李德海1,朱曉冉1,王 路2,*,王振宇2,趙楠楠1,龔金華

(1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150040;2.哈爾濱工業(yè)大學(xué)化工與化學(xué)學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150090;3.香港教育大學(xué)博文及社會(huì)科學(xué)學(xué)院科學(xué)與環(huán)境學(xué)系,香港 999077)

龍牙楤木(Araliaelata)別稱(chēng)遼東楤木、刺老芽、虎陽(yáng)刺等,是五加科楤木屬的多年生落葉灌木,主要分布于亞洲和北美洲,在我國(guó)主要分布于黑龍江東北部、吉林中部以及遼寧東北部等地區(qū)[1]。龍牙楤木全柱可入藥,味苦、辛,性平,具有活血化瘀、補(bǔ)氣安神、強(qiáng)精滋腎、除濕止痛之功效,可用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)衰弱、肝炎、糖尿病及腫瘤等。龍牙楤木營(yíng)養(yǎng)豐富,含有碳水化合物、氨基酸、礦物質(zhì)、維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及皂苷、多糖、多酚等多種活性成分,有“山野菜之王”的美譽(yù)。皂苷類(lèi)化合物廣泛存在于楤木屬植物中,是龍牙楤木主要藥效成分,從龍牙楤木根、莖、葉、嫩枝等部位共分離鑒定出100余種皂苷。皂苷具有抑菌、抗炎、降血脂、保肝、抗癌和防治糖尿病、調(diào)節(jié)心腦血管系統(tǒng)等多種生物功能[2-5],可用于醫(yī)藥和功能食品等領(lǐng)域,具有廣泛的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。

目前對(duì)龍牙楤木皂苷的提取多采用熱回流、微波、超聲波[6]、閃式提取法[7]等輔助方法,單一方法存在著用時(shí)長(zhǎng)、能耗高、提取不完全等缺點(diǎn)[8],因此本試驗(yàn)將超聲波技術(shù)和真空技術(shù)結(jié)合起來(lái)提取龍牙楤木皂苷,超聲波因其熱效應(yīng)、空化效應(yīng)和機(jī)械剪切效應(yīng)能夠迅速破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu),加速活性物質(zhì)的擴(kuò)散溶解而應(yīng)用廣泛,而真空條件下降低了熱敏性物質(zhì)隨溫度升高造成的氧化和降解,且使體系沸點(diǎn)降低,提取液更加活躍,從而加快提取速率[9]。

本試驗(yàn)以龍牙楤木為試驗(yàn)原料,乙醇溶液為提取溶劑,在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,利用響應(yīng)面法優(yōu)化了真空耦合超聲波提取龍牙楤木皂苷的工藝,并將真空耦合超聲波制備的龍牙楤木皂苷與常壓超聲、溶劑提取條件下制備的龍牙楤木皂苷的抗氧化活性和抑菌活性進(jìn)行對(duì)比分析,為龍牙楤木這一藥食同源性木本植物更好的開(kāi)發(fā)利用、更全面地發(fā)揮其藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮龍牙楤木樣品全柱 采自遼寧省丹東市,經(jīng)哈爾濱工業(yè)大學(xué)王振宇教授鑒定為五加科植物龍牙楤木(Araliaelata);大腸桿菌EscherichiacoliATCC25922、金黃色葡萄球菌StaphylococcusaurousRosen Bach ATCC6538、枯草芽孢桿菌BacillusSubtilisATCC6633 上海艾研生物科技有限公司;齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)508-02-1,純度≥98%)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH) 美國(guó)Sigma公司;D101大孔樹(shù)脂 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;香草醛、冰醋酸、抗壞血酸、無(wú)水乙醇等其它試劑均為分析純 上海源葉生物科技有限公司。

SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;RT-6000酶標(biāo)儀 深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司;KQ-700GVDV型三頻恒溫?cái)?shù)控超聲波清洗器 江蘇省昆山市超聲波儀器有限公司;DHP-9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;BHC-1300IIA2 超凈工作臺(tái) 蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司;LGJ-25C 型冷凍干燥機(jī) 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原料預(yù)處理 龍牙楤木新鮮樣品40 ℃烘48 h后粉碎過(guò)60目篩,按1∶20料液比加入30～60 ℃石油醚脫脂脫色6 h,過(guò)濾,濾渣通風(fēng)櫥自然揮干溶劑后于4 ℃保藏備用。

