李秀艷，郭麗，卜琦，王玉梅

(1 天津市濱海新區(qū)大港醫(yī)院，天津300270；2 天津市北辰區(qū)中醫(yī)醫(yī)院；3 天津市第五中心醫(yī)院)

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，全球范圍內(nèi)每年新發(fā)病例超過50萬例、死亡病例超過26萬例[1]。近年來，隨著宮頸細(xì)胞學(xué)等早期篩查技術(shù)的廣泛開展，越來越多的宮頸癌和癌前病變得以早期發(fā)現(xiàn)和治療，宮頸癌病死率已有明顯下降趨勢[2]。但晚期宮頸癌患者預(yù)后仍然較差，5年生存率不足15%[3]。目前，關(guān)于宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制仍不十分清楚，尚需進(jìn)一步深入研究。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是長度大于200個(gè)核苷酸，具有多種調(diào)控功能的一類RNA分子，可通過參與基因表達(dá)調(diào)控，影響細(xì)胞增殖、分化、凋亡及腫瘤形成和惡性進(jìn)展等生理或病理生理過程。生長阻滯特異性抑制物5(GAS5)屬于lncRNA家族成員之一，定位于人染色體1q25.1，在胚胎和機(jī)體成熟組織中廣泛表達(dá)，其編碼轉(zhuǎn)錄本的部分二級RNA結(jié)構(gòu)能夠模擬糖皮質(zhì)激素反應(yīng)元件，可與糖皮質(zhì)激素受體的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合，阻止糖皮質(zhì)激素受體被激活，從而阻止相應(yīng)靶基因轉(zhuǎn)錄。近年研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA GAS5可下調(diào)多種組織中癌基因表達(dá)，從而影響乳腺癌、宮頸癌等細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，是一種潛在的腫瘤抑制因子[4，5]。微小RNA(miRNA)是一種長度為20～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，以往被認(rèn)為是轉(zhuǎn)錄過程中的“分子垃圾”。近年研究發(fā)現(xiàn)，成熟的miRNA加入RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物中，可通過與靶mRNA的不完全堿基配對識別，導(dǎo)致靶mRNA的翻譯抑制或去穩(wěn)定化，影響基因表達(dá)，從而調(diào)控腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。miR-205是miRNA家族的重要成員。既往研究發(fā)現(xiàn)，miR-205在非小細(xì)胞肺癌、子宮內(nèi)膜癌等組織中異常表達(dá)，可通過激活雷帕霉素靶蛋白信號通路，促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶9表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移[6]。有研究表明，lncRNA GAS5可作為分子海綿結(jié)合miRNA，如miR-196等，從而影響其對靶基因的調(diào)控，繼而導(dǎo)致腫瘤惡性進(jìn)展[7]。但目前l(fā)ncRNA GAS5、miR-205在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展中作用的報(bào)道較少。為此，本研究觀察了宮頸癌組織lncRNA GAS5、miR-205表達(dá)變化，并探討其臨床意義?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2016年6月～2017年12月天津市濱海新區(qū)大港醫(yī)院和天津市北辰區(qū)中醫(yī)醫(yī)院收治的初診宮頸癌患者93例。所有患者經(jīng)術(shù)后組織病理檢查明確診斷。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合宮頸癌診斷；②FIGO分期Ⅰ、Ⅱ期[8]；③均行宮頸癌根治術(shù)，術(shù)前未接受任何抗腫瘤治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他臟器惡性腫瘤或心、肝、腎等重要臟器嚴(yán)重功能不全者；②術(shù)前接受抗腫瘤治療者；③合并急慢性感染性疾病或免疫系統(tǒng)疾病者；④臨床病理資料不完整者?；颊吣挲g31～69歲，其中<45歲26例、≥45歲67例；腫瘤直徑：<4 cm 53例，≥4 cm 40例；組織分化程度：高中分化21例，低未分化72例；FIGO分期：Ⅰ期25例，Ⅱ期68例；腫瘤浸潤深度：<1/2肌層52例，≥1/2肌層41例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移38例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移55例。本研究經(jīng)天津市濱海新區(qū)大港醫(yī)院、天津市北辰區(qū)中醫(yī)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患者或其家屬知情同意。

