,2,2,2,2,*

(1.華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院,發(fā)酵工業(yè)分離提取技術(shù)研發(fā)中心,生物反應(yīng)器工程國家重點實驗室,上海 200237;2.上海生物制造技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心,上海 200237)

殼寡糖(Chitooligosaccharides,COS)是由D-氨基葡萄糖(或少量N-乙酰-D-氨基葡萄糖)之間通過β-1,4-糖苷鍵連接而成的聚合度(Degree of polymerization,DP)在2～10之間的低聚糖(及其鹽),結(jié)構(gòu)式見圖1[1-2]。殼寡糖具有溶解度高、吸收能力強和生物相容性好等優(yōu)點,被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域[3]。聚合度是殼寡糖產(chǎn)品的重要參數(shù),不同聚合度殼寡糖表現(xiàn)出不同的生理活性,如抗菌、抗腫瘤、抗氧化等[2,4-5]。Li等[2]通過對DP 3～7殼寡糖活性的研究,發(fā)現(xiàn)殼寡糖清除羥基自由基能力隨著聚合度增加而降低。Chen等[4]研究發(fā)現(xiàn)口服殼二糖和殼三糖可以保護(hù)由于四氯化碳中毒導(dǎo)致的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)小鼠。殼寡糖是殼聚糖的降解產(chǎn)物,一般通過化學(xué)法、物理法和生物法制備,然而直接制備得到的殼寡糖聚合度分布很寬。因此,殼寡糖混合物的分離純化技術(shù)對殼寡糖的研究和應(yīng)用具有重要意義。

圖1 殼寡糖分子式[2]Fig.1 Chitooligosaccharides structure[2]

膜分離是指借助膜的選擇透過性,在外界能量或化學(xué)位差的推動下,對混合物中溶質(zhì)和溶劑進(jìn)行分離、分級、提純和富集的方法[6]。膜分離技術(shù)具有操作簡單、無污染、經(jīng)濟(jì)性好等優(yōu)點,廣泛應(yīng)用于食品、發(fā)酵、醫(yī)藥等領(lǐng)域[7]。基于納濾(nanofiltration,NF)的等體積滲濾(constant volume diafiltration,CVD)模式可以用于寡糖分離純化過程[8-9]。膜分離技術(shù)在殼寡糖制備中常被應(yīng)用于殼聚糖酶解液的處理過程,以制備高品質(zhì)的殼寡糖產(chǎn)品。韓永萍等[10]對殼寡糖溶液進(jìn)行納濾純化,成功去除了單糖、二糖和鹽離子。Dong等[11]利用酶膜耦合分離制備得到了以DP 6～8為主的殼寡糖,收率及純度分別為73.9%和82.2%。Qin等[12]通過酶膜耦合技術(shù)獲得了純度為56.17%的DP 5～10的窄分布?xì)す烟恰＠钤实萚13]利用酶膜耦合技術(shù)制備得到了DP 4～8為主的殼寡糖產(chǎn)品。在膜分離過程中,由于濃差極化等阻力的存在,操作條件會對膜分離過程產(chǎn)生影響,因此通過調(diào)節(jié)物料濃度、溫度和跨膜壓差(transmembrane pressure,TMP)等條件,可以有效提高產(chǎn)品的收率和純度[14-16]。

本研究利用膜分離技術(shù)處理殼寡糖混合物原料,分離制備DP 2～5窄分布的殼寡糖產(chǎn)品。首先,探索了物料濃度、溫度和跨膜壓差等條件對1000 Da納濾膜分離殼寡糖效果的影響,并獲得最佳的分離制備條件;之后,通過對連續(xù)滲濾過程中傳質(zhì)過程的研究,建立了殼寡糖產(chǎn)物純度和收率的預(yù)測模型,并利用500 Da納濾膜對滲濾透過液進(jìn)行濃縮,制備得到DP 2～5的窄分布?xì)す烟?本研究建立了一種基于納濾膜分離的聚合度2～5殼寡糖的制備方法,為殼寡糖的功能研究和應(yīng)用開發(fā)提供了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

殼寡糖混合物(脫乙酰度98.6%,重均分子量1705 Da)、標(biāo)準(zhǔn)品殼二糖((GlcN)2)、殼三糖((GlcN)3)、殼四糖((GlcN)4)、殼五糖((GlcN)5) 惠州長龍生物技術(shù)有限公司;惠州長龍生物技術(shù)有限公司;乙腈 HPLC級,德國默克公司;其他試劑 均為分析純或化學(xué)純。