1.2.2 真空耦合超聲波提取龍牙楤木皂苷的單因素實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確稱(chēng)取預(yù)處理的龍牙楤木2.00 g于燒瓶?jī)?nèi),按一定的料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 g/mL)加入一定的體積分?jǐn)?shù)(20%、40%、60%、80%、100%)的乙醇溶液,按照?qǐng)D1連接好提取設(shè)備,開(kāi)啟真空泵形成負(fù)壓,通過(guò)三通閥調(diào)節(jié)真空度(0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09 MPa),使提取液保持微沸,同時(shí)啟動(dòng)超聲儀器,在超聲溫度(20、30、40、50、60、70 ℃)和超聲功率(150、180、210、240、270、300 W)條件下提取一定時(shí)間(30、40、50、60、70 min),離心定容得龍牙楤木皂苷提取液。料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、真空度、超聲溫度、超聲功率和超聲時(shí)間的固定水平分別為1∶25 g/mL、60%、0.06 MPa、60 ℃、210 W、30 min,在對(duì)各因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)探究時(shí),其他因素均取固定水平。

圖1 真空超聲波設(shè)備連接圖Fig.1 Schematic representation of the experimental setupused for ultrasonic-vacuum assisted extraction

1.2.3 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)聯(lián)用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,通過(guò)Plackett-Burman試驗(yàn)確定對(duì)龍牙楤木皂苷提取得率影響顯著的因素,采用中心組合Box-Benhnken Design(BBD)設(shè)計(jì)試驗(yàn)進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化真空耦合超聲波提取龍牙楤木皂苷工藝[10]。篩出顯著因素進(jìn)行響應(yīng)面中心組合試驗(yàn),響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)表見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)Table 1 Box-Behnken design test factor and level design

1.2.4 龍牙楤木皂苷得率的測(cè)定 采用香草醛-冰醋酸-紫外分光光度法[12],以齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),溶液吸光度為縱坐標(biāo),得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=6.9129x-0.00788,R2=0.9993

式中:C為提取液中皂苷濃度,mg/mL;N為稀釋倍數(shù),V為提取液體積,mL;M為原料質(zhì)量,g。

1.2.5 不同提取方法的比較 試驗(yàn)課題組采用響應(yīng)面優(yōu)化了真空耦合超聲波、常壓超聲、溶劑提取法提取龍牙楤木皂苷的工藝,真空耦合超聲波最佳提取工藝為:液料比1∶24.8 g/mL、乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、超聲溫度57.7 ℃、超聲功率273 W、超聲時(shí)間50 min、真空度0.0787 MPa。常壓超聲最佳提取工藝為:液料比1∶25 g/mL、乙醇體積分?jǐn)?shù)82.95%、超聲溫度82.62 ℃、超聲功率300 W、超聲時(shí)間78.88 min。溶劑提取法最佳提取工藝為:液料比1∶29.85 g/mL、乙醇體積分?jǐn)?shù)81.65%、提取溫度83.95 ℃、提取時(shí)間120 min?？紤]到實(shí)際操作可能性,對(duì)三種提取方法最佳提取條件略作調(diào)整后進(jìn)行響應(yīng)面驗(yàn)證試驗(yàn),真空耦合超聲波法工藝參數(shù)調(diào)整為:料液比1∶25 g/mL、乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、超聲溫度58 ℃、超聲功率270 W、超聲時(shí)間50 min、真空度0.08 MPa,常壓超聲法工藝參數(shù)調(diào)整為:液料比1∶25 g/mL、乙醇體積分?jǐn)?shù)83%、超聲溫度83 ℃、超聲功率300 W、超聲時(shí)間79 min,溶劑提取法工藝參數(shù)調(diào)整為:液料比1∶30 g/mL、乙醇體積分?jǐn)?shù)82%、提取溫度84 ℃、提取時(shí)間120 min。

