唐蘭蘭，鄧胤銘，付茜茜，扈正權(quán)，張青碧，霍婷婷，柏 ●

(1． 西南醫(yī)科大學 公共衛(wèi)生學院， 四川 瀘州 646000； 2． 西南科技大學 固體廢物處理與資源化教育部重點實驗室， 四川 綿陽 621000； 3． 瀘州市環(huán)境監(jiān)測中心站， 四川 瀘州 646000)

大氣顆粒物PM2.5由于具有粒徑小、比表面積大和易吸附空氣中有毒有害物質(zhì)的特點，會對人體造成嚴重危害。大量研究結(jié)果顯示，空氣中PM2.5的濃度與呼吸系統(tǒng)疾病、哮喘和冠狀動脈粥樣硬化等的發(fā)病率、死亡率有緊密的聯(lián)系(Andersonetal., 2012; Gehringetal., 2015; Jacqueminetal., 2015)。PM2.5能深入肺部細支氣管和肺泡，從而刺激機體肺部或全身發(fā)生炎癥和氧化應激(Brooketal., 2010; 章如新等, 2017; 鹿奎奎等, 2017)，造成肺部損傷。由此可見，PM2.5對人健康的影響非常嚴重，應受到廣泛關注。但僅靠環(huán)境污染治理難以在短時間內(nèi)有所成效，因此，尋找合理有效的抗PM2.5損傷的物質(zhì)就很有必要?，F(xiàn)今，已有維生素E(李莉珊等, 2016)、紅景天(劉平安等, 2015)、富硒酵母(劉潔等, 2017)和阿膠(Liuetal., 2018)等具有抗炎、抗氧化物質(zhì)引入了干預PM2.5損傷的研究中。有研究表明，PM2.5暴露能使DNA的甲基化發(fā)生改變，而這些改變被認為可能是PM2.5誘導機體炎癥和氧化應激的基礎(Baccarellietal., 2009; Pannietal., 2016)。而DNA甲基化依賴于能夠提供甲基的營養(yǎng)素(如B族維生素的葉酸、B6、B12、蛋氨酸等氨基酸)(Ramchandanietal., 1999; Dolinoyetal., 2006; Cropleyetal., 2007)。因此，如果能防止異常的DNA甲基化或許能夠抑制PM2.5暴露導致的肺部損傷。B族維生素已用在許多肺部疾病的治療中，但用于干預PM2.5暴露對機體損傷的研究還很少。Zhong 等(2017)對人群的研究結(jié)果顯示復合維生素B的補充能夠阻止PM2.5暴露導致的線粒體DNA甲基化的改變，但維生素B能否最終減緩PM2.5導致的急性肺損傷還需進一步研究。

本研究擬用PM2.5降塵對SD大鼠進行多次非暴露式氣管滴注染毒，給予復合維生素B(葉酸、B6和B12)灌胃干預，觀察大鼠肺部病理變化，收集支氣管肺泡灌洗液測定總蛋白(TP)、乳酸脫氫酶(LDH)、酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)等指標，從而進一步觀察大鼠肺損傷程度的變化，分析復合維生素B對PM2.5所致大鼠肺損傷的保護作用及可能機制，為B族維生素應用于預防PM2.5對健康造成影響提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器與試劑

主要儀器有7200型分光光度計(優(yōu)尼柯上海儀器公司，F(xiàn)J7200)、酶標儀(Thermo Multiskan Spectrum)、5810R冷凍離心機(Eppendorf，5810R)、數(shù)字切片掃描系統(tǒng)(3D Hiestech，Pannoramic 250)，試劑包括總蛋白(TP)、乳酸脫氫酶(LDH)、堿性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和過氧化氫酶(CAT)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.1.2 實驗動物

選用8～10周齡的雄性SD大鼠56只，體重180～200 g，購自西南醫(yī)科大學實驗動物中心[許可證號：SYXK(川)2018-065]。飼養(yǎng)于西南醫(yī)科大學實驗動物中心SPF級動物實驗室，自由飲食飲水，飼養(yǎng)溫度25±1℃，相對濕度50±5%，晝夜節(jié)律為12 h晝夜交替，適應性飼養(yǎng)1周以上。所有的動物研究經(jīng)西南醫(yī)科大學動物保護與實驗倫理委員會批準。

