梁 超 王麗麗 劉欣辰 陳曉博 粟綴孜 劉 霞 李祥偉

吉林大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院 吉林省牙發(fā)育及頜骨重塑與再生重點實驗室，吉林省長春市 130021

根管治療術(shù)是治療牙髓病和根尖周病的首選方法，根管充填是整個治療過程的終末環(huán)節(jié)和關(guān)鍵步驟，是利用根管充填材料嚴(yán)密封閉根管系統(tǒng)，隔絕根管和口腔或根尖周組織的交通，可以促進(jìn)根尖周邊的愈合，防止再感染[1]。根管封閉劑是根管充填材料的組成部分，我們前期制備的CaO/ZnO殼—核結(jié)構(gòu)納米球材料具有良好的根管封閉性和抑菌性能[2]，本研究是檢測CaO/ZnO殼—核結(jié)構(gòu)納米球材料的細(xì)胞相容性，為其作為一種新型根管封閉劑的臨床試驗奠定體外細(xì)胞學(xué)的實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器 本課題組前期制備的CaO/ZnO核—殼結(jié)構(gòu)納米球[2]，倒置相差顯微鏡 (OLYMPUS IX71,Olympus,日本)，TGA-16G-A 低溫高速離心機(jī)(上海安亭離心機(jī)械廠)，CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱 (MCO20IL,SANYO,日本)，必蘭根充糊劑(法國必蘭公司)；AH-plus根管封閉劑(DENTSPLY)，DMEM 高糖培養(yǎng)基(H-DMEM) (Gibco)，胎牛血清(Gibco)，青霉素鏈霉素溶液(Gibco)；MTT(Amresco)；二甲基亞砜(DMSO，Sigma)； L929小鼠成纖維細(xì)胞系。

1.2 實驗方法和步驟

1.2.1 CaO/ZnO核—殼結(jié)構(gòu)納米球丁香油酚糊劑浸提液制備：取適量CaO/ZnO核—殼結(jié)構(gòu)納米球粉末與丁香油酚調(diào)拌呈糊狀，壓扁切成塊狀，在37℃、100%濕度的恒溫箱中固化48h后，研磨成粉末后稱取樣品1 000mg，加入5ml無血清H-DMEM培養(yǎng)基，使得材料浸提液的濃度為200g/L，密封后37℃震蕩3d，用孔徑為0.22μm的濾菌器濾菌，作為儲存液，記為CaO/ZnO納米組。必蘭根充糊劑、氧化鋅丁香油酚糊劑和AH-plus根充糊劑按照相同的方法制取浸提液，分別記為必蘭組、ZOE組和AH-plus組，采用含血清的H-DMEM稀釋成不同濃度2.5g/L、5g/L、10g/L和20g/L用于后面的實驗。

1.2.2 L929細(xì)胞培養(yǎng)：從液氮內(nèi)取出L929細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇，在含10%胎牛血清、100IU/L鏈青霉素和100mg/L鏈霉素的H-DMEM培養(yǎng)基內(nèi)，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3d換液1次，細(xì)胞至90%匯合時消化傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行下列實驗。