1.2.6 龍牙楤木皂苷抗氧化活性的測(cè)定

1.2.6.1 DPPH·清除能力的測(cè)定 參考文獻(xiàn)[13]的方法,在2.00 mL龍牙楤木皂苷樣液中加入2.00 mL 0.1 mmol/L DPPH·溶液,混勻室溫下避光靜置20 min后,在517 nm處測(cè)定吸光值,DPPH·清除率按下列公式計(jì)算。

式中:A0為樣品空白組吸光值;A1為樣品組吸光值;A2為對(duì)照組吸光值。

式中:A0為樣品空白組吸光值;A1為樣品組吸光值;A2為對(duì)照組吸光值。

1.2.6.3 總還原能力的測(cè)定 參考文獻(xiàn)[15]的方法,并作出改動(dòng)。龍牙楤木皂苷樣液1.00 mL加入2.50 mL 1%鐵氰化鉀溶液,在50 ℃下反應(yīng)20 min,速冷后向溶液加入2.50 mL 10%的三氯乙酸溶液,5 min 后,加入5.00 mL去離子水,0.50 mL 0.1%三氯化鐵溶液,反應(yīng)30 min,在700 nm處測(cè)定吸光值。

1.2.7 龍牙楤木皂苷抑菌活性的測(cè)定 采用濾紙片擴(kuò)散法[16],在無(wú)菌條件下取100 μL 含菌數(shù)為106CFU/mL菌懸液均勻涂布于培養(yǎng)基上,用無(wú)菌鑷子夾取直徑為6 mm的濾紙片,平鋪在含菌培養(yǎng)基上,取15 μL不同濃度的龍牙楤木皂苷提取物滴在濾紙片上,采用無(wú)菌蒸餾水作為陰性對(duì)照,青霉素-鏈霉素混合液作為陽(yáng)性對(duì)照,37 ℃培養(yǎng)24 h 后,用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑。

采用二倍稀釋法對(duì)龍牙楤木皂苷提取物的抑菌活性進(jìn)行定量分析[17]。在滅菌試管內(nèi),依次加入不同濃度的龍牙楤木皂苷溶液和液體培養(yǎng)基,使總體積為4 mL。每個(gè)試管中再加入50 μL含菌量為106CFU/mL菌懸液,37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)24 h。試管中分別取50 μL含龍牙楤木皂苷提取液的菌懸液涂布于平板上,每個(gè)濃度梯度重復(fù)涂布3次,培養(yǎng)24 h完全不長(zhǎng)菌落時(shí)的濃度為最小抑菌濃度MIC值,培養(yǎng)48 h完全不長(zhǎng)細(xì)菌時(shí)的濃度為最小殺菌濃度MBC值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)均平行檢測(cè)3次,利用Design-Expert 8.0.5、SPSS 21.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析,并用Origin 8.0作圖,數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)方差(means±SD)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 料液比對(duì)龍牙楤木皂苷得率的影響 由圖2可知,料液比在1∶10～1∶25 g/mL的范圍內(nèi),隨著乙醇提取溶液用量的不斷增大,龍牙楤木皂苷的得率也在不斷增加,龍牙楤木皂苷最高得率為3.99%,但是當(dāng)料液比超過(guò)1∶25 g/mL時(shí)龍牙楤木皂苷得率呈下降趨勢(shì)。這是因?yàn)榱弦罕冗^(guò)低不利于真空超聲體系活躍形成微沸騰狀態(tài),隨著提取液的增加,加大了質(zhì)量濃度差及固液接觸面積,有利于提高真空超聲體系下微沸騰狀態(tài)分子擴(kuò)散速度,同時(shí)隨著料液比的增大,溶劑傳質(zhì)推動(dòng)力增大,使龍牙楤木物料與提取溶液充分接觸,擴(kuò)散到溶液中的皂苷也就越多[18]。但是料液比過(guò)大,分子擴(kuò)散速度幾乎不會(huì)發(fā)生明顯變化。但漢龍等[19]提取無(wú)患子皂苷發(fā)現(xiàn)料液比超過(guò)1∶30 g/mL不利于協(xié)同浸提,得率反而下降,同時(shí)料液比過(guò)大也會(huì)造成溶劑和能源的浪費(fèi),給后續(xù)的分離工作增加難度,因此選擇1∶25 g/mL為最佳的皂苷提取料液比。