RNM-1812G型卷式膜設(shè)備 杭州瑞納膜工程有限公司;卷式膜(NF4) 北京中科瑞陽膜技術(shù)有限公司;卷式膜(GE) 美國通用電氣公司;LGJ-18C型冷凍干燥機(jī) 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司;HHS-21-4型電熱恒溫水浴鍋 上海醫(yī)療機(jī)械五廠;CP214C型電子分析天平 奧豪斯儀器(上海)儀器有限公司;Shimadzu LC-20AT型高效液相色譜儀、ELSD-LT-Ⅱ型檢測器 日本島津有限公司;Shodex NH2P-50 4E型色譜柱(4.6 mm ID×250 mm L,5 μm) 日本昭和朝日有限公司;本文使用的兩種卷式膜的詳細(xì)信息見表1。

表1 膜材料和信息Table 1 Membrane materials and properties

1.2 實驗方法

1.2.1 納濾分離條件對分離過程的影響

1.2.1.1 物料濃度 分別配制3 L物料濃度為30、50、70、90和110 g/L的殼寡糖混合物溶液,經(jīng)過抽濾后,在跨膜壓差15 bar、溫度45 ℃、全循環(huán)模式下(透過液和截留液均流入原料罐),運行30 min后,分別取截留液和透過液,并測定一定時間內(nèi)透過液的體積,計算膜通量。通過重量法測定截留液和透過液中殼寡糖混合物的濃度,計算納濾膜對殼寡糖混合物總的表觀截留率。通過HPLC法測定透過液和截留液中不同聚合度殼寡糖的濃度,計算納濾膜對不同聚合度殼寡糖(DP2～7)的表觀截留率。

膜通量Jv為單位時間內(nèi)通過單位膜面積的透過液的體積(L·m-2·h-1),計算如公式(1)所示:

式(1)

其中,Jv表示膜通量,L·m-2·h-1;Vp表示測定時間內(nèi)透過液的體積,L;A表示有效膜面積,m2;t表示測定時間,h。

采用冷凍干燥法測定樣品中殼寡糖混合物的質(zhì)量,通過公式(2)計算濃度:

式(2)

其中,c表示殼寡糖的濃度,g/L;m表示試樣中殼寡糖質(zhì)量,g;V表示樣品體積,L。

表觀截留率計算如公式(3)所示:

式(3)

其中,Robs表示表觀截留率,%;CP和CF分別為透過側(cè)和截留側(cè)溶質(zhì)濃度,g/L。

1.2.1.2 溫度 分別配制3 L物料濃度為70 g/L的殼寡糖混合物溶液,經(jīng)過抽濾后,在跨膜壓差15 bar、溫度分別為25、30、35、40、45和50 ℃,在全循環(huán)模式下,運行30 min后,分別取截留液和透過液,并測定一定時間內(nèi)透過液的體積,計算膜通量。通過重量法測定截留液和透過液中殼寡糖混合物的濃度,計算納濾膜對殼寡糖混合物總的表觀截留率。通過HPLC法測定透過液和截留液中不同聚合度殼寡糖的濃度,計算納濾膜對不同聚合度殼寡糖(DP2～7)的表觀截留率。

1.2.1.3 跨膜壓差 分別配制3 L物料濃度為70 g/L的殼寡糖混合物溶液,經(jīng)過抽濾后,在溫度為45 ℃,跨膜壓差分別為6、9、12、15和18 bar,在全循環(huán)模式下,運行30 min后,分別取截留液和透過液,并測定一定時間內(nèi)透過液的體積,計算膜通量。通過重量法測定截留液和透過液中殼寡糖混合物的濃度,計算納濾膜對殼寡糖總的表觀截留率。通過HPLC法測定透過液和截留液中不同聚合度殼寡糖的濃度,計算納濾膜對不同聚合度殼寡糖(DP2～7)的表觀截留率。

1.2.2 數(shù)學(xué)模型分析及連續(xù)滲濾 配制3 L物料濃度為70 g/L的殼寡糖混合物溶液,經(jīng)過抽濾后,在溫度45 ℃、跨膜壓差15 bar、全循環(huán)模式下,運行30 min后,進(jìn)行滲濾實驗。實驗過程中,每次收集透過液達(dá)到1.5 L時,向物料罐中補充1.5 L去離子水。每當(dāng)透過液達(dá)到3 L時,分別取截留液和透過液,并測定一定時間內(nèi)透過液的體積,計算膜通量。分別測定透過液和截留液樣品中殼寡糖混合物的濃度,用HPLC分析透過液樣品的組分,計算透過液中累積得到的殼寡糖總量。

在滲濾過程中,透過液中每個成分的實際收率計算如公式(4)所示。

式(4)

