,4,4,*

(1.九江學(xué)院藥學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,江西九江 332000;2.江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)系,江西南昌 330004;3.九江安德和生物科技有限公司,江西九江 332000;4.六盤水師范學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,六盤水特色果樹資源研究與利用重點實驗室,貴州六盤水 553004)

訶子(TerminaliachebulaRetz,TCR)為使君子科欖仁樹屬植物訶子及其變種絨毛訶子的成熟干燥果實,具有降血糖、抗誘變、防治肝臟疾病、抗癌及抗氧化等多種功效[1],在藏藥中有“藥中之王”的美譽[2]。

低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)是平均直徑22 nm、密度1.019～1.063 g/mL左右的顆粒,由約80%脂類及單一蛋白apoB100(約占20%)組成[3-4]。LDL為人類血液循環(huán)中膽固醇的主要運輸載體,是膽固醇轉(zhuǎn)移和新陳代謝的關(guān)鍵物質(zhì)[3]。LDL所含脂類及蛋白均容易被過渡金屬離子、自由基等物質(zhì)所氧化[3,5]。LDL氧化是動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)形成的關(guān)鍵因素[6],而AS是引起心血管疾病和腦梗塞的最主要原因[7]。在特定生理條件下,LDL所含的脂類及蛋白組分均易被氧化而導(dǎo)致其生化及熒光特性發(fā)生改變,可通過監(jiān)測這些特性的變化反映被氧化修飾程度[5,8-9]。

熒光光譜具有高靈敏度、選擇性和多功能性等優(yōu)勢,被廣泛運用于各種蛋白熒光特性的表征[8]。三維熒光掃描則可直觀顯示樣品在一定發(fā)射和激發(fā)波長范圍內(nèi)的熒光變化情況,該變化可通過三維熒光等高線光譜圖顯示出來[8]。

LDL所含脂類氧化產(chǎn)生的醛類(如MDA)[10]會導(dǎo)致Lys上的游離氨基活性降低[8],在340 nm處測定OD值的變化可反映Lys游離氨基活性衰減程度[5]。除了脂類易發(fā)生氧化以外,LDL所含蛋白apoB100也容易發(fā)生氧化反應(yīng),導(dǎo)致其熒光發(fā)生相應(yīng)變化(如色氨酸(Trp)熒光猝滅[8]、總熒光產(chǎn)物及脂褐素含量增加等)[8,11]。Israni等[12]發(fā)現(xiàn)訶子水提物能有效降低高血脂大鼠體內(nèi)低密度脂蛋白含量。

本實驗室前期研究表明,訶子在國家公布的114種可用于保健食品原料中抗氧化活性高居第一[13];劉仁綠等[14]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),訶子粗提物(the crude extracts of Terminalia chebula Retz,CET)對LDL所含脂類成分在氧化過程中TBARS的產(chǎn)生具有顯著的抑制作用,且不同極性部位抑制作用差異明顯,乙酸乙酯相為其有效部位。但是,訶子對LDL所含蛋白成分(apoB100)氧化的抑制能力及其抑制LDL蛋白組分氧化過程熒光特性改變的功效目前均不清楚。

因此,在實驗室前期研究訶子抗氧化、抑制LDL脂類成分氧化的工作基礎(chǔ)上,本文采用熒光光譜學(xué)技術(shù)進(jìn)一步檢測TCR抑制LDL所含蛋白氧化的抑制效果,以期為后續(xù)相關(guān)功能食品研發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

訶子 產(chǎn)地廣西,購自湖南長沙君昊中藥飲片科貿(mào)有限公司,買回后立即粉碎干燥、過50目篩后置入冰箱中備用;LDL從健康人體血漿中分離得到;肝素鈉(185 U/mg) 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-Trinitrobenzenesulfonic acid solution,TNBS) 成都格雷西亞化學(xué)技術(shù)有限公司;其它試劑 均為國產(chǎn)分析純或優(yōu)級純。

