié)合在B細胞κ-輕鏈增強子上調(diào)控許多基因的表達，參與細胞對外界刺激的響應(yīng)，如細胞因子、重金屬、病毒等，在細胞的炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答等過程中起到關(guān)鍵性作用。IL-6、TNF-α和NF-κB的含量測定采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)，具體操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.2.7 大鼠肺組織中ROS、MDA濃度及SOD活力的測定

ROS、MDA濃度及SOD活力的測定分別采用ELISA雙抗體夾心法、硫代巴比妥酸(TBA)比色法和黃嘌呤氧化酶法測定，具體操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1. 3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。定量資料若服從正態(tài)分布、方差齊，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q法檢驗，若方差不齊則采用Kruskal-Wallis檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 溫石棉和陶瓷纖維的形貌分析

由圖1可見，溫石棉纖維呈較硬直的纖維狀或針狀，排列成平行或傾斜的束狀結(jié)構(gòu)；陶瓷纖維多呈柱狀或塊狀，纖維狀顆粒的長徑比更小，纖維直徑分布較廣。

2.2 溫石棉和陶瓷纖維的粒徑分布

2.3 溫石棉和陶瓷纖維的主要化學組分

由表1可見，溫石棉的主要化學成分為SiO2(40.82%)和MgO(39.20%)，還含少量的Fe2O3(4.97%)和Al2O3(2.12%)；陶瓷纖維的主要化學成分為SiO2(54.44%)和Al2O3(43.63%)。

2.4 大鼠肺組織的病理變化

陰性對照組在染毒12個月時才出現(xiàn)少量炎性細胞浸潤。溫石棉和陶瓷纖維染毒組在染毒1個月時，炎性細胞增多、肺間隔輕微增寬、少許淋巴細胞聚集、肺泡結(jié)構(gòu)遭到破壞(如圖3b、3f箭頭所示)；染毒6個月時，上述現(xiàn)象進一步加重并出現(xiàn)少許纖維化、肺間隔斷裂、肺泡融合(如圖3c、3g箭頭所示)；染毒12個月時，陶瓷纖維染毒組病理特征與染毒6個月時比較無明顯變化(如圖3h、3g箭頭所示)，而溫石棉染毒組與染毒6個月時比較病理損害加重，肺泡結(jié)構(gòu)破壞嚴重、出現(xiàn)較多肺大泡和大面積的纖維化(如圖3d、3c箭頭所示)。

圖 1 溫石棉(a)和陶瓷纖維(b)的掃描電鏡圖像 Fig. 1 Scanning electron microscopy image of chrysotile asbestos (a) and ceramic fibers (b)

圖 2 溫石棉(a)和陶瓷纖維(b)的粒徑分布圖Fig. 2 Particle size distribution of chrysotile asbestos (a) and ceramic fibers (b)

表 1 溫石棉和陶瓷纖維的主要化學組分分析 wB/%Table 1 Analyses of main chemical composition of chrysotile asbestos and ceramic fibers

圖 3 溫石棉和陶瓷纖維染毒大鼠肺組織的病理學改變Fig. 3 Pathological changes in lung tissues of rats exposed to chrysotile asbestos and ceramic fibersa、e—1個月和12個月陰性對照組； b～d—1、6和12個月溫石棉染毒組； f～h—1、6和12個月陶瓷纖維染毒組a, e—1 month and 12 months control groups； b～d—1, 6 and 12 months chrysotile asbestos exposure groups； f～h—1, 6 and 12 months ceramic fibers exposure groups