1.2.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察：將密度為1.0×105cell/ml的L929細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板，每孔1ml，在接種后第2天加入含CaO/ZnO核—殼結(jié)構(gòu)納米球丁香油酚糊劑浸提液2.5g/L、5g/L和10g/L的H-DMEM，每個濃度3孔，培養(yǎng)1d后在倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.4 MTT法進(jìn)行細(xì)胞毒性分析：取對數(shù)生長期L929細(xì)胞以1×104/孔接種于96孔板，培養(yǎng)24h后加入含不同濃度浸提液的細(xì)胞培養(yǎng)液，每組設(shè)3個平行復(fù)孔，以不含材料浸提液的孔為陰性對照組。在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)1d、3d、7d時，每孔加入20μl MTT(5mg/L)溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h，去上清后加入DMSO 150μl/孔，搖床輕微振蕩10min，選擇570nm波長條件下酶標(biāo)儀檢測，測定吸光度值A(chǔ)。計算細(xì)胞相對增殖率(Relative growth rate,RGR)，RGR=實驗組光密度值/陰性對照組光密度值×100%。根據(jù)細(xì)胞相對增殖率評價細(xì)胞毒性等級[3]，按RGR范圍分為5級:RGR≥100%為0級，75%≤RGR≤99%為1級，50%≤RGR≤74% 為2級，25%≤RGR≤49%為3級，1%≤RGR≤24%為4級，RGR=0為5級。0級和1級被認(rèn)為沒有細(xì)胞毒性，2級為輕度細(xì)胞毒性，3級和4級為中度細(xì)胞毒性，5級為明顯的細(xì)胞毒性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01為差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)觀察檢測細(xì)胞毒性 L929細(xì)胞在濃度為2.5g/L、5g/L和10g/L的CaO/ZnO核—殼結(jié)構(gòu)納米球丁香油酚糊劑浸提液內(nèi)培養(yǎng)1d時的細(xì)胞形態(tài)如圖1所示。倒置顯微鏡下觀察，空白對照組細(xì)胞多呈短梭形，細(xì)胞貼壁生長，連接緊密，折光性良好(如圖1①～③)，與空白對照組相比，2.5g/L 組(圖1④～⑥)及5g/L組(圖1⑦～⑨)細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞數(shù)量無明顯變化，細(xì)胞形態(tài)良好，未見細(xì)胞毒性反應(yīng)。10g/L組多數(shù)細(xì)胞形態(tài)正常、規(guī)則，僅可見細(xì)胞數(shù)量減少，有少量細(xì)胞圓縮、死亡，未呈現(xiàn)明顯細(xì)胞毒性反應(yīng)(圖1⑩～)。結(jié)果說明從形態(tài)學(xué)角度觀察分析，各個濃度組CaO/ZnO核—殼結(jié)構(gòu)納米球丁香油酚糊劑浸提液在培養(yǎng)1d時對L929細(xì)胞不具備明顯毒性。

圖1L929細(xì)胞在濃度為2.5g/L、5g/L和10g/L的CaO/ZnO核—殼結(jié)構(gòu)納米球丁香油酚糊劑浸提液內(nèi)培養(yǎng)1d時的細(xì)胞形態(tài)

2.2 MTT法檢測細(xì)胞毒性 不同濃度的CaO/ZnO核—殼結(jié)構(gòu)納米球組材料浸提液與L929細(xì)胞共培養(yǎng)1d、3d、7d時細(xì)胞相對增殖率及細(xì)胞毒性分析見表1。在材料浸提液濃度較低時，如1.25g/L及2.5g/L時，CaO/ZnO納米組細(xì)胞毒性在各時間點無明顯差異，但在濃度至5g/L及以上時，細(xì)胞毒性隨著培養(yǎng)時間的延長而增大(P<0.05)。在培養(yǎng)時間較短時(如1d)，細(xì)胞毒性在各濃度組無明顯差異(P>0.05)。在培養(yǎng)至3d時，細(xì)胞毒性隨浸提液濃度升高而增大(P<0.05)。培養(yǎng)至7d時，細(xì)胞毒性隨浸提液濃度升高呈現(xiàn)急劇升高趨勢，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

對不同實驗材料組細(xì)胞相對增殖率結(jié)果的分析如圖2、3、4，在各個時間點(1d、3d、7d)和各濃度時CaO/ZnO納米組細(xì)胞的相對增殖率均高于必蘭組(P<0.05)，在培養(yǎng)3d和7d和高濃度組(>10g/L)時，CaO/ZnO納米組細(xì)胞的相對增殖率高于ZOE組，在各時間點和各濃度時CaO/ZnO納米組和AH-plus組的細(xì)胞相對增殖率無明顯差異(P>0.05)，說明CaO/ZnO核—殼結(jié)構(gòu)納米球丁香油酚糊劑和AH-plus根充糊劑的細(xì)胞相容性相似。隨著共培養(yǎng)時間的延長，各組細(xì)胞的相對增殖率均降低，在共培養(yǎng)1d時，必蘭組細(xì)胞增殖受到抑制，而且隨著濃度的增加細(xì)胞相對增殖率也有下降趨勢，ZOE組、AH-plus組和CaO/ZnO納米組對細(xì)胞增殖未見影響，在共培養(yǎng)3、7d時，四組材料細(xì)胞隨著浸提液濃度增加細(xì)胞的相對增殖率均有下降趨勢，必蘭組在各時間點差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