LS-55熒光/磷光/發(fā)光分光光度計 美國Perkin Elmer公司;PB-10型pH計 Sartorius儀器設(shè)備有限公司;DFY-C型高速粉碎機 溫嶺林大機械有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 訶子粗提物及乙酸乙酯相制備 根據(jù)江慎華等[1]采用的生物活性追蹤法制備得到訶子粗提物及乙酸乙酯相(the ethyl acetate fraction of Terminalia chebula Retz,EAFT)。稱取160 g訶子干粉,采用50%乙醇、料液比1∶20 (g∶mL)、60 ℃提取4次,每次提取7 min,最后將提取液合并。取1/10作為粗提液,濃縮、凍干后得到CET。剩余9/10提取液濃縮后加入一定體積的蒸餾水制成懸濁液,分別采用極性逐漸增大的正己烷、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取,最后剩余水相部位。其中,乙酸乙酯萃取液濃縮、凍干后得到EAFT,采用甲醇配制成不同濃度樣液備用。

1.2.2 LDL制備 采用劉仁綠[14]、Wieland等[15]和Yang等[5]方法。取血漿300 mL,加入沉淀液3000 mL(肝素鈉濃度50000 U/L,0.064 mol/L檸檬酸三鈉,5 mol/L鹽酸調(diào)pH至5.04),混合均勻,磁力攪拌30 s,37 ℃水浴15 min后于4 ℃、3000 r/min離心10 min,棄上清液獲得沉淀物,向沉淀中加入1500 mL洗滌液(0.064 mol/L檸檬酸鈉,pH=5.11)溶解洗滌后于4 ℃、3000 r/min離心10 min,所得沉淀用160 g/L NaCl、8.1 mol/L Na2HPO4·12H2O、1.5 mol/L KH2PO4、2.7 mol/L KCl、pH7.4的高鹽磷酸鹽緩沖液將上述沉淀溶解,冰箱中避光透析24 h,每6 h換一次透析液。以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品,采用Lowry法測定蛋白濃度來表示LDL濃度,所需各種LDL濃度用高鹽PBS稀釋、4 ℃避光保存并3 d內(nèi)用完。

1.2.3 訶子對LDL中apoB100氧化修飾的抑制效果 空白指未添加氧化劑CuSO4,分別以相同體積去離子水和甲醇代替CuSO4和訶子樣液;促氧指添加氧化劑CuSO4,以相同體積甲醇代替訶子樣液;陽性對照指以2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(2,6-Di-Tert-Butyl-4-Methylphenol,BHT)來代替訶子樣液,以上樣品其它操作均相同。以下各濃度均為混合體系中的終濃度。

1.2.3.1 對apoB100中Lys游離氨基活性降低的抑制效果 定量測定抑制效果:運用TNBS活性法[16],略作修改。取濃度750 μg/mL的LDL 9.8 mL,加 0.1 mL CuSO4或者去離子水,再加0.1 mL不同濃度樣液(樣液濃度分別為1.25、2.5、5 μg/mL)或甲醇,37 ℃恒溫孵育氧化24 h后,取1 mL體系混合液與1 mL 4% NaCHCO3混勻,加50 μL 0.1% TNBS溶液,37 ℃孵育1 h后在340 nm處測定吸光度值。

采用此方法對CET及EAFT的抑制效果進(jìn)行測定。

定性測定抑制效果:按照Picard等[17]和Yang等[5]方法,分別固定激發(fā)波長Ex 350 nm、掃描發(fā)射波長范圍Em 400～550 nm和固定激發(fā)波長Ex 390 nm、掃描發(fā)射波長范圍Em 400～550 nm來掃描LDL在氧化過程中產(chǎn)生的活性醛及MDA修飾Lys殘基熒光變化情況。

1.2.3.2 對LDL中apoB100中色氨酸(Trp)熒光猝滅的抑制效果 定量測定抑制效果:采用Chen 等[18]方法,略作修改。取4.9 mL 500 μg/mL LDL溶液,加50 μL 1.25 μmol/L CuSO4或去離子水,再加50 μL不同濃度樣液(樣液濃度分別為5、10、15 μg/mL)或甲醇,37 ℃恒溫水浴孵育氧化18 h后在Ex295/Em330 nm測定熒光強度。

