,*

(1.湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)研究院,湖北武漢 430075;2.湖北省食品質(zhì)量安全檢測(cè)工程技術(shù)研究中心,湖北武漢 430075)

紫杉烷是以紫杉醇為首的一類(lèi)具有五甲基十五碳烯骨架的二萜類(lèi)化合物的總稱(chēng),包括紫杉醇、三尖杉寧堿、巴卡亭Ⅲ、7-表紫杉醇和10-脫乙?；涂ǘ、?10-DAB)等[1-2]。紫杉烷主要存在于紅豆杉屬植物中,是紅豆杉屬植物的一個(gè)顯著特性。紫杉烷為新一代抗腫瘤藥物,臨床上用于治療乳腺癌等多種癌癥[3-5],然而會(huì)產(chǎn)生抑制骨髓造血功能、神經(jīng)毒性等副作用[6-9]。鑒于紅豆杉中紫杉烷的毒副作用,我國(guó)將紅豆杉列入“保健食品禁用物品名單”,禁止其作為保健食品和食品原料使用。但在利益驅(qū)使下,不法商家為了宣傳配制酒的保健功效,非法將紅豆杉添加到配制酒中的案例仍有發(fā)生。目前,我國(guó)尚未有專(zhuān)門(mén)識(shí)別與確證配制酒中是否添加紅豆杉的方法,因此,建立一種通過(guò)測(cè)定配制酒中紫杉烷含量來(lái)鑒別配制酒中是否非法添加紅豆杉的方法,具有重要現(xiàn)實(shí)意義。

目前,有關(guān)紫杉烷的檢測(cè)研究已有很多,檢測(cè)對(duì)象多為紅豆杉[10]、動(dòng)物血液[11]和藥品[12]等,有關(guān)測(cè)定配制酒中紫杉烷從而鑒別配制酒中非法添加紅豆杉的研究未見(jiàn)報(bào)道。紫杉烷的檢測(cè)方法主要有紫外分光光度計(jì)法、液相色譜法、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)等[13-16],其中以HPLC-MS/MS檢測(cè)方法靈敏度最高,特異性好,耗時(shí)較短,且能應(yīng)用于多種紫杉烷的同時(shí)測(cè)定。為了準(zhǔn)確測(cè)定配制酒中紫杉烷含量,從而鑒別配制酒中非法添加紅豆杉的行為。本文選用HPLC-MS/MS技術(shù),選取5種紅豆杉中標(biāo)志性紫杉烷(紫杉醇、三尖杉寧堿、巴卡亭Ⅲ、7-表-紫杉醇和10-脫乙酰基巴卡?、?作為研究對(duì)象,通過(guò)液-液萃取除雜,氮吹濃縮富集目標(biāo)物,甲醇復(fù)溶后過(guò)膜上機(jī)測(cè)定。該方法操作簡(jiǎn)單,靈敏度高,具有較好的準(zhǔn)確度和精密度,滿足配制酒中5種紫杉烷的量檢測(cè)和非法添加的識(shí)別需求,為配制酒的科學(xué)監(jiān)管提供有效的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

網(wǎng)購(gòu)紅豆杉酒(1種) 酒精度38% vol,配料為白酒、紅豆杉和松茸,產(chǎn)地江西省余江縣,購(gòu)自淘寶網(wǎng);自制紅豆杉酒(3種) 酒精度50% vol,實(shí)驗(yàn)室自制;添健酒(陰性空白基質(zhì)) 酒精度35% vol,湖北天健酒業(yè)有限公司;紅豆杉干果 產(chǎn)地云南省昭通市;紫杉醇、三尖杉寧堿 純度≥99.9%,中國(guó)食品藥品檢定研究院;巴卡亭Ⅲ、7-表-紫杉醇 純度≥98%,上海源葉生物科技有限公司;10-DAB 純度≥95%,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;乙腈、甲醇 色譜級(jí),默克公司;甲酸 色譜級(jí),賽默飛世爾公司;二氯甲烷,高錳酸鉀 分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;95%食用酒精 食品級(jí),鄭州市萬(wàn)久化工產(chǎn)品有限公司;超純水 美國(guó)密理博公司純水機(jī)制備。