圖2料液比對(duì)皂苷得率的影響Fig.2 Effect of liquid-to-solid ratioon the yield of saponins

2.1.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)龍牙楤木皂苷得率的影響 由圖3可知,當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)由20%上升至80%時(shí),龍牙楤木皂苷得率隨之上升,乙醇體積分?jǐn)?shù)80%時(shí),皂苷得率最高為3.61%,比乙醇體積分?jǐn)?shù)20%的得率高出97.27%,繼續(xù)升高乙醇的體積分?jǐn)?shù),皂苷得率下降。由結(jié)果可知,乙醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)高或過(guò)低都不利于龍牙楤木皂苷類(lèi)化合物的溶出。這可能是因?yàn)樵碥针m可溶于水,但水不能破壞氫鍵,加入乙醇可破壞氫鍵,從而提高皂苷的得率,但當(dāng)乙醇濃度過(guò)高時(shí),由于真空超聲體系下乙醇更易揮發(fā),上升的蒸汽無(wú)法及時(shí)回流入體系內(nèi),使得皂苷提取得率下降。趙亞?wèn)|等[20]采用超聲輔助乙醇溶液提取青海藜麥皂苷,單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明乙醇體積分?jǐn)?shù)90%時(shí),得率最高。進(jìn)一步提高乙醇濃度皂苷提取為下降的趨勢(shì),其認(rèn)為是乙醇濃度過(guò)高,導(dǎo)致細(xì)胞緊縮,影響皂苷進(jìn)入溶劑。皂苷是一類(lèi)極性化合物,乙醇溶液是極性溶液,乙醇溶液濃度的變化勢(shì)必導(dǎo)致溶液極性的改變,物質(zhì)在其極性接近的溶液中溶解度最好,因此選擇80%乙醇溶液為最佳的皂苷提取乙醇體積分?jǐn)?shù)。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)皂苷得率的影響Fig.3 Effect of ethanol concentrationon the yield of saponins

2.1.3 真空度對(duì)龍牙楤木皂苷得率的影響 由圖4可知,在0.04 MPa接近常壓條件下,龍牙楤木皂苷的提取得率為2.52%,而在0.08 MPa接近真空時(shí),龍牙楤木皂苷的提取得率為3.98%,是0.04 MPa條件下的1.58倍。試驗(yàn)結(jié)果表明相同試驗(yàn)條件下,減壓處理比常壓條件更有利于龍牙楤木皂苷的溶出,這是因?yàn)檎婵斩壬仙?提取液沸點(diǎn)降低,體系活躍能很快縮小溶液的濃度差,加快有效成分向溶液里擴(kuò)散速度。同時(shí),超聲波的空化效應(yīng)是從液體內(nèi)部溶液形成,即從內(nèi)部產(chǎn)生微小汽泡并迅速長(zhǎng)大和膨脹的作用,因此可活躍提取體系,加速植物細(xì)胞膜的破裂,從而起到了提高活性成分的釋放,因而皂苷得率上升,但由于真空度繼續(xù)上升,提取體系劇烈沸騰,導(dǎo)致乙醇蒸汽無(wú)法迅速冷凝回流入提取體系,造成皂苷提取得率的下降[9]因此選擇0.08 MPa為皂苷最佳提取真空度。

圖4 真空度對(duì)皂苷得率的影響Fig.4 Effect of vacuum degreeon the yield of saponins

2.1.4 超聲溫度對(duì)龍牙楤木皂苷得率的影響 由圖5可知,在20～60 ℃范圍內(nèi),隨著超聲溫度的升高,龍牙楤木皂苷的得率呈上升趨勢(shì),皂苷得率峰值為3.84%,這是因?yàn)殡S著超聲溫度升高,真空超聲體系空化泡數(shù)量增多,逐漸形成微沸騰轉(zhuǎn)態(tài),同時(shí)提取溶液的黏度降低,擴(kuò)散系數(shù)增加,從而增大龍牙楤木皂苷的溶出。繼續(xù)升高溫度,皂苷的得率不再上升且劇烈下降。皂苷類(lèi)化合物本不是熱敏性物質(zhì),其超過(guò)一定超聲溫度得率劇烈下降可能是因?yàn)樵谡婵諚l件下,提取溶液的沸點(diǎn)降低,超聲溫度過(guò)高體系劇烈沸騰,導(dǎo)致提取溶劑揮發(fā)過(guò)快,無(wú)法及時(shí)冷凝回流,造成一定的損失,此外隨著溫度的繼續(xù)升高,葉綠素、纖維素等雜質(zhì)溶出增多[21],因此為保證提取得率,最佳超聲溫度為60 ℃。