定性測定抑制效果:采用Yang等[5]方法,略作修改。按照上述1.2.3.1的方法孵育,固定激發(fā)波長(Ex)280 nm,掃描發(fā)射波長(Em)(300～450) nm來掃描LDL氧化過程中Trp熒光猝滅的效果。

1.2.3.3 對apoB100在氧化過程中總熒光產(chǎn)生的抑制效果 采用Yang等[5]方法,按照1.2.3.1方法孵育反應(yīng)體系,在Ex360/Em 430 nm處測定熒光強度以評價抑制效果。

1.2.3.4 對apoB100在氧化過程中脂褐素產(chǎn)生的抑制效果 采用Yang等[5]、謝志勇等[19]方法,按照1.2.3.1方法孵育反應(yīng)體系,在Ex350/Em 460 nm處測定LDL氧化產(chǎn)生脂褐素的熒光強度。

1.2.3.5 對apoB100在氧化過程中三維熒光產(chǎn)生的抑制效果 運用曾鈞杰等[8]和Mclean等[20]方法,按照1.2.3.1(1)方法孵育反應(yīng)體系,設(shè)定Ex(200～420 nm)、Em(260～500 nm)狹縫寬度均為15 nm及光譜間隔10 nm進(jìn)行三維熒光掃描,獲得三維熒光等高線圖來評價EAFT對apoB100氧化過程中熒光變化的抑制效果。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有相關(guān)試驗及測定均進(jìn)行3次重復(fù),采用DPS數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 CET對apoB100中Lys游離氨基活性降低的抑制效果

為了驗證訶子對LDL氧化過程中apoB100熒光改變的抑制效果,本文首先對CET的抑制作用進(jìn)行了測定與分析。Lys游離氨基與TNBS反應(yīng)形成的復(fù)合物在340 nm處有吸收,通過測定Lys氨基活性程度可反映出LDL氧化修飾程度,吸光度值越高表示氧化程度越低[16]。本文首先采用1.2.3.1方法測得CET對apoB100氧化修飾的抑制效果如圖1所示。從圖1可看出,當(dāng)CET濃度為1.25和2.5 μg/mL時,OD340值分別為0.228和0.319,分別比促氧組(OD340值為0.216)高出5.56%、47.69%,與同濃度的BHT組相比略低,但均顯著大于促氧組(P<0.05)。而當(dāng)CET濃度為5 μg/mL時,OD340值甚至顯著大于空白組(OD340值為0.393)(P<0.05),表明CET能顯著抑制LDL所含蛋白組分氧化,這可能是由于粗提物中所含的有效成分能夠保護(hù)Lys殘基不受氧化修飾。實驗室前期研究也發(fā)現(xiàn)丁香粗提物中有效成分也能保護(hù)Lys殘基不被氧化修飾[8]。

圖1 CET對賴氨酸游離氨基酸活性降低的抑制作用Fig.1 Inhibition effect of CETon reactivity decrease of free amino in Lysine注:圖中不同小寫字母表示各樣品抑制效果具有顯著性差異(P<0.05);圖2、圖5同。

上述測定結(jié)果表明,CET對apoB100氧化過程具有很強的抑制效果。實驗室前期研究發(fā)現(xiàn),EAFT在訶子不同極性部位(正己烷相、乙酸乙酯相、正丁醇相、水相)中抗氧化能力最強,為其抗氧化有效部位[13];同時又發(fā)現(xiàn)EAFT對LDL所含脂類氧化具有顯著的抑制效果[14]。因此,本文在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步采用熒光技術(shù)對EAFT抑制LDL所含蛋白apoB100的氧化效果進(jìn)行了分析與測定。