Triple Quad 4500液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)AB Sciex公司;XS204電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;Allegra X-15R離心機(jī) 貝克曼庫(kù)爾特有限公司;DC-24氮吹儀 上海安譜科學(xué)儀器有限公司;Elmasonic S180H超聲儀 德國(guó)艾爾瑪公司;Talboys數(shù)顯型多管式旋渦混合器 上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 分別精確稱(chēng)取紫杉醇、三尖杉寧堿、巴卡亭Ⅲ、7-表-紫杉醇、10-DAB標(biāo)準(zhǔn)品各10.0 mg,以甲醇溶解配制成1.0 mg/mL的單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,于-20 ℃避光儲(chǔ)存。分別移取各單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量,用甲醇配制為300 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液,于-20 ℃避光儲(chǔ)存。

1.2.2 自制紅豆杉酒 食用酒精稀釋至50% vol,采用0.09 g/L高錳酸鉀氧化處理8 h,再用0.02%活性炭吸附處理24 h,達(dá)到脫臭要求[17]。參照李萬(wàn)祥[18]的方法并做適當(dāng)改動(dòng),將紅豆杉干果粉碎(過(guò)40目篩),加入適量50% vol食用酒精,使紅豆杉干果含量分別為0.2%、1.0%和2.0%,浸提溫度20 ℃,浸提24 h,前12 h每1 h攪拌5 min,過(guò)濾得自制紅豆杉酒,實(shí)驗(yàn)室編碼依次為S1～S3。

1.2.3 樣品前處理 精確稱(chēng)取5 g(精確到0.01 g)配制酒樣品(網(wǎng)購(gòu)紅豆杉酒、自制紅豆杉酒和添健酒)于50 mL離心管中,40 ℃氮吹濃縮至近干,采用6 mL二氯甲烷與3 mL超純水萃取,振蕩渦旋3 min,4000 r/min離心3 min,去除水相,將萃取液二氯甲烷于35 ℃氮吹至干,2 mL甲醇復(fù)溶,經(jīng)0.22 μm有機(jī)系微孔濾膜過(guò)濾后供HPLC-MS/MS檢測(cè)分析分析樣本中5種紫杉烷的含量。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)條件

1.2.4.1 液相條件 色譜柱:Thermo Hypersil Gold C18(100×2.1 mm,3 μm);流動(dòng)相:0. 1%甲酸水(A)和100%乙腈(B);梯度洗脫程序:見(jiàn)表1,流速為0.3 mL/min,進(jìn)樣體積3 μL,柱溫30 ℃。

表1 梯度洗脫程序表Table 1 Gradient elution schedule

1.2.4.2 質(zhì)譜條件 電離模式:電噴霧電離正離子模式(ESI+);噴霧電壓(IS):5500 V;檢測(cè)方式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM);離子化溫度(TEM):450 ℃;氣簾氣(CUR):35 psi;霧化氣(GS1):40 psi;輔助加熱氣(GS2):40 psi;碰撞氣(CAD):Medium;所有氣體由氮?dú)馓峁?純度,99.999%),各化合物組分的質(zhì)譜采集參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 質(zhì)譜分析參數(shù)Table 2 Mass spectrometry parameters for 5 taxanes

注:*為定量離子。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Analyst和MultiQuantTM軟件(美國(guó)AB Sciex公司)采集數(shù)據(jù)并積分,使用Microsoft Excel 2010(美國(guó)微軟公司)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理優(yōu)化

2.1.1 濃縮溫度的選擇 紫杉烷為熱敏性物質(zhì),在提取過(guò)程中易降解成小分子物質(zhì)或發(fā)生轉(zhuǎn)化[19]。配制酒含有較高比例的水,常溫濃縮耗時(shí)過(guò)長(zhǎng),本課題選取水浴溫度為40、50、60 ℃進(jìn)行濃縮試驗(yàn)。結(jié)果表明(圖1),5種紫杉烷回收率在溫度為40 ℃時(shí)最高,50 ℃次之,60 ℃最低,這可能是由于高溫環(huán)境下紫杉烷發(fā)生了降解或轉(zhuǎn)化。因此,本實(shí)驗(yàn)最終選擇40 ℃進(jìn)行濃縮。