2.5 大鼠BALF中白細胞總數(shù)及分類

本文用SPSS統(tǒng)計軟件進行假設(shè)檢驗得到p值，為原假設(shè)為真時所得到的樣本觀察結(jié)果或更極端結(jié)果出現(xiàn)的概率。如p值很小，說明原假設(shè)情況發(fā)生的概率很小，根據(jù)小概率原理，則拒絕原假設(shè)。統(tǒng)計學根據(jù)顯著性檢驗方法所得到的p值一般以<0.05 為有統(tǒng)計學差異。表2顯示，在染毒的各個時間點，兩個染毒組BALF中白細胞總數(shù)均高于陰性對照組(p<0.05)；兩個染毒組BALF中，白細胞總數(shù)、中性粒細胞和淋巴細胞的百分比均隨染毒時間延長而升高(p<0.05)，巨噬細胞百分比均隨染毒時間延長而下降(p<0.05)，均呈現(xiàn)時間-效應(yīng)關(guān)系(p<0.05)。

2.6 大鼠肺組織中細胞因子IL-6、TNF-α和NF-κB含量的變化

表3顯示，在染毒的各個時間點，兩個染毒組肺組織中IL-6、TNF-α和NF-κB的含量均高于陰性對照組(p<0.05)；兩個染毒組肺組織中IL-6、TNF-α和NF-κB的含量隨染毒時間延長而升高(p<0.05)，均呈現(xiàn)時間-效應(yīng)關(guān)系(p<0.05)；在染毒的各個時間點，溫石棉染毒組肺組織中IL-6、TNF-α和NF-κB的含量均高于陶瓷纖維染毒組(p<0.05)。

2.7 大鼠肺組織中ROS、MDA濃度及SOD活力的變化

表4顯示，在染毒的各個時間點，兩個染毒組肺組織中ROS和MDA濃度均高于陰性對照組(p<0.05)；兩個染毒組肺組織中SOD活力在染毒一個月時與陰性對照組比較無差異(p>0.05)，在染毒6個月和12個月時均低于陰性對照組(p<0.05)；兩個染毒組肺組織中ROS和MDA濃度隨染毒時間延長而升高(p<0.05)，SOD活力隨染毒時間延長而下降(p<0.05)，均呈現(xiàn)時間-效應(yīng)關(guān)系(p<0.05)；溫石棉染毒組肺組織中ROS和MDA濃度在染毒的各個時間點均高于陶瓷纖維染毒組(p<0.05)，SOD活力在染毒一個月時與陶瓷纖維染毒組比較無差異(p>0.05)，在染毒6個月和12個月時均低于陶瓷纖維染毒組(p<0.05)。

3 討論

溫石棉是一種用途極廣的纖維狀硅酸鹽礦物質(zhì)，陶瓷纖維為溫石棉的常用代用纖維，也得到了廣泛應(yīng)用。

本研究病理結(jié)果顯示，溫石棉和陶瓷纖維染毒組都有不同程度的炎性細胞聚集、肺泡結(jié)構(gòu)破壞和纖維化，溫石棉染毒組損傷隨染毒時間延長加重。Kamp(2009)指出顆粒物可刺激ROS在肺部生成，引起肺部損傷和纖維化。Maxim等(2018)研究發(fā)現(xiàn)吸入陶瓷纖維引起肺組織纖維化。本實驗結(jié)果與以上研究結(jié)果基本一致，由此可見，溫石棉和陶瓷纖維可以引起大鼠肺部不同程度的病理損傷。

與其他類型石棉類似，溫石棉纖維進入肺部后也會被巨噬細胞吞噬或破壞上皮細胞滯留在肺間質(zhì)，引發(fā)炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，巨噬細胞的進一步崩解可導(dǎo)致肺部纖維化和炎性反應(yīng)的加重，這被認為是溫石棉致肺部損傷非常重要的機制(Li and Fukagawa, 2010)。Kim等(2001)研究表明，陶瓷纖維被肺泡巨噬細胞吞噬后，導(dǎo)致細胞活力下降，細胞生長受阻，表現(xiàn)出一定程度的細胞毒性作用。本研究結(jié)果顯示，兩個染毒組BALF中白細胞總數(shù)與陰性對照組比較在染毒各時間點均升高；隨著時間延長，兩個染毒組BALF中白細胞總數(shù)、中性粒細胞和淋巴細胞的百分比升高，巨噬細胞的百分比呈現(xiàn)下降趨勢，可能是溫石棉和陶瓷纖維在進入大鼠肺部后，引發(fā)巨噬細胞對異物清除和吞噬的防御反應(yīng)，破壞巨噬細胞并導(dǎo)致其大量崩解，進一步加重肺部炎性損傷，并隨著染毒時間的延長而加重。