根管充填時使用根管封閉劑的目的主要是充填牙膠尖之間、牙膠尖與根管壁之間的空隙，充填側(cè)副根管和不規(guī)則的根管區(qū)域，在垂直加壓時作為牙膠尖的潤滑劑幫助牙膠尖就位以及增加充填材料與牙本質(zhì)之間的黏附力[1]。根管封閉劑應(yīng)該具有良好的生物相容性對周圍組織和細(xì)胞沒有毒性[4]。體外細(xì)胞培養(yǎng)是檢測材料細(xì)胞相容性比較簡單有效的實驗方法，小鼠成纖維細(xì)胞 L929細(xì)胞系具有細(xì)胞培養(yǎng)周期短和細(xì)胞存活率高等優(yōu)點，該細(xì)胞系常被廣泛應(yīng)用于材料的細(xì)胞毒性檢測和評估實驗中[5]。本研究采用L929細(xì)胞系作為實驗對象，采用必蘭糊劑、ZOE糊劑和AH-plus根管封閉劑三種臨床常用的根管封閉劑作為對照組，檢測CaO/ZnO核—殼結(jié)構(gòu)納米球—丁香油糊劑的細(xì)胞毒性以評價CaO/ZnO核—殼結(jié)構(gòu)納米球材料的細(xì)胞相容性。

表1 材料浸提液與L929細(xì)胞共培養(yǎng)1d、3d、7d細(xì)胞相對增殖率及細(xì)胞毒性

圖2各組材料浸提液在不同濃度與L929共培養(yǎng)1d時細(xì)胞相對增殖率

注：*P<0.05，**P<0.01。

圖3 各組材料浸提液在不同濃度與L929共培養(yǎng)3d時細(xì)胞相對增殖率

注：*P<0.05，**P<0.01。

本實驗從細(xì)胞形態(tài)學(xué)上分析，在材料浸提液作用1d時倒置顯微鏡下觀察不同濃度的CaO/ZnO核—殼結(jié)構(gòu)納米球浸提液對L929細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)和排列沒有明顯的影響，說明材料對細(xì)胞沒有明顯的早期不良刺激反應(yīng)和細(xì)胞毒性。

圖4 各組材料浸提液在不同濃度與L929共培養(yǎng)7d時細(xì)胞相對增殖率

注：*P<0.05，**P<0.01。

MTT比色法是檢測細(xì)胞增殖常用的實驗方法，通常用細(xì)胞相對增殖率作為評價指標(biāo)。本研究采用MTT法檢測的實驗結(jié)果表明CaO/ZnO核—殼結(jié)構(gòu)納米球材料組對細(xì)胞相對增殖率的影響與AH-plus類似，短時間接觸(共培養(yǎng)1d)對細(xì)胞增殖沒有抑制作用，各個濃度間無明顯差異(P>0.05)，隨著共培養(yǎng)時間的延長(3d)以及隨著浸提液濃度的升高 5g/L ，材料的細(xì)胞毒性有逐漸增大趨勢(P<0.05)。這與Huang等人的研究結(jié)果相似[6]，提示在臨床應(yīng)用中，需合理控制材料的濃度和用量，以避免材料的毒性反應(yīng)。

本實驗發(fā)現(xiàn)在相同的時間點相同濃度的AH-plus 和CaO/ZnO核—殼結(jié)構(gòu)納米球材料組之間的細(xì)胞相對增殖率不具備統(tǒng)計學(xué)差異，說明CaO/ZnO核—殼結(jié)構(gòu)納米球材料與AH-plus的細(xì)胞毒性相似，具有優(yōu)良的生物相容性。

綜上，通過本實驗的研究表明我們課題組前期制備的CaO/ZnO核—殼結(jié)構(gòu)納米球材料作為根管封閉劑在一定的濃度范圍沒有細(xì)胞毒性，具有良好的細(xì)胞相容性，是臨床應(yīng)用前景較好的一種新型根管封閉劑。