圖1 不同水浴溫度對(duì)5種紫杉烷回收率的影響Fig.1 Effect of different temperatureon the recovery of 5 taxanes

2.1.2 凈化條件的選擇 市售配制酒通常原料多樣化,往往呈黃褐色,基質(zhì)較為復(fù)雜,因此需凈化除雜,消除基質(zhì)干擾,提高靈敏度。大量研究表明[10,19-20],二氯甲烷與水萃取能較好分離紫杉烷與水溶性雜質(zhì),因此,本實(shí)驗(yàn)采用二氯甲烷與水萃取去除配制酒中水溶性雜質(zhì),如糖、水溶性色素等,并優(yōu)化了萃取溶劑配比。分別選取二氯甲烷與水配比為6∶1、6∶3、6∶6和6∶9 (v∶v)進(jìn)行試驗(yàn),結(jié)果顯示,二氯甲烷與水配比為6∶6和6∶9時(shí),紫杉醇和10-DAB的回收效果有所降低(圖2)。綜合考慮除雜效果和5種紫杉烷的回收率,最終選擇二氯甲烷與水6∶3 (v∶v)進(jìn)行液-液萃取。

圖2 不同萃取溶劑配比對(duì)5種紫杉烷回收率的影響Fig.2 Effect of different extraction solventratios on the recovery of 5 taxanes

2.2 色譜條件的選擇

考察了不同流動(dòng)相對(duì)5種紫杉烷色譜峰的影響。分別以乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-5 mmol/L乙酸銨水(含0.1%甲酸)作為流動(dòng)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行梯度洗脫。結(jié)果表明,各流動(dòng)相體系下5種紫杉烷均能呈現(xiàn)良好的峰型,但乙腈-水流動(dòng)相體系信號(hào)響應(yīng)略低,其余兩體系信號(hào)相應(yīng)差異不大?？紤]乙酸銨溶液長(zhǎng)期作為流動(dòng)相可能會(huì)堵塞管路以及操作的簡(jiǎn)便性,最終選擇乙腈-0.1%甲酸水作為流動(dòng)相。對(duì)梯度洗脫條件進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果表明采用0.1%甲酸水-乙腈為流動(dòng)相梯度洗脫能夠?qū)崿F(xiàn)5種紫杉烷化合物目標(biāo)峰的有效分離(圖3),5種紫杉烷化合物在11 min內(nèi)出峰完畢。

圖3 5種紫杉烷總離子流色譜圖Fig.3 Total ions chromatogram of 5 taxanes注:1:10-DAB;2:巴卡亭Ⅲ;3:三尖杉寧堿;4:紫杉醇;5:7-表-紫杉醇。

2.3 質(zhì)譜條件的選擇

研究發(fā)現(xiàn),紫杉烷化合物呈現(xiàn)[M+Na]+和[M+H]+兩種電離模式[12,21-22],且結(jié)構(gòu)中富含氧原子的結(jié)構(gòu)容易形成[M+Na]+離子[23-24]。200 ng/mL的紫杉烷單標(biāo)溶液分別注入離子源(ESI源)中,正離子模式下,5種紫杉烷一級(jí)質(zhì)譜圖中[M+Na]+為主要基峰,[M+H]+響應(yīng)較弱,這可能與紫杉烷含有多個(gè)含氧基團(tuán)有關(guān)。但對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行HPLC-MS/MS測(cè)定時(shí),4種紫杉烷以[M+H]+模式下產(chǎn)生的定量和定性離子對(duì)的響應(yīng)明顯高于[M+Na]+所產(chǎn)生的,約為10～30倍,僅巴卡亭Ⅲ差異不大,其原因可能是流動(dòng)相乙腈-0.1%甲酸水更有利于紫杉烷[M+H]+離子的形成。依據(jù)碎片離子響應(yīng),最終選取[M+H]+電離模式下產(chǎn)生的母離子和子離子作為定性、定量離子對(duì),并優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù),具體見(jiàn)表2,碎片離子與文獻(xiàn)報(bào)道大致吻合[12]。

表3 5種紫杉烷的線性關(guān)系與檢出限Table 3 Linear relationship and detection limit for 5 taxanes