2.2 EAFT對LDL所含蛋白(apoB100)氧化修飾的抑制作用

2.2.1 EAFT對apoB100中Lys游離氨基活性降低的抑制效果

2.1.2.1 抑制效果定量測定 LDL中脂質(zhì)組分發(fā)生氧化時產(chǎn)生大量包括活性醛(如MDA)在內(nèi)的過氧化物,這些活性醛都會與LDL上所含Lys殘基結(jié)合導(dǎo)致活性降低并最終形成[5]動脈粥樣硬化[4]。通過測定Lys氨基活性程度可反映出LDL氧化修飾程度[16]。

按照1.2.3.1方法測定EAFT對LDL氧化過程中Lys游離氨基活性的測定結(jié)果如圖2所示。從圖2可看出,EAFT在1.25～5.0 μg/mL濃度范圍內(nèi),對LDL氧化過程中的Lys游離氨基減少具有很強的抑制效果。隨著濃度升高、抑制效果更強。盡管其抑制效果均弱于陽性對照BHT,但當(dāng)濃度達(dá)2.5 μg/mL以上,其Lys游離氨基的活性顯著高于空白組(P<0.05),這充分表明EAFT能有效抑制LDL氧化過程中Lys氧化修飾。

圖2 EAFT對Lys游離氨基酸活性降低的抑制作用Fig.2 Inhibition effect of EAFTon in reactivity decrease of free amino in Lysine

2.1.2.2 抑制效果定性測定 LDL脂質(zhì)組分氧化產(chǎn)生的活性醛及MDA與LDL上所含Lys殘基結(jié)合形成的希夫堿分別在Ex 350 nm/Em 420 nm、Ex 390 nm/Em 460 nm有很強的熒光吸收,熒光強度越強表示氧化程度越高。由此采用熒光掃描光譜可衡量樣液對LDL脂質(zhì)氧化產(chǎn)物活性醛對apoB100中Lys殘基的氧化修飾程度[17],測得結(jié)果如圖3～圖4所示。

從圖3、圖4可知,促氧組熒光強度最高,空白組熒光強度最低,表示LDL中脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生的活性醛與Lys殘基結(jié)合,增強了熒光吸收。當(dāng)添加不同濃度樣液后,熒光強度隨EAFT濃度升高而降低,說明EAFT能很好地抑制LDL氧化過程中產(chǎn)生的活性醛修飾Lys殘基。Picard等[17]也發(fā)現(xiàn)氨基胍能抑制活性醛和MDA修飾apoB100所含的Lys殘基。

圖3 EAFT對活性醛修飾Lys殘基熒光改變的抑制Fig.3 Inhibition effect of EAFT on fluorescence spectrachange of Lys residue modified by reactive aldehydesa:促氧;b:1.25 μg/mL EAFT;c:2.5 μg/mL EAFT;d:5 μg/mL EAFT;e:BHT;f:空白。

圖4 EAFT對MDA修飾Lys殘基熒光改變的抑制Fig.4 Inhibition effect of EAFT on fluorescencespectra change of Lys residue modified by MDA注:a:促氧;b:1.25 μg/mL EAFT;c:2.5 μg/mL EAFT;d:5 μg/mL EAFT;e:BHT;f:空白。

2.2.2 EAFT對LDL所含apoB100中Trp氧化修飾的抑制作用 apoB100內(nèi)所含的Trp在Cu2+介導(dǎo)作用下,在氧化延遲階段易被氧化修飾、導(dǎo)致Trp殘基減少[5]。而Trp是LDL主要的內(nèi)在熒光團(tuán),當(dāng)LDL被氧化后其熒光會發(fā)生猝滅,通過測定Trp熒光猝滅程度可反映LDL被氧化修飾程度,熒光強度越強表示氧化程度越低[21]。