1.1.3 PM2.5降塵的采集與懸液制備

PM2.5降塵樣本由西南科技大學固體廢物處理與資源化教育部重點實驗室提供。將收集到的PM2.5降塵使用臥式行星球磨機(轉(zhuǎn)速40 Hz)于乙醇中研磨 8 h 后，采用激光粒度分析儀測定研磨后樣品在水溶液中的分散粒度，結(jié)果顯示大部分粉塵粒徑≤ 2. 5 μm，符合本實驗要求粒度。采用X射線衍射儀對樣本的物相分析結(jié)果顯示降塵中主要物相為石英(楊潔等, 2017)。將收集到的PM2.5降塵與無菌生理鹽水混合配制成濃度為0.4、2.0、10.0 mg/mL的PM2.5懸液，低溫避光保存，使用前超聲30 min混勻后使用。

1.1.4 復合維生素B的配制

干預組復合維生素B的濃度參考Zhong 等(2017)的研究。每片復合維生素B(Webber Naturals, 加拿大產(chǎn))含1 mg葉酸、50 mg維生素B6、125 μg維生素B12，溶于50 mL純凈水，配得維生素B干預濃度為0.02 mg/mL葉酸、1 mg/mL維生素B6、 0.002 5 mg/mL維生素B12。

1.2 方法

1.2.1 大鼠分組與染毒

設對照組、PM2.5低劑量組(0.4 mg/mL)、PM2.5中劑量組(2.0 mg/mL)、PM2.5高劑量組(10.0 mg/mL)、PM2.5低劑量+復合維生素B組、PM2.5中劑量+復合維生素B組和PM2.5高劑量+復合維生素B組，每組大鼠8只，共56只。干預組和PM2.5組分別以0.01 mL/g的量對大鼠灌胃復合維生素B和純凈水28天后，腹腔注射2%戊巴比妥鈉0.25 mL/100 g麻醉大鼠，采用非暴露式氣管滴注(柏●等, 2017)進行PM2.5染毒，共3次，每次0.5 mL，每次間隔24 h，染毒期間繼續(xù)使用復合維生素B或純凈水灌胃?？瞻讓φ战M用無菌生理鹽水滴注和純凈水灌胃。

1.2.2 樣本采集及處理

末次染毒后24 h將大鼠麻醉仰臥固定，打開胸腔，暴露氣管，灌洗左肺收集支氣管肺泡灌洗液(BALF)(柏●等, 2017)，1 000 r/min離心10 min，收集上清液于塑料離心管中，分裝標記置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。取右?cè)肺葉主支氣管周圍肺組織，經(jīng)生理鹽水反復沖洗后，置于福爾馬林緩沖液固定，石蠟包埋后切片，經(jīng)HE(蘇木素-伊紅)染色，用數(shù)字切片掃描系統(tǒng)(Pannoramic 250)觀察肺組織損傷和炎性細胞浸潤情況。

為進一步明確各處理組大鼠肺損傷的病理分級，根據(jù)Szarka 等(1997)建立的病理學分級標準，將肺損傷狀況分為0～Ⅴ級，分級標準如表1所示。

表 1 急性肺損傷病理學評分標準Table 1 Pathological scoring criteria for acute lung injury

每個劑量組選取8張病理切片，每片鏡下分別截取2張 200 倍彩圖照片，基于炎性細胞浸潤程度以及肺泡壁增厚程度等病理指標進行評分，評分過程中嚴格采用雙盲法進行病理分級。

1.2.3 BALF中TP、LDH、AKP、ACP、MDA、SOD和CAT的測定

用考馬斯亮藍法、2,4-二硝基苯肼比色法、分光光度法、硫代巴比妥酸法、黃嘌呤氧化酶法和鉬酸銨法分別測定BALF中的TP、LDH、AKP、ACP、MDA、SOD和CAT的含量。測試按試劑盒說明書操作(南京建成生物工程研究所)。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