圖5 超聲溫度對(duì)皂苷得率的影響Fig.5 Effect of extraction temperatureon the yield of saponins

2.1.5 超聲功率對(duì)龍牙楤木皂苷得率的影響 由圖6可知,隨著超聲功率的增加,龍牙楤木皂苷得率呈先上升后平緩的趨勢(shì),在270 W時(shí)提取得率達(dá)到峰值,最大提取得率為3.98%,是提取功率為150 W時(shí)的1.39倍,這是因?yàn)槌暡ǖ臒嵝?yīng)、空化效應(yīng)和機(jī)械剪切效應(yīng)能夠迅速破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu),促進(jìn)了分子間相互運(yùn)動(dòng)作用的程度,加速皂苷類(lèi)化合物擴(kuò)散溶解,同時(shí)負(fù)壓條件使超聲波空化效應(yīng)產(chǎn)生的空化泡數(shù)量增加,有利于提取體系的活躍從而提高了皂苷的得率,考慮到270 W后皂苷得率基本不再變化,且進(jìn)一步提高超聲功率能耗增大,因此選擇超聲波功率270 W為最佳提取條件。

圖6 超聲功率對(duì)皂苷得率的影響Fig.6 Effect of ultrasound poweron the yield of saponins

表2 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Results of Plackett-Burman experimental design

表3 Plackett-Burman試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 3 Results of Plackett-Burman variance analysis

2.1.6 超聲時(shí)間對(duì)龍牙楤木皂苷得率的影響 由圖7可知,在超聲時(shí)間30～50 min的范圍內(nèi),隨著時(shí)間的延長(zhǎng),真空耦合超聲波提取龍牙楤木皂苷的得率逐漸增加,最大提取得率為3.89%,當(dāng)超聲時(shí)間超過(guò)50 min,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),皂苷得率呈現(xiàn)略微下降趨勢(shì),其原因可能是超聲波效應(yīng)使細(xì)胞破碎的越來(lái)越完全,同時(shí)低壓條件下體系活躍,因而皂苷得率上升,繼續(xù)超聲由于提取體系的負(fù)壓條件,分子運(yùn)動(dòng)劇烈,皂苷溶出的同時(shí)細(xì)胞內(nèi)大量不溶物及較多黏液質(zhì)等混入提取液中,使溶液黏度增大,傳質(zhì)阻力增大,影響皂苷的進(jìn)一步溶出[22],因此選取超聲時(shí)間50 min為最佳超聲時(shí)間。

2.2 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果

表4 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Results of Box-Behnken experimental design

表5 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Table 5 Significance test of regression equation coefficients

采用Plackett-Burman試驗(yàn)對(duì)影響因素進(jìn)行顯著性分析,試驗(yàn)設(shè)計(jì)和方差分析結(jié)果見(jiàn)表2和表3,其中顯著影響因素依次為:料液比、超聲溫度、真空度、超聲功率,影響不顯著因素為乙醇體積分?jǐn)?shù)和超聲時(shí)間,因此采用Box-Behnken中心組合試驗(yàn),以料液比(A)、超聲功率(B)、超聲溫度(C)、真空度(D)為自變量,龍牙楤木皂苷得率為因變量,建立4因素3水平響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

利用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件Design Expert 8.0.5軟件建立數(shù)學(xué)回歸模型,確定龍牙楤木皂苷最佳提取工藝條件,響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表4和表5。

采用Design-Except 8.05軟件對(duì)表4試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合,獲得的響應(yīng)值皂苷得率(Y)對(duì)液料比(A)、超聲功率(B)、超聲溫度(C)、真空度(D)真實(shí)值的回歸模型方程為:Y=4.17+0.058A+0.12B-0.20C-0.16D+0.20AB+0.20AC+0.18AD-0.31BC-0.052BD-0.0025CD-0.27A2-0.77B2-0.53C2-0.48D2。