炎性細胞因子在維持慢性炎癥、促進腫瘤細胞的進展、抑制免疫系統(tǒng)對腫瘤的監(jiān)視等方面具有重要作用(賓流等，2014)。本研究結(jié)果顯示，在染毒的各個時間點，兩個染毒組肺組織中IL-6、TNF-α和NF-κB含量均高于陰性對照組，且隨染毒時間延長均呈逐漸升高的趨勢。NF-κB可參與石棉介導(dǎo)的慢性炎癥反應(yīng)(Liuetal., 2013)，細胞暴露于不同類型的石棉后，NF-κB含量隨染毒時間延長和染毒劑量的增加而升高，呈現(xiàn)明顯的時間-效應(yīng)關(guān)系和劑量-效應(yīng)關(guān)系(Manningetal., 2002)。此外，NF-κB活化也是細胞暴露于石棉纖維后各種促炎細胞因子和趨化因子表達的核心，其中包括IL-6和TNF-α(Chew and Toyokuni, 2015)。Kumagai-Takei等(2018)在石棉致T細胞長期炎癥研究中發(fā)現(xiàn)，胸膜斑塊和惡性胸膜間皮瘤患者組培養(yǎng)上清液中的IL-6水平較高。Sun等(2012)在納米顆粒引起小鼠肺毒性的研究中發(fā)現(xiàn)，納米顆粒升高了活性氧的積累和脂質(zhì)過氧化水平，并降低抗氧化能力；同時激活NF-κB，升高TNF-α和IL-6的表達水平。本實驗結(jié)果與以上有關(guān)文獻報道一致，提示IL-6、TNF-α和NF-κB三種炎癥因子在溫石棉和陶瓷纖維致大鼠肺組織損傷中起重要作用，使組織出現(xiàn)延續(xù)炎癥反應(yīng)。

炎癥反應(yīng)伴隨著活性氧的生成(Valavanidisetal., 2013)。ROS可通過細胞氧化應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致細胞凋亡和壞死；氧自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)生成MDA，其含量可以代表機體細胞受自由基攻擊的程度。本研究顯示，兩個染毒組肺組織中ROS和MDA的濃度與陰性對照組比較在染毒各時間點均升高，且隨染毒時間的延長均呈上升趨勢。有研究報道溫石棉和陶瓷纖維作用于倉鼠肺細胞(V79)可觀察到細胞內(nèi)ROS的水平的升高(Huoetal., 2018)。鄧建軍等(2009)發(fā)現(xiàn)溫石棉使受損后的巨噬細胞脂質(zhì)過氧化的主要產(chǎn)物MDA增高，自由基清除劑SOD被消耗。本實驗結(jié)果與以上有關(guān)文獻報道一致，提示溫石棉和陶瓷纖維進入大鼠肺部后，機體氧化應(yīng)激程度隨時間延長持續(xù)加深，ROS積累并產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物，使MDA水平增高，導(dǎo)致組織氧化損傷。SOD是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，可清除氧自由基從而降低脂質(zhì)過氧化作用。本研究發(fā)現(xiàn)，與陰性對照組比較，兩個染毒組肺組織中SOD活力在染毒中晚期降低，且隨時間延長呈下降的趨勢。有研究表明A549細胞暴露于石英粉體后，細胞內(nèi)SOD酶活力被激活，酶活力隨染毒時間延長而降低(霍婷婷, 2013)。本實驗結(jié)果與以上有關(guān)文獻報道一致，提示過量的ROS使體內(nèi)抗氧化酶SOD耗竭或失代償，清除自由基的能力降低，導(dǎo)致機體氧化平衡體系被打破，造成組織氧化損傷。