其中:y表示各組分的收率;CP和CF,i分別為該組分在透過液和初始原料溶液中的濃度,g/L;VF和Vd分別為初始原料溶液體積和滲濾過程中透過液總體積,L。

在滲濾實驗的研究過程中,使用了一種多溶質(zhì)系統(tǒng)的分析方法,將所有的溶質(zhì)分為兩類:小分子溶質(zhì)A(DP 2～5的殼寡糖)和大分子溶質(zhì)B(DP≥6的殼寡糖),利用數(shù)學(xué)模型對實驗結(jié)果進(jìn)行分析,并通過數(shù)學(xué)模型預(yù)測DP 2～5殼寡糖的收率和純度與滲濾倍數(shù)的關(guān)系。本研究是為了在透過液中獲得小分子溶質(zhì)A,盡量將大分子溶質(zhì)B截留,因此主要分析透過液中小分子物質(zhì)A的收率和純度。透過液中小分子物質(zhì)A的收率YP和純度PuP計算分別見公式(5)和(6)。

式(5)

式(6)

在忽略濃差極化效應(yīng)影響的條件下,假設(shè)溶質(zhì)的滲透因子PC(PC=1-R)不受物料罐中溶質(zhì)濃度變化的影響,且整個實驗過程始終為恒體積滲濾過程,可以用數(shù)學(xué)模型對滲濾過程中的傳質(zhì)過程進(jìn)行預(yù)測[19-21]。物料罐中料液濃度和滲濾倍數(shù)關(guān)系式見公式(7)。

式(7)

其中,Vd/VF被定義為滲濾倍數(shù)。

依據(jù)公式(5～7),透過液中小分子物質(zhì)A的預(yù)測收率和純度計算公式分別見(8)和(9)。

式(8)

式(9)

最后,擴(kuò)大滲濾倍數(shù)至15倍,對數(shù)學(xué)模型進(jìn)行驗證,并將透過液作為下一步濃縮制備DP 2～5殼寡糖的原料。

1.2.3 DP 2～5殼寡糖的制備 經(jīng)過上一步連續(xù)滲濾處理之后,高聚合度殼寡糖和DP 2～5的殼寡糖分別被富集在截留液和透過液中。在40 ℃,9 bar的條件下,使用500 Da納濾膜(NF4)對透過液進(jìn)行濃縮,取濃縮液分析組分并計算DP 2～5殼寡糖的收率和純度。

1.2.4 膜的清洗 在膜組件使用前用去離子水測定膜初始水通量,當(dāng)通量衰減低于10%時,表示膜可以繼續(xù)使用。使用后,加入去離子水循環(huán)沖洗3遍后,加入配置好的2 L 0.4 g/L NaOH和0.5 g/L EDTA-2Na混合液,全循環(huán)40 min后,加入去離子水清洗至電導(dǎo)率接近去離子水的電導(dǎo)率且膜通量恢復(fù)初始通量時,表明膜及膜設(shè)備清洗干凈,將拆下的膜組件泡入0.5%(w/v)NaHSO3保護(hù)液,封口并避光保存。

1.2.5 HPLC法定量測定殼寡糖 將待測樣品配制成10 mg/mL的溶液,通過0.45 μm過濾膜過濾后,進(jìn)行HPLC分析,測定樣品中DP 2～7殼寡糖的含量。分析條件如下:色譜柱Shodex NH2P-50 4E;柱溫30 ℃;流速V=1.0 mL/min;進(jìn)樣量10 μL;檢測器為蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD-LT-Ⅱ);以乙腈和水作為流動相梯度洗脫(0～15 min,75%乙腈;15～40 min,75%～50%乙腈;40～45 min,50%～75%乙腈;45～55 min,75%乙腈)[17]。以殼寡糖標(biāo)準(zhǔn)品濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo),峰面積(×104)為縱坐標(biāo)得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程如下:殼二糖(y=126.43x-31.86,R2=0.999);殼三糖(y=105.07x-44.91,R2=0.998);殼四糖(y=93.08x-67.36,R2=0.998);殼五糖(y=34.73x-8.98,R2=0.997)。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算可得樣品中各組分的分布。由于缺少殼六糖((GlcN)6)和殼七糖((GlcN)7)標(biāo)準(zhǔn)品,采用殼五糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算殼六糖和殼七糖的濃度[18]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗重復(fù)三次,單因素實驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,數(shù)學(xué)模型數(shù)據(jù)以平均值表示,采用SigmaPlot 10.0軟件作圖,采用Excel 2013對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析及模型分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 物料濃度對納濾分離效果的影響