2.2.2.1 定量測定對Trp熒光猝滅的抑制效果 采用1.2.3.1方法孵育反應(yīng)體系測定結(jié)果如圖5所示。從該圖可看出,當(dāng)EAFT濃度為5、10、15 μg/mL時,熒光強度分別為180.67、187.79、197.65,熒光強度與EAFT濃度呈正相關(guān),而促氧組熒光強度僅為133.15,顯著小于添加EAFT的樣品組(P<0.05),表明EAFT能很好抑制Trp殘基熒光猝滅、可有效防止LDL氧化。曾鈞杰等[8]發(fā)現(xiàn)丁香中含有多酚,能夠清除自由基、螯合過度金屬離子,從而抑制Trp熒光猝滅。孟和阿木古浪等[22]也發(fā)現(xiàn)訶子中含有大量多酚類物質(zhì)。因此,訶子可能也是通過其高含量的多酚類化合物實現(xiàn)對Trp熒光猝滅的抑制功效。

圖5 定量測定EAFT對Trp熒光淬滅的抑制效果Fig.5 Inhibition effect of EAFTon Trp fluorescence quenching by quantitative determination

2.2.2.2 定性測定對Trp熒光猝滅的抑制效果 為了更直觀地驗證EAFT的抑制效果,本實驗在2.1.1(1)基礎(chǔ)上在Ex280 nm處激發(fā)、發(fā)射波長范圍300～450 nm條件下進(jìn)行熒光掃描,其結(jié)果如圖6所示。從該圖可看出,所有樣品均在340 nm處有最大熒光吸收。與促氧組相比,空白組、BHT組和EAFT各濃度在340 nm處熒光吸收強度均更高、且與濃度成正比關(guān)系,與上圖5中所測結(jié)果相一致。萬嚴(yán)等[21]也發(fā)現(xiàn)丁香乙酸乙酯相也能有效抑制LDL氧化過程中Trp降解。

圖6 定性測定EAFT對Trp熒光淬滅的抑制效果Fig.6 Inhibition effect of EAFTon Trp fluorescence quenching by qualitative determination注:a:促氧,b:15 μg/mLBHT,c:10 μg/mL BHT,d:5 μg/mL BHT,e:15 μg/mL EAFT,f:10 μg/mL EAFT,g:5 μg/ml EAFT,h:空白。

2.2.3 EAFT對LDL中apoB100在氧化過程中總熒光產(chǎn)生的抑制效果 據(jù)報道,天然LDL(native LDL,n-LDL)在Ex 360/Em430 nm處有微弱熒光吸收[5]。當(dāng)LDL被氧化修飾后會形成在Ex360/Em 430 nm處有強熒光吸收的總熒光物質(zhì)[8],熒光強度越強表示氧化程度越高[23]。在上述測定基礎(chǔ)上,進(jìn)一步對EAFT抑制總熒光產(chǎn)物產(chǎn)生的效果進(jìn)行了檢測。

按照上述1.2.3.3方法測定各樣品總熒光產(chǎn)物的結(jié)果如圖7所示。從該圖可知,促氧熒光強度最高。添加不同濃度(5～15 μg/mL)EAFT樣液后,盡管高于相同濃度的BHT,但與促氧樣品的熒光強度(189.39)相比,其總熒光強度分別降低了48.88%、49.85%及59.15%,均極顯著低于促氧(P<0.01),表明EAFT能有效抑制LDL氧化過程中總熒光產(chǎn)物的生成。Yang等[5]也發(fā)現(xiàn)丁香中乙酸乙酯相也能很好地抑制LDL氧化過程中總熒光產(chǎn)物的生成。Mclean等[20]也發(fā)現(xiàn)普羅布考(一種合成藥)能減緩ox-LDL熒光產(chǎn)物的增加速率。

表1 EAFT對LDL三維熒光光譜改變的抑制效果Table 1 Inhibition effect of EAFT on the change of three-dimensional fluorescence contour spectroscopy during LDL oxidation

圖7 EAFT對總熒光產(chǎn)物產(chǎn)生的抑制效果Fig.7 Inhibition effect of EAFTon production oftotal fluorescence注:圖中不同小寫字母表示各樣品抑制效果具有顯著性差異(P<0.05);圖8同。