造成溫石棉和陶瓷纖維毒性差異的原因，可能與形態(tài)、粒徑大小和化學組成相關(guān)。本研究中，溫石棉纖維多為尖銳的纖維狀，陶瓷纖維粒徑變化范圍更廣，塊狀較多；溫石棉染毒組肺組織中三種炎癥因子的含量在染毒的各個時間點均高于陶瓷纖維染毒組。有學者推測長纖維更容易引起纖維化或癌癥，但長的人造礦物纖維并不然，它們會橫向斷裂，從而降低了殘留纖維的毒性(Eastesetal., 2007)，這可能是進入肺組織的陶瓷纖維引起較弱炎癥反應(yīng)的原因之一。本研究中，溫石棉和陶瓷纖維化學構(gòu)成均以SiO2為主，溫石棉含較多Fe和Mg元素，而陶瓷纖維含較多的Al元素；溫石棉染毒組肺組織中ROS和MDA濃度在染毒的各個時間點均高于陶瓷纖維染毒組，SOD活力在染毒中晚期均低于陶瓷纖維染毒組。Park和Park(2009)研究發(fā)現(xiàn)納米SiO2能夠?qū)е率笤葱跃奘杉毎蛋l(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)和促炎癥反應(yīng)。Huo等(2018)推測Mg元素可降低溫石棉對V79細胞的死亡率，Al2O3可增強陶瓷纖維的毒性。顆粒物的鐵元素可通過芬頓反應(yīng)誘導(dǎo)羥自由基生成，并影響A549細胞內(nèi)的氧化還原平衡(Dengetal., 2013)。以上相關(guān)文獻提示這些元素含量不同可能導(dǎo)致兩者毒性存在差異，含有較多活性強的Fe元素可能對誘導(dǎo)ROS的生成起關(guān)鍵作用，這可能是在不同染毒時間點，溫石棉氧化損傷作用較陶瓷纖維強的原因之一。

目前關(guān)于溫石棉和陶瓷纖維炎癥和氧化應(yīng)激損傷作用的研究主要采用體外實驗，而長期染毒實驗較少，本研究探討溫石棉和陶瓷纖維毒性差異的因素是否與纖維形態(tài)、粒徑大小、化學組成有關(guān)，提示陶瓷纖維可能會導(dǎo)致與溫石棉類似的健康影響。但非暴露式氣管滴注法可能與現(xiàn)有關(guān)于石棉生物持久性及毒性的結(jié)果缺少可比性。在以后的研究中，本課題組考慮加入吸入染毒方式，并進行方法上的比較，著重探討氧化應(yīng)激產(chǎn)生的通路及氧化應(yīng)激效應(yīng)是否最終會致肺部腫瘤的發(fā)生，為繼續(xù)深入開展溫石棉及人造礦物纖維毒性及其作用機制的研究提供實驗數(shù)據(jù)。

4 結(jié)論

(1) 溫石棉和陶瓷纖維可導(dǎo)致大鼠病理表現(xiàn)為肺泡結(jié)構(gòu)破壞、肺間隔增寬、纖維化等。

(2) 溫石棉和陶瓷纖維使大鼠肺組織中相關(guān)炎性因子IL-6、TNF-α和NF-κB的含量升高；誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生過量ROS、MDA，同時體內(nèi)SOD活力降低，使機體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，氧化和抗氧化平衡被打破，最終造成大鼠的肺部氧化損傷。

(3) 青海茫崖礦區(qū)天然溫石棉致大鼠肺部炎癥和氧化損傷的能力較陶瓷纖維強，這可能與纖維形態(tài)、粒徑大小和化學組成有關(guān)。