圖8 各因素交互作用影響皂苷提取得率的響應(yīng)面圖Fig.8 Response surface and contour plots showing the effect of interactions among various factors on the yield of saponins

由表5可知模型的P值小于0.0001,表明該模型二次方程極顯著,失擬項(xiàng)不顯著(P=0.3981)。回歸方程的決定系數(shù)R2為0.9683,說(shuō)明該回歸方程能很好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系,可以用其確定最佳提取工藝條件。調(diào)整決定系數(shù)為0.9366,說(shuō)明該模型能夠解釋93.66%的響應(yīng)值變化,因而模型的擬合度良好,可對(duì)不同提取條件下龍牙楤木皂苷提取得率進(jìn)行預(yù)測(cè)。由方差分析結(jié)果可知,超聲溫度對(duì)龍牙楤木皂苷的得率影響最大,其次依次是真空度、超聲功率、料液比。模型中一次項(xiàng)A和交互項(xiàng)BD、CD差異不顯著,一次項(xiàng)B、C、D,交互項(xiàng)AB、AC、BC以及二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2對(duì)龍牙楤木皂苷得率均有極顯著的影響。

根據(jù)龍牙楤木皂苷回歸模型做出相應(yīng)的三維球面圖,如圖8所示。響應(yīng)面曲面的坡度可反映該因素對(duì)龍牙楤木皂苷得率影響的強(qiáng)弱程度。等高線的形狀表明因素之間的交互影響是否顯著。圓形等高線表明兩因素之間的交互影響不顯著;橢圓形等高線表明兩因素之間的交互影響顯著[23]。如圖8a～圖8d所示,響應(yīng)面顯示坡度較陡,等高線呈馬鞍形或橢圓形,表明液料比和超聲功率、液料比和真空度及超聲溫度和超聲功率之間交互作用顯著,對(duì)龍牙楤木皂苷的提取得率影響較大,這與方差分析結(jié)果一致。超聲功率和真空度、超聲溫度和真空度交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響都不顯著,表現(xiàn)為曲線平滑,等高線為圓形,與方差分析結(jié)果相符。

2.4 回歸模型的驗(yàn)證

對(duì)真空耦合超聲波法、常壓超聲法、溶劑提取法的最佳工藝調(diào)整后進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),模型驗(yàn)證結(jié)果如圖9所示。

圖9 三種提取方法的響應(yīng)面驗(yàn)證分析Fig.9 Response surface verification of three extraction methods注:字母不同表示具有顯著性差異,P<0.05。

由圖9可知,真空耦合超聲波法最優(yōu)條件下提取龍牙楤木皂苷得率為4.18%±0.092%,常壓超聲法最優(yōu)條件下提取龍牙楤木皂苷得率為3.80%±0.155%,溶劑提取法最優(yōu)條件下提取龍牙楤木皂苷得率為3.62%±0.131%。真空耦合超聲波法提取龍牙楤木皂苷得率依次是常壓超聲、溶劑提取的1.10倍、1.15倍,且差異性顯著,而最高得率的提取時(shí)間真空耦合超聲波依次是常壓超聲、溶劑提取的0.63倍、0.42倍,表明真空耦合超聲波法能縮短提取時(shí)間,且能提高提取得率。

2.5 龍牙楤木皂苷抗氧化性分析

DPPH自由基性質(zhì)穩(wěn)定,通常當(dāng)做自由基清除能力的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。超氧陰離子自由基本身有毒性,且可生成羥基自由基,使機(jī)體處于過(guò)氧損傷狀態(tài)[24]?；钚晕镔|(zhì)的抗氧化能力與還原力具有一定的相關(guān)性,因此本試驗(yàn)選定清除DPPH自由基、超氧陰離子自由基能力和總還原能力評(píng)價(jià)龍牙楤木皂苷的抗氧化能力,結(jié)果如圖10所示。