如圖2(A)所示,殼寡糖膜分離過程中,隨著物料濃度的增加,膜通量逐漸降低,殼寡糖總的表觀截留率略有降低。隨著物料濃度的增加,物料黏度增加,由于滲透壓增加且跨膜壓差不變導(dǎo)致驅(qū)動力降低,從而導(dǎo)致膜通量的降低[8]。物料濃度對不同聚合度殼寡糖的表觀截留率的影響見圖2(B),隨著物料濃度的增加,殼二糖和殼三糖表觀截留率逐漸降低,殼四糖到殼七糖表觀截留率變化不明顯。隨著物料濃度增加,濃差極化加劇,不可逆膜孔堵塞污染加劇,導(dǎo)致表觀截留率降低。殼六糖和殼七糖的分子量較高,表觀截留率較高(大于95%)且基本不受物料濃度影響。隨著物料濃度的增加,不同聚合度殼寡糖組分之間的表觀截留率差異逐漸增大,更有利于不同組分的分離。但是,物料濃度的增加會導(dǎo)致膜通量降低。根據(jù)目標(biāo)物質(zhì),宜選用擁有較低表觀截留率和較高膜通量的物料濃度,因此,綜合考慮選擇物料濃度70 g/L作為最佳條件。

圖2 物料濃度對膜通量和表觀截留率的影響Fig.2 Effects of feed concentrationon permeate flux and observed rejection 注:A:物料濃度對膜通量和殼寡糖總的表觀截留率的影響;B:物料濃度對不同聚合度殼寡糖表觀截留率的影響。

2.2 溫度對納濾分離效果的影響

溫度對膜通量和殼寡糖總的表觀截留率的影響見圖3(A),隨著溫度的增加,膜通量不斷增加,殼寡糖總的表觀截留率逐漸降低。膜通量增加的原因是由于隨著溫度上升,純水透過系數(shù)增加且物料黏度下降[22]。由圖3(B)可知,隨著溫度的增加,不同聚合度殼寡糖表觀截留率均逐漸降低,表觀截留率下降是由于隨著溫度升高殼寡糖的透過系數(shù)和有效膜孔徑變大[20,23]。隨著溫度的增加,膜通量增加,不同聚合度殼寡糖組分之間的表觀截留率差異逐漸增大,有利于殼寡糖的分離。但是,考慮到膜的最大操作溫度為50 ℃,選擇45 ℃作為最佳操作溫度。

圖3 溫度對膜通量和表觀截留率的影響Fig.3 Effects of temperature on permeateflux and observed rejection 注:A:表示溫度對膜通量和殼寡糖總的表觀截留率的影響;B:表示溫度對不同聚合度殼寡糖表觀截留率的影響。

2.3 跨膜壓差對納濾分離效果的影響

跨膜壓差對膜通量和殼寡糖總的表觀截留率的影響見圖4(A),隨著跨膜壓差的增加,膜通量呈線性不斷增加,殼寡糖總的表觀截留率逐漸降低。由于膜分離過程主要由壓力驅(qū)動,同時受到濃差極化效應(yīng)的影響,因此壓力的增加會直接導(dǎo)致膜通量的增加。由圖4(B)可知,隨著跨膜壓差的增加,不同聚合度殼寡糖組分的表觀截留率均逐漸升高,不同聚合度殼寡糖組分之間的表觀截留率差異逐漸減少,不利于殼寡糖的分離過程。最終選擇15 bar作為最佳跨膜壓差條件。

2.4 數(shù)學(xué)模型分析及連續(xù)滲濾過程

隨著連續(xù)滲濾過程的進(jìn)行,殼寡糖在透過液中不斷累積,滲濾體積對膜通量和透過液中殼寡糖總質(zhì)量的影響見圖5(A)。膜通量在滲濾實驗進(jìn)行的過程中呈現(xiàn)先下降后逐漸上升的趨勢,這是由于第一次補充水前物料罐中殼寡糖混合物溶液被濃縮,濃度增加,而后續(xù)實驗過程中,隨著透過液中的殼寡糖不斷移出,殼寡糖濃度下降。由公式(7)可知,ln(CF/CF,i)和Vd/VF之間存在一定的線性關(guān)系。由實驗數(shù)據(jù)作圖可得圖5(B),由圖中可知,ln(CF/CF,i)和Vd/VF之間存在良好的的線性關(guān)系(R2>0.97),各組分平均滲透因子Pc的計算結(jié)果見表2。