2 結(jié)果

2.1 肺組織病理學形態(tài)改變

不同劑量的PM2.5對肺組織形態(tài)學的改變和復合維生素B干預PM2.5所致肺損傷的結(jié)果見圖1。對照組結(jié)構(gòu)清晰，形態(tài)正常(圖1a)；PM2.5各劑量組有炎性細胞浸潤、肺間隔增寬，部分肺泡塌陷、融合等不同程度病理性改變，且隨染毒劑量的增加而逐漸加重(圖1b、1d、1f箭頭所示)；而PM2.5各劑量對應的復合維生素B干預組中炎性細胞浸潤均有所減少，肺間隔及肺泡塌陷、融合等病理改變有不同程度的減輕(圖1c、1e、1g箭頭所示)。

2.2 大鼠肺組織病理分級

各處理大鼠肺組織病理分級結(jié)果見表2，秩和檢驗結(jié)果顯示總體差異有統(tǒng)計學意義。與空白對照組相比，PM2.5各劑量染毒組的秩均值均升高，且隨染毒劑量的增加而逐漸升高(P<0.05)；PM2.5中、高劑量+復合維生素B組與其對應的染毒組相比，秩均值顯著降低(P<0.05)，而PM2.5低劑量+復合維生素B組與其對應的染毒組相比，秩均值無顯著差異。

圖 1 大鼠肺組織病理學形態(tài)改變Fig. 1 The histopathologic change of rats’ lung tissuesa—空白對照組; b—PM2.5低劑量組; c—PM2.5低劑量+復合維生素B組; d—PM2.5中劑量組; e—PM2.5中劑量+復合維生素B組; f—PM2.5高劑量組; g—PM2.5高劑量+復合維生素B組a—control group; b—low dose of PM2.5 group; c—low dose of PM2.5+vitamin B complex group; d—medium dose of PM2.5 group; e—medium dose of PM2.5+vitamin B complex group; f—high dose of PM2.5 group; g—high dose of PM2.5+vitamin B complex group

分組病理分級0ⅠⅡⅢⅣⅤ秩均值空白對照組4400008.5PM2.5低劑量組(0.4 mg/mL)03410026.94?PM2.5低劑量+復合維生素B組05300021.06PM2.5中劑量組(2 mg/mL)01232039.19?#PM2.5中劑量+復合維生素B組04310024.75&PM2.5高劑量組(10.0 mg/mL)00114249.13?#&PM2.5高劑量+復合維生素B組03230029.94$

*—與空白對照組相比有顯著差異； #—與PM2.5低劑量組相比有顯著差異； &—與PM2.5中劑量組相比有顯著差異； $—與PM2.5高劑量組相比有顯著差異(P<0.05,n=8)。

2.3 大鼠BALF中TP、LDH、ACP和AKP的含量變化

不同劑量的PM2.5及其對應的復合維生素B處理對大鼠BALF中TP、LDH、ACP和AKP含量變化的影響如圖2所示。與對照組相比，低、中、高劑量的PM2.5暴露可引起大鼠BALF中LDH、AKP、ACP和TP含量顯著升高(P<0.05)，且TP含量隨染毒劑量的增加而升高(P<0.05)；PM2.5低、中、高劑量+復合維生素B組的LDH和TP含量顯著降低(P<0.05)；PM2.5低、高劑量+復合維生素B組BALF中ACP含量顯著降低 (P<0.05)；PM2.5中劑量+復合維生素B組BALF中ACP含量無顯著改變；僅有PM2.5低劑量+復合維生素B組AKP含量降低(P<0.05)，其余干預組AKP含量無顯著變化。

圖 2 大鼠BALF中TP、LDH、ACP和AKP的含量Fig. 2 The content of TP, LDH, ACP and AKP in BALF*—與空白對照組相比有顯著差異； #—與PM2.5低劑量組相比有顯著差異； &—與PM2.5中劑量組相比有顯著差異； $—與PM2.5高劑量組相比有顯著差異(P<0.05, n=8)*—significant difference compared with the control group; #—significant difference compared with the low dose of PM2.5 group; &—significant difference compared with the medium dose of PM2.5 group; $—significant difference compared with the high dose of PM2.5 group (P<0.05, n=8)