圖10 龍牙楤木皂苷抗氧化能力Fig.10 The antioxidant capacity ofsaponins from aralia elata

由圖10可知,隨著皂苷質(zhì)量濃度的升高,三種提取方法提取的龍牙楤木皂苷的抗氧化能力均加強(qiáng),呈現(xiàn)明顯的劑量依賴關(guān)系。在質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL時(shí),真空耦合超聲波、常壓超聲、溶劑提取制備的龍牙楤木皂苷對(duì)DPPH自由基的清除率依次為92.33%、81.03%、78.56%,是初始濃度的3.48倍、2.94倍、3.51倍。最高濃度時(shí),真空耦合超聲波提取的皂苷DPPH自由基清除能力與同濃度的VC接近。龍牙楤木皂苷能清除DPPH自由基可能是因?yàn)樵碥蔗尫艢潆x子,配對(duì)孤對(duì)電子,使DPPH自由基生成穩(wěn)定的化合物[25]。

在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi),隨著皂苷質(zhì)量濃度的升高,龍牙楤木皂苷對(duì)超氧陰離子自由基的清除率增大。質(zhì)量濃度為6 mg/mL時(shí),真空耦合超聲波、常壓超聲、溶劑提取制備的龍牙楤木皂苷對(duì)超氧陰離子自由基的清除率達(dá)到最大值,依次為95.64%、88.28%、80.35%,提高了3.19倍、3.42倍、5.20倍,抗氧化能力均低于VC。鄰苯三酚堿性條件下自氧化生成有色中間產(chǎn)物,并釋放超氧陰離子自由基。龍牙楤木皂苷清除超氧陰離子自由基可能是因?yàn)槠浠钚詺渑c超氧陰離子自由基結(jié)合生成水,中斷中間有色產(chǎn)物的積累。

表6 龍牙楤木皂苷抑菌直徑Table 6 Inhibition zone diameters of aralia elata saponin against different microorganisms

注:-代表無(wú)抑菌圈

表7 龍牙楤木皂苷最低抑菌濃度Table 7 Minimum inhibitory concentrations of aralia elata saponin against different microorganisms

表8 龍牙楤木皂苷最低殺菌濃度Table 8 Minimum bactericidal concentration of aralia elata saponin against different microorganisms

注:-:沒(méi)有菌生長(zhǎng);+:有少量菌生長(zhǎng);++:有一定量菌生長(zhǎng);+++:有大量菌生長(zhǎng)。

三種提取方法提取龍牙楤木皂苷總還原能力的強(qiáng)弱依次為真空耦合超聲波法、常壓超聲法、溶劑提取法,但三種提取方法提取的龍牙楤總還原能力均低于VC。在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi),真空耦合超聲波提取龍牙楤木皂苷總還原能力由0.105上升至0.893、常壓超聲由0.097上升至0.614、溶劑提取由0.10上升至0.594。龍牙楤木皂苷打破自由基鏈,導(dǎo)致Fe3+得到電子還原成為Fe2+。真空耦合超聲波、常壓超聲、溶劑提取龍牙楤木皂苷清除DPPH自由基、超氧陰離子自由基的IC50依次為0.344、0.528、0.560、1.367、1.857、2.389 mg/mL,總還原能力強(qiáng)弱依次為真空耦合超聲波、常壓超聲、溶劑提取,方差分析兩兩比較差異顯著,表明真空耦合超聲波提取龍牙楤木皂苷不會(huì)破壞皂苷類(lèi)化合物的抗氧化活性且抗氧化活性更強(qiáng),可能因?yàn)檎婵振詈铣暡ǚㄏ啾扔诔撼暫腿軇┨崛》ń档土藷崦粜曰钚晕镔|(zhì)隨溫度升高造成的氧化和降解,且體系沸點(diǎn)降低,分子運(yùn)動(dòng)活躍,促使更多活性成分溶出。

2.6 龍牙楤木皂苷抑菌活性分析

本試驗(yàn)為研究龍牙楤木皂苷抑菌活性,選用大腸桿菌、金黃色葡萄球菌Staphylococcus、枯草芽孢桿菌3種供試菌種,采用濾紙片擴(kuò)散法,通過(guò)測(cè)定抑菌圈直徑的大小來(lái)判斷抑菌活性的強(qiáng)弱,結(jié)果如表6,最低抑菌濃度和最小殺菌濃度結(jié)果如表7、表8所示。