表2 各組分的平均滲透因子Table 2 Average permeation factors of various COS

圖4 跨膜壓差對膜通量和表觀截留率的影響Fig.4 Effects of TMP on permeateflux and observed rejection注:A:跨膜壓差對膜通量和殼寡糖總的表觀截留率的影響;B:跨膜壓差對不同聚合度殼寡糖表觀截留率的影響。

圖5 連續(xù)滲濾對膜通量和透過液中殼寡糖總質(zhì)量及截留液中各組分的影響Fig.5 Effects of continue diafiltration on permeate flux,cumulative permeate quantity of COS and relativeconcentration of each component in retentate注:A:滲濾體積對膜通量和透過液中殼寡糖總質(zhì)量的影響;B:滲濾倍數(shù)對料液中殼寡糖各組分濃度的影響。

圖6 累積滲濾體積與純度和收率的關(guān)系Fig.6 Relationship between cumulativepermeate volume,purity and yield注:A:滲濾體積對透過液中不同聚合度殼寡糖(DP 2～7)實際收率和預(yù)測收率的影響;B:滲濾體積對DP 2～5殼寡糖理論收率和實際收率的影響;C:收率對透過液中窄分布?xì)す烟?DP 2～5)理論純度和實際純度的影響。

通過公式(8)計算得到的各組分預(yù)測收率和實際收率與滲濾體積的關(guān)系見圖6(A),預(yù)測收率與實際收率基本一致,殼三糖到殼七糖偏差值在10%以內(nèi)。因此該模型可以用于預(yù)測滲濾過程中殼寡糖各組分的收率。

由圖5(A)可知,在滲濾倍數(shù)為8倍時,滲濾并未達(dá)到平衡,可以通過擴(kuò)大滲濾倍數(shù)提高收率。根據(jù)該模型計算DP 2～5殼寡糖混合物純度和收率的理論值,擴(kuò)大滲濾倍數(shù)測定實際收率及純度進(jìn)行實驗驗證,結(jié)果如圖6(B)和6(C)。隨著累積滲濾體積的增加,DP 2～5殼寡糖的實際收率與理論收率保持一致;隨著收率的增加,透過液中DP 2～5殼寡糖的純度略有降低,且實驗數(shù)據(jù)與理論數(shù)據(jù)誤差范圍在4%之內(nèi)。當(dāng)滲濾倍數(shù)達(dá)到15時(滲濾體積達(dá)到45 L),DP 2～5殼寡糖的收率為52.3%,純度為82.0%,與預(yù)測值相吻合。

2.5 濃縮制備DP 2～5窄分布?xì)す烟?/h3>

經(jīng)1000 Da膜分離得到的透過液,再經(jīng)過500 Da納濾膜濃縮后,殼寡糖混合物原料和最終產(chǎn)品的HPLC分析結(jié)果如圖7所示。窄分布?xì)す烟墙M成為殼二糖5.4%(w/w),殼三糖18.6%(w/w),殼四糖25.5%(w/w),殼五糖32.6%(w/w),殼六糖12.7%(w/w),殼七糖5.0%(w/w)和少量高聚合度殼寡糖。而原料中殼寡糖組成為:殼二糖3.3%(w/w),殼三糖10.3%(w/w),殼四糖19.6%(w/w),殼五糖34.3%(w/w),殼六糖21.4%(w/w),殼七糖5.0%(w/w)和高聚合度殼寡糖(DP>7)。通過膜分離技術(shù)在產(chǎn)品中富集了DP 2～5的殼寡糖,提高了DP 2～5殼寡糖的純度,最終得到的產(chǎn)品中DP 2～5的殼寡糖的純度為82.1%,總收率為42.1%。

圖7 殼寡糖原料和膜分離所得窄分布?xì)す烟钱a(chǎn)物的HPLC分析圖Fig.7 HPLC analysis of raw materialsand membrane separation product注:A:殼寡糖原料;B:膜分離所得窄分布?xì)す烟钱a(chǎn)物。

3 結(jié)論

本文研究了不同條件對殼寡糖膜分離過程的影響,獲得了1000 Da納濾膜分離殼寡糖的最佳條件,即物料濃度70 g/L、溫度45 ℃和跨膜壓差15 bar。利用數(shù)學(xué)模型成功預(yù)測了滲濾過程中目標(biāo)聚合度殼寡糖收率和純度與滲濾倍數(shù)的關(guān)系,最后采用兩步膜分離即滲濾和濃縮的方法制備得到了DP 2～5的窄分布?xì)す烟?純度和收率分別為82.1%和42.1%。本研究建立了特定聚合度區(qū)間殼寡糖膜分離制備工藝,為殼寡糖的功能研究和應(yīng)用提供了技術(shù)支持。