2.4 大鼠BALF中SOD、MDA和CAT的含量變化

不同劑量的PM2.5及其對應的復合維生素B處理對大鼠BALF中MDA、SOD和CAT的含量變化的影響如圖3所示。與對照組相比，低、中、高劑量的PM2.5染毒可引起大鼠BALF中MDA含量顯著升高(P<0.05)，而SOD和CAT活性顯著降低(P<0.05)，且MDA含量隨染毒劑量的增加而升高(P<0.05)，CAT活性隨染毒劑量的增加而降低(P<0.05)；PM2.5低、中、高劑量+復合維生素B組中MDA含量顯著降低(P<0.05)，而SOD和CAT活性顯著升高(P<0.05)。

圖 3 BALF中SOD、MDA和CAT的含量Fig. 3 The content of SOD, MDA and CAT in BALF*—與空白對照組相比有顯著差異； #—與PM2.5低劑量組相比有顯著差異； &—與PM2.5中劑量組相比有顯著差異； $—與PM2.5高劑量組相比有顯著差異(P<0.05, n=8)*—significant difference compared with the control group; #—significant difference compared with the low dose of PM2.5 group; &—significant difference compared with the medium dose of PM2.5 group; $—significant difference compared with the high dose of PM2.5 group (P<0.05, n=8)

3 討論

PM2.5粒徑小，比表面積大，易于富集空氣中的有毒有害物質(zhì)，通過呼吸道進入肺泡并沉積，通過肺泡入血，隨血液流經(jīng)全身，引起肺部和全身發(fā)生炎癥反應和氧化應激。急性肺損傷(劉平安等, 2015)是各種直接或間接因素導致肺泡上皮細胞及毛細血管內(nèi)皮細胞損傷，主要特征為彌漫性肺間質(zhì)和肺泡水腫，嚴重時可導致急性呼吸窘迫綜合征，至今仍缺乏有效治療方法。因此，尋找合理有效的抗PM2.5損傷的物質(zhì)就很有必要。本研究采用PM2.5降塵對SD大鼠進行多次非暴露式氣管滴注染毒，并給予復合維生素B(葉酸、B6和B12)灌胃干預，探討復合維生素B能否對PM2.5所致大鼠急性肺損傷起到保護作用。

TP主要來源于血漿滲出，是一種滲透性標志物，它的水平能夠反映肺部血管通透性的破壞程度，TP的升高提示肺泡上皮-毛細血管屏障的完整性受到損傷(錢春燕等, 2011)，血漿中的總蛋白、白蛋白大量釋放。LDH和AKP是細胞毒性標志物，LDH屬于胞漿酶，它的升高是反映細胞膜損傷的早期敏感指標；AKP是由肺泡Ⅱ型細胞產(chǎn)生，被認為是肺泡Ⅱ型細胞損傷或増生的一個特異性的生物標志，當細胞膜損傷或者細胞死亡溶解后，體內(nèi)的生物酶LDH、AKP會大量釋放(楊凌, 2014)。ACP是一種溶酶體酶，主要存在于巨噬細胞中，參與肺部的防御反應，當外界異物侵入肺部時，肺巨噬細胞因發(fā)揮吞噬作用而崩解，大量的ACP就會進入肺泡灌洗液(錢春燕等, 2011)。本研究結(jié)果顯示，PM2.5染毒后，BALF中ACP、AKP、LDH和TP的含量明顯增加，肺部出現(xiàn)炎性細胞浸潤、肺間隔增寬，部分肺泡塌陷、融合等病理改變，10.0 mg/mL的PM2.5染毒造成的肺組織病理學形態(tài)改變最為嚴重。在取材過程中還發(fā)現(xiàn)各組肺組織均有不同程度水腫，病理等級也隨染毒劑量的增加呈逐漸加重的趨勢，說明PM2.5進入肺部后改變肺泡Ⅱ型細胞和巨噬細胞細胞膜通透性或使細胞死亡，導致各種細胞酶滲出增加，還能破壞肺泡上皮-毛細血管屏障，造成肺水腫(Matthayetal., 2002)，甚至使肺泡結(jié)構(gòu)被破壞，最終導致急性肺損傷發(fā)生。而復合維生素B的干預使各染毒劑量的大鼠BALF中的ACP、AKP、LDH和TP的含量均呈現(xiàn)降低的趨勢，肺組織水腫和病理損傷均有所緩解，降低肺組織病理學評分，減緩肺損傷。