2.2.4 EAFT對LDL中apoB100在氧化過程中脂褐素產(chǎn)生的抑制效果 脂褐素是人體內(nèi)衰老的指標(biāo),通過測量脂褐素的含量可反映出細(xì)胞被自由基損傷的程度[8]。在LDL氧化期間也生成脂褐素。因此,在測定對總熒光產(chǎn)物抑制的基礎(chǔ)上,本試驗進(jìn)一步對EAFT抑制脂褐素的產(chǎn)生效果進(jìn)行了測定。

按照上述1.2.3.3方法測得結(jié)果如圖8所示。從圖中可知,促氧組熒光強度(137.55)最高、脂褐素產(chǎn)生量最多,比空白組熒光強度(46.915)高出了193.1%。添加不同濃度EAFT樣液(5、10、15 μg/mL)后,熒光強度及脂褐素含量雖均高于BHT組但均顯著低于促氧組(P<0.01),且樣液濃度越高、脂褐素產(chǎn)生量越低,表明EAFT對LDL氧化過程中脂褐素的生成具有顯著抑制作用(P<0.01),進(jìn)一步驗證明了其對LDL氧化的抑制效果。王麗麗等[10]也發(fā)現(xiàn)丁香葉提取物也能抑制脂褐素生成。

圖8 EAFT對脂褐素產(chǎn)生的抑制效果Fig.8 Inhibition effect of EAFT on production oflipofuscins

2.2.5 EAFT對LDL中apoB100氧化過程中三維熒光光譜改變的抑制效果 在上述采用傳統(tǒng)熒光技術(shù)發(fā)現(xiàn)EAFT對LDL所含蛋白氧化均有較好抑制效果的基礎(chǔ)上,本文進(jìn)一步采用三維熒光等高線譜直觀表征其抑制效果,結(jié)果如圖9及表1所示。其中,Peak A(Ex340/Em280 nm)處熒光強度表示天然LDL原始熒光信號,為Trp內(nèi)源吸收峰[10],其信號越強代表氧化程度越低。而Peak B(Ex440/Em360 nm)處熒光強度表示LDL經(jīng)氧化生成的新熒光產(chǎn)物,其信號越強代表氧化程度越高[8,24]。

從圖9(a)及表1可知,空白組Peak A處熒光強度最高(990),LDL原始熒光信號完整,表示LDL未被氧化修飾[19]。當(dāng)n-LDL被氧化成ox-LDL后(圖9(b)),Peak A處熒光信號由n-LDL的990降低到ox-LDL的256.97,Peak B處新生成的熒光產(chǎn)物從n-LDL的73.55增加到ox-LDL的256.97。從圖9(d)～圖9(f)可知,當(dāng)添加不同濃度的EAFT(5、10及15 μg/mL)樣液后,與ox-LDL相比,Peak A處的熒光強度減弱程度得到有效抑制,其強度從ox-LDL的256.97分別增加到426.83、513.95、及538.6(圖9、表1);而Peak B處熒光產(chǎn)物的生成也受到顯著抑制,其強度從ox-LDL的256.97分別降低到130.01、138.64及128.23,進(jìn)一步直觀地表明了EAFT能有效抑制LDL氧化修飾。曾鈞杰等[8]、張小霞等[24]也發(fā)現(xiàn)丁香乙酸乙酯相能有效抑制LDL氧化修飾,與本試驗結(jié)果類似。

3 結(jié)論

本文首先發(fā)現(xiàn)訶子粗提物CET能有效抑制LDL所含蛋白apoB100中Lys游離氨基活性降低,體現(xiàn)出CET對LDL所含蛋白氧化的抑制效果。在此基礎(chǔ)上,本實驗進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)訶子抗氧化有效部位EAFT能有效抑制LDL所含蛋白apoB 100Trp熒光淬滅、總熒光產(chǎn)物及脂褐素的產(chǎn)生,也能抑制LDL氧化過程中三維熒光光譜的改變,抑制效果均呈現(xiàn)出較好的量效關(guān)系。本文結(jié)果為后續(xù)對EAFT組成成分分析及所含各種有效成分分離純化提供參考。