李清平,徐晶,蔣繼貧
(1 荊門市第二人民醫(yī)院,湖北荊門448000;2 華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院)
多發(fā)性骨髓瘤(MM)是一種克隆漿細胞異常增殖性惡性腫瘤,近年來其發(fā)病率逐年升高,已成為血液系統(tǒng)的第二大惡性腫瘤[1]。MM的發(fā)病機制尚不明確,目前仍被認為是不可治愈的疾病之一。多藥耐藥基因1(MDR1)定位于人7號染色體長臂,能夠編碼分子量為170 kD的細胞膜糖蛋白P-gp。P-gp是一種ATP依賴性跨膜轉(zhuǎn)運蛋白,具有能量依賴性“藥泵”功能,可將多種結(jié)構(gòu)不同的化合物逆向轉(zhuǎn)運出細胞。因此,MDR1及其編碼蛋白P-gp介導(dǎo)的藥物外排是腫瘤化療多藥耐藥的重要機制[2,3]。白細胞分化抗原269(CD269)為B細胞表面分子,可與B細胞活化因子和增殖誘導(dǎo)配體(APRIL)結(jié)合,主要在體液免疫中發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)功能。有研究發(fā)現(xiàn),CD269與APRIL結(jié)合可激活細胞內(nèi)NF-κB信號通路,能夠促進腫瘤細胞增殖并抑制其凋亡[4]。近年研究還發(fā)現(xiàn),CD269與APRIL結(jié)合激活細胞內(nèi)NF-κB信號通路后,其下游轉(zhuǎn)錄因子能夠促進MDR1表達[5]。因此,MDR1、CD269有可能參與MM的發(fā)生、發(fā)展,但目前國內(nèi)外報道較少。為此,本研究觀察了MM患者骨髓組織MDR1、CD269表達變化,并探討其臨床意義?,F(xiàn)報告如下。
1.1 臨床資料 選擇2014年1月~2018年6月荊門市第二人民醫(yī)院收治的MM患者106例(觀察組)。納入標準:①符合2014年國際骨髓瘤工作組修訂的MM診斷標準[6],即骨髓單克隆漿細胞比例≥10%和(或)組織活檢有漿細胞瘤,血清和(或)尿液出現(xiàn)單克隆M蛋白,伴或不伴靶器官損害;②初診,入院前未接受任何抗腫瘤治療;③一般身體狀況良好;④臨床病理資料完整。排除標準:①合并其他血液系統(tǒng)惡性腫瘤者;②合并其他器官惡性腫瘤、貧血性或免疫性疾病者;③合并心、肝、肺、腎等重要臟器嚴重功能障礙者;④妊娠期或哺乳期婦女;⑤臨床病理資料不完整者。其中,男65例、女41例,年齡38~73(56.1±6.7)歲;細胞學(xué)類型:成熟漿細胞型16例,幼漿細胞型58例,原漿細胞型19例,網(wǎng)狀細胞型13例;臨床分期:Ⅰ、Ⅱ期73例,Ⅲ期33例;根據(jù)《中國多發(fā)性骨髓瘤診治指南》[7]中的療效和臨床復(fù)發(fā)標準,規(guī)律治療后完全緩解42例、部分緩解31例、疾病穩(wěn)定33例,復(fù)發(fā)15例、未復(fù)發(fā)91例;隨訪截至2019年1月,隨訪時間1~60個月,中位隨訪時間36個月,以中位隨訪時間為界,生存時間<36個月10例、≥36個月96例。同期經(jīng)骨髓穿刺證實骨髓功能正常的非血液系統(tǒng)疾病患者40例(對照組),男21例、女19例,年齡38~68(57.0±6.8)歲。兩組性別、年齡具有可比性。本研究經(jīng)荊門市第二人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準,患者或其家屬知情同意。
1.2 骨髓組織MDR1、CD269表達檢測 采用RT-qPCR法。分別取兩組骨髓組織2~4 mL,采用TRIzol法提取骨髓組織總RNA,經(jīng)超微量分光光度計鑒定,OD260/OD280為1.8~2.1,可用于后續(xù)實驗。按照Fermentas逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板,按2×SYBR Green qPCR Msater Mix說明進行PCR擴增。所有引物序列由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計合成。引物序列:MDR1上游引物5′-CCAAAGTCAACAAGGAGTGC-3′,下游引物5′-TCTTCAACAGTGGTTTATCGCA-3′;CD269上游引物5′-ATGCAGCTGGCTTCA-3′,下游引物5′-TTCGTGAGTAAGGGG-3′;GAPDH上游引物5′-CCCCTTCATTGACCTCAACTACA-3′,下游引物5′-CGCTCCTGGAGGATGGTGAT-3′。PCR反應(yīng)體系共20 μL:2×Tag PCR Master Mix 10 μL,上下游引物各1 μL,模板cDNA 1 μL,DEPC水7 μL;反應(yīng)條件:95 ℃ 10 min,95 ℃ 30 s、60 ℃ 60 s、72 ℃ 45 s共40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。實驗重復(fù)3次,取平均值。
2.1 兩組骨髓組織MDR1、CD269表達比較 觀察組與對照組骨髓組織MDR1相對表達量分別為11.16±1.32、0.32±0.09,CD269相對表達量分別為4.17±1.13、0.84±0.08。觀察組骨髓組織MDR1、CD269相對表達量均明顯高于對照組(t分別為33.854、18.580,P均<0.01)。
2.2 骨髓組織MDR1、CD269表達與MM患者臨床病理特征的關(guān)系 見表1。
表1 MM患者骨髓組織MDR1、CD269表達與臨床病理特征的關(guān)系