上述反應可以在一定程度上造成肺損傷，氧化應激同樣也是介導肺損傷的重要途徑。當機體受到氧化損傷時，會刺激機體內(nèi)的抗氧化防御系統(tǒng)，使機體氧化/抗氧化處于平衡狀態(tài)。有研究表明，當給大鼠肺部滴注PM2.5懸液后，由于PM2.5成分中含有大量的重金屬元素，可以使機體產(chǎn)生過量的自由基，當機體清除自由基的能力無法代償時，就會產(chǎn)生氧化損傷，使肺泡上皮和血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生MDA和NO等，同時相關的抗氧化酶如SOD和CAT的含量或活力降低，加速脂質(zhì)過氧化(Gomes and Negrato, 2014)，造成氧化應激，導致機體損傷(Gengetal., 2013; 張岳, 2016)。MDA是脂質(zhì)過氧化過程中的重要中間產(chǎn)物，是反映機體氧化損傷嚴重程度的常用指標，SOD和CAT是反映機體清除氧自由基能力的指標，這3個指標常常配合用來反映機體的氧化應激水平(舒琴, 2013;楊一兵, 2018)。本研究結(jié)果顯示，不同濃度的PM2.5染毒可以使肺泡灌洗液中MDA含量顯著升高，且隨染毒劑量的增加而升高，SOD和CAT活性顯著降低，且CAT活性隨染毒劑量的增加而降低。此結(jié)果與之前的研究結(jié)果一致(Maciejczyketal., 2010; Gomes and Negrato, 2014; 李莉珊等, 2016; 周艷麗等, 2017; 戚子云等, 2019)。這表明當大鼠吸入PM2.5后，肺部氧化和抗氧化平衡被打破，肺泡上皮細胞和血管內(nèi)皮細胞受到損傷，細胞膜通透性增加，最終引起肺損傷。而復合維生素B的干預能在一定程度上逆轉(zhuǎn)此氧化應激，使MDA的含量呈降低的趨勢，SOD和CAT的活力也明顯升高。B族維生素是所有人體組織必不可少的水溶性維生素，人體無法自行制造合成，必須額外補充，廣泛存在于各種食物中。有研究表明，B族維生素中的葉酸可以通過調(diào)控甲基轉(zhuǎn)移酶的活性，刺激DNMTs的mRNA和蛋白表達，提高DNA總甲基化水平，進而影響疾病的發(fā)生發(fā)展(Wenetal., 2015)。葉酸也可在體內(nèi)經(jīng)一碳循環(huán)轉(zhuǎn)化為SAM。SAM是體內(nèi)活性甲基的主要供體，直接參與DNA甲基化反應，進而參與調(diào)控相關基因表達。維生素B6和B12是這一代謝中必要的輔酶因子，其中任意一個的缺乏都會使代謝循環(huán)發(fā)生紊亂，進而影響DNA甲基化。有研究表明，異常的DNA甲基化與許多疾病的發(fā)生發(fā)展有關(Husnietal., 2016)。因此，此3種B族維生素聯(lián)合使用也許可以阻止PM2.5暴露導致的DNA甲基化的改變，從而減少PM2.5暴露對機體的損傷作用，但有關作用機制有待進一步研究。

4 結(jié)論

(1) PM2.5降塵能夠破壞肺泡上皮-毛細血管屏障和肺泡上皮細胞，刺激機體產(chǎn)生過量的自由基，打破機體氧化和抗氧化平衡體系，造成大鼠急性肺損傷。

(2) 復合維生素B能夠減輕PM2.5暴露造成的急性肺損傷，對機體起到一定保護作用。