由表6可知,從三種方法制備的龍牙楤木皂苷抑菌效果來(lái)看,真空耦合超聲波法提取的皂苷對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌抑制效果最好,當(dāng)皂苷濃度為 10 mg/mL時(shí),對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑為10.36±0.35 mm,達(dá)到陽(yáng)性對(duì)照組的29.43%,對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑為9.57±0.42 mm,達(dá)到陽(yáng)性對(duì)照組的23.65%。與陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照抑菌試驗(yàn)相比,真空耦合超聲波、常壓超聲和溶劑提取三種方法提取的龍牙楤木皂苷對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有抑菌效果,而對(duì)枯草芽孢桿菌沒(méi)有抑制作用。三種方法制備的龍牙楤木皂苷隨著濃度的增加,對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制效果增強(qiáng),這種量效關(guān)系可能是因?yàn)殡S著提取物濃度的增大導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞膜外滲透壓增大,細(xì)胞質(zhì)外滲,同時(shí)導(dǎo)致細(xì)胞膜塌陷降解,失去正常的對(duì)周?chē)镔|(zhì)的選擇性吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝途徑,這種破壞性對(duì)整個(gè)菌體表面形態(tài)具有普遍性,其范圍大小與劑量相關(guān)[26]。從結(jié)果可以看出,真空耦合超聲波法由于在真空條件下溶劑沸點(diǎn)降低,溶劑分子之間分子量能量降低,對(duì)皂苷結(jié)構(gòu)破壞減弱,同時(shí)真空條件可能減弱超聲波場(chǎng)強(qiáng)對(duì)皂苷結(jié)構(gòu)的破壞,因此有利于皂苷抑菌功能不被破壞。

由表7和表8可知,真空耦合超聲波、常壓超聲、溶劑提取制備的龍牙楤木皂苷在試驗(yàn)濃度范圍對(duì)3種菌株的MIC和MBC值之間差異較大,對(duì)大腸桿菌的MIC和MBC依次為2.5和5 mg/mL、5和10 mg/mL、10和10 mg/mL,其中真空耦合超聲波制備的皂苷對(duì)大腸桿菌MIC、MBC值最小,表明其抑菌效果最佳。三種提取方式制備的皂苷對(duì)枯草芽孢桿菌的MIC和MBC均為20和40 mg/mL,試驗(yàn)結(jié)果與表3抑菌效果一致。三種提取方法制備的龍牙楤木皂苷對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有抑菌效果,抑菌效果強(qiáng)弱為大腸桿菌>金黃色葡萄球菌>枯草芽孢桿菌,這可能是因?yàn)楦锾m氏陰性菌,其細(xì)胞壁薄,肽聚糖含量低層次少,轉(zhuǎn)運(yùn)通道多,龍牙楤木皂苷極易進(jìn)入從而產(chǎn)生抑制作用,革蘭氏陽(yáng)性菌,細(xì)胞壁較厚,肽聚糖含量高且相互交聯(lián)形成堅(jiān)固穩(wěn)定的的立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),以及芽孢強(qiáng)抗逆性使得龍牙楤木皂苷對(duì)枯草芽孢桿菌的作用較弱[27]。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)確定了真空耦合超聲波提取龍牙楤木皂苷的最佳工藝條件為乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)80%、超聲溫度57.7 ℃、液料比1∶25.1 g/mL、超聲時(shí)間50 min、超聲功率273.9 W、真空度0.0784 MPa,此條件下龍牙楤木皂苷的提取得率理論值為4.21%,實(shí)際值為4.18%,與預(yù)測(cè)值相差0.47%。功能試驗(yàn)表明,采用真空耦合超聲波法制備的龍牙楤木皂苷的體外抗氧化功能和抑菌功能都強(qiáng)于常壓超聲法和溶劑提取法制備的龍牙楤木皂苷?？梢缘贸?真空耦合超聲波法能夠顯著提高龍牙楤木皂苷得率(P<0.05),并很好地保留了皂苷的抗氧化活性和抑菌活性。因此本試驗(yàn)對(duì)龍牙楤木皂苷高效制備及在食品、藥品等領(lǐng)域開(kāi)發(fā)天然抗氧化劑提供一定的理論依據(jù)。