2.3 MM患者骨髓組織MDR1表達與CD269表達的關(guān)系 Pearson相關(guān)分析顯示,MM患者骨髓組織MDR1相對表達量與CD269相對表達量呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.688,P<0.01)。
MM是一種克隆漿細胞異常增殖性惡性腫瘤,約占血液系統(tǒng)惡性腫瘤的10%[8]。隨著我國人口老齡化加劇,MM的發(fā)病率有明顯升高趨勢。MM起病隱匿,臨床表現(xiàn)復(fù)雜且缺乏特異性,極易漏診和誤診。目前,MM尚不能治愈,其治療緩解率較低、復(fù)發(fā)率較高且易產(chǎn)生耐藥,預(yù)后較差。
MDR1定位于人7號染色體長臂,能夠編碼分子量為170 kD的細胞膜糖蛋白P-gp。P-gp是ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白超家族成員之一,能將多種結(jié)構(gòu)不同的化合物逆向轉(zhuǎn)運出細胞。因此,MDR1及其編碼蛋白P-gp介導(dǎo)的藥物外排是腫瘤化療多藥耐藥的重要機制[2,3]。有研究發(fā)現(xiàn),在血液系統(tǒng)腫瘤及實質(zhì)器官腫瘤中MDR1異常高表達,并且其高表達與患者預(yù)后不良有關(guān)[9]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),觀察組骨髓組織MDR1相對表達量明顯高于對照組,表明MDR1可能與MM的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。這可能與MM發(fā)生時HSE、NF-R2等反式作用因子及NF-κB/p65轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物均能調(diào)控MDR1啟動子激活有關(guān)[10,11]。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn),骨髓組織MDR1相對表達量與MM臨床分期和生存時間有關(guān),而與性別、年齡、細胞學(xué)類型、是否復(fù)發(fā)無關(guān),表明MDR1表達升高可能參與MM的惡性進展并導(dǎo)致患者預(yù)后不良。MDR1表達增加可促進細胞周期調(diào)節(jié)蛋白CNND1表達,進而促進腫瘤細胞持續(xù)增殖,這可能是導(dǎo)致MM惡性進展的重要機制之一[12]。
CD269又稱B細胞成熟抗原,其基因定位于人染色體16p13,編碼蛋白屬于TNF受體超家族的成員。CD269僅表達在成熟B細胞表面,是一種重要的B細胞生物標志物,在B細胞發(fā)育和自身免疫應(yīng)答中具有重要作用。CD269能夠特異性結(jié)合腫瘤壞死因子配體超家族成員13b,并導(dǎo)致NF-κB和MAPK/JNK信號通路活化,從而促進細胞存活和增殖。研究表明,MM患者骨髓組織CD269表達明顯升高,并可與APRIL結(jié)合激活下游相關(guān)信號通路,如NF-κB信號通路,促進腫瘤細胞增殖、侵襲、遷移等生物學(xué)行為[13]。因此,CD269有可能參與MM的發(fā)生、發(fā)展。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),觀察組骨髓組織CD269相對表達量明顯高于對照組,表明CD269可能參與MM的發(fā)生、發(fā)展。當MM發(fā)生時,骨髓微環(huán)境中CD269的配體APRIL表達增加,可促進CD269表達及活化,進而通過激活下游靶基因,促進TGF-β、IL-10等表達;此外,CD269活化可激活JNK信號通路,進一步促進MM細胞增殖,而JNK信號通路激活反過來又促進CD269表達,從而形成正反饋回路[14]。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn),骨髓組織CD269相對表達量與MM臨床分期和生存時間有關(guān),而與性別、年齡、細胞學(xué)類型、是否復(fù)發(fā)無關(guān),表明CD269表達增加可能促進MM的惡性進展并導(dǎo)致患者預(yù)后不良。有研究認為,CD269表達增加通過激活MAPK/AKT/NF-κB信號通路,通過上調(diào)CDC25B、ACK1等基因表達促進腫瘤細胞增殖,通過下調(diào)BIRC3、MCL1等基因表達抑制腫瘤細胞凋亡,通過上調(diào)VEGFR2、FGFR3等基因表達促進腫瘤血管生成,而用CD269單克隆抗體阻斷其與APRIL結(jié)合,能夠逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞的惡性生物學(xué)行為[15]。
有研究發(fā)現(xiàn),CD269與APRIL結(jié)合激活細胞內(nèi)NF-κB信號通路后,其下游轉(zhuǎn)錄因子能夠促進MDR1表達[5],表明MDR1與CD269可能具有一定相關(guān)性。本研究結(jié)果顯示,MM患者骨髓組織MDR1相對表達量與CD269相對表達量呈正相關(guān)關(guān)系,說明二者可能協(xié)同參與MM的發(fā)生、發(fā)展,與姜方毅等[16]報道一致。但MDR1與CD269相互作用的具體機制尚不清楚,仍需進一步研究。
綜上所述,MM患者骨髓組織MDR1、CD269表達升高,二者可能協(xié)同參與MM的發(fā)生、發(fā)展。