表5 紅豆杉酒中5種紫杉烷含量測(cè)定結(jié)果(μg/kg)Table 5 Determination results of 5 taxanes in Chinese yew wine(μg/kg)

2.4 線性范圍及檢出限

分別按0、6、15、30、45、60、90、120 ng/mL的水平配制5種紫杉烷化合物標(biāo)準(zhǔn)品溶液,以5種紫杉烷的色譜峰面積(y)和質(zhì)量濃度(x)做線性回歸,結(jié)果顯示,5種紫杉烷在0～120 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系均良好(r≥0.9982),具體見(jiàn)表3。以S/N=3確定方法檢出限,紫杉醇、7-表-紫杉醇、巴卡亭Ⅲ檢出限為4 μg/kg,三尖杉寧堿、10-DAB檢出限為2 μg/kg。

2.5 方法回收率及精密度實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱(chēng)取一定量的添健酒(陰性空白基質(zhì))樣品,分別按低、中、高3種不同濃度水平添加含5種紫杉烷混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,樣品按1.2.2處理后進(jìn)行測(cè)定,分別計(jì)算5種紫杉烷的平均回收率。結(jié)果見(jiàn)表4,5種紫杉烷的回收率為71.84%～87.68%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.33%～8.82%,與文獻(xiàn)[25]中采用二氯甲烷與水萃取凈化的方法測(cè)定毛榛中紫杉醇含量,當(dāng)紫杉醇添加量為520 μg/kg時(shí)平均回收率為83.3%的結(jié)果接近。該方法具有較好的準(zhǔn)確度及精密度,可對(duì)配制酒中5種紫杉烷進(jìn)行準(zhǔn)確定量檢測(cè)。

表4 5種紫杉烷加標(biāo)回收率和精密度(n=6)Table 4 Sampling recovery and relativestandard deviation of 5 taxanes(n=6)

2.6 樣品測(cè)定

將紅豆杉酒按照1.2.2進(jìn)行預(yù)處理,測(cè)定樣品中5種紫杉烷含量,重復(fù)測(cè)定兩次。結(jié)果見(jiàn)表5,在紅豆杉干果添加量為0.2%、1%、2%的自制紅豆杉酒和網(wǎng)購(gòu)紅豆杉酒中,均能檢出5種紫杉烷化合物,并且各樣本中5種紫杉烷含量均以紫杉醇為最高,這可能是紅豆杉果實(shí)中紫杉醇含量高于其它4種紫杉烷所致[2]。在紅豆杉干果添加量為0.2%的配制酒中,紫杉醇含量為(157.80±8.77) μg/kg,約為檢出限的40倍;其余四種紫杉烷含量較低,其中三尖杉寧堿和10-DAB的含量?jī)H與檢出限接近。因此,當(dāng)配制酒中紅豆杉添加量較低(干果添加量<0.2%)時(shí),可以僅以紫杉醇作為指標(biāo)來(lái)輔助鑒別配制酒中是否加入紅豆杉。由此說(shuō)明,通過(guò)本方法對(duì)配制酒中5種紅豆杉標(biāo)志性紫杉烷的定性定量檢測(cè),能夠有效識(shí)別配制酒中非法添加紅豆杉的行為。

3 結(jié)論

本文建立并優(yōu)化了配制酒中5種紅豆杉標(biāo)志性紫杉烷(紫杉醇、三尖杉寧堿、巴卡亭Ⅲ、7-表-紫杉醇、10-DAB)的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法。樣品采用液-液萃取凈化,操作簡(jiǎn)便,可在12 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)5種紫杉烷的檢測(cè)分析。5種紫杉烷在0～120 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r≥0.9982);紫杉醇、巴卡亭Ⅲ、7-表-紫杉醇檢出限為4 μg/kg,三尖杉寧堿、10-DAB檢出限為2 μg/kg;回收率為71.84%～87.68%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.33%～8.82%。該方法操作簡(jiǎn)單,靈敏度高,能對(duì)配制酒中5種紫杉烷進(jìn)行準(zhǔn)確定量檢測(cè),解決了配制酒中非法添加紅豆杉難以識(shí)別和確證的難題,為配制酒的科學(xué)監(jiān)管提供有效技術(shù)有段。