1.2 lncRNA GAS5、miR-205表達(dá)檢測 取手術(shù)切除的宮頸癌組織及其配對的癌旁正常組織(距腫瘤組織邊緣1.5～2.0 cm并經(jīng)組織病理檢查證實(shí)為正常宮頸組織)，采用TRIzol法提取組織總RNA，經(jīng)超微量紫外分光光度計(jì)鑒定，OD260/OD280為1.8～2.1，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。按TaqMan miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)條件：16 ℃ 30 min、42 ℃ 30 min、85 ℃ 5 min。以cDNA為模板，按SYBR Green熒光定量PCR試劑盒說明進(jìn)行PCR擴(kuò)增。lncRNA GAS5、miR-205引物序列由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)合成。引物序列：lncRNA GAS5上游引物5′-CTTGCCTGGACCAGCTTAAT-3′、下游引物5′-CAAGCCGACTCTCCATACCT-3′，內(nèi)參CAPDH上游引物5′-GGGAGCCAAAAGGGTCAT-3′、下游引物5′-GAGTCCTTCCACGATACCAA-3′；miR-205上游引物5′-CCCAAGCTTCTGGGTGGCTGTTTTGAAAAC-3′、下游引物5′-CCGCTCGAGGAAGCACGCACACTCCAGATG-3′，內(nèi)參U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′、下游引物3′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-5′。PCR反應(yīng)體系共20 μL：模板cDNA 1 μL，上下游引物各0.5 μL，SYBR Green Premix 8 μL，不含RNase去離子水10 μL；反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s共40個(gè)循環(huán)(lncRNA GAS5)；95 ℃ 2 min，94 ℃ 15 s、60 ℃ 20 s、72 ℃ 10 s共40個(gè)循環(huán)(miR-205)。所有反應(yīng)在ABI 7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上完成。以CAPDH或U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計(jì)算目的基因相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌組織與癌旁正常組織lncRNA GAS5、miR-205表達(dá)比較 宮頸癌組織與癌旁正常組織lncRNA GAS5相對表達(dá)量分別為0.52±0.17、1.04±0.14，miR-205相對表達(dá)量分別為1.12±0.34、0.59±0.12。宮頸癌組織lncRNA GAS5相對表達(dá)量明顯低于癌旁正常組織，miR-205相對表達(dá)量明顯高于癌旁正常組織(t分別為22.771、14.176，P均<0.05)。

2.2 宮頸癌組織lncRNA GAS5表達(dá)與miR-205表達(dá)的關(guān)系 Pearson相關(guān)分析顯示，宮頸癌組織lncRNA GAS5相對表達(dá)量與miR-205相對表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.473，P<0.05)。

2.3 宮頸癌組織lncRNA GAS5、miR-205表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系 宮頸癌組織lncRNA GAS5相對表達(dá)量與腫瘤直徑、FIGO分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.05)，與患者年齡、組織分化程度、腫瘤浸潤深度無關(guān)(P均>0.05)；miR-205相對表達(dá)量與FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤浸潤深度有關(guān)(P均<0.05)，與患者年齡、腫瘤直徑、組織分化程度無關(guān)(P均>0.05)。見表1。

表1 宮頸癌組織lncRNA GAS5、miR-205表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

宮頸癌是女性常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤首位，并呈年輕化趨勢。近年來，隨著宮頸癌篩查、預(yù)防及對癌前病變早期診斷技術(shù)的不斷發(fā)展，患者病死率已有明顯下降趨勢。但對晚期宮頸癌患者，預(yù)后仍然較差。因此，進(jìn)一步闡明宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制，尋找腫瘤早期診斷的分子標(biāo)志物和潛在的治療靶點(diǎn)具有重要意義。

在人類基因組中，非編碼序列占97%左右，可表達(dá)產(chǎn)生大量非編碼RNA。這些非編碼RNA在細(xì)胞生命活動和個(gè)體發(fā)育等方面發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。近年研究發(fā)現(xiàn)，在非小細(xì)胞肺癌、結(jié)直腸癌等組織中存在非編碼RNA異常表達(dá)現(xiàn)象，可通過調(diào)節(jié)癌基因或抑癌基因表達(dá)，影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，有可能成為某些腫瘤診斷的生物學(xué)標(biāo)志和潛在的治療靶標(biāo)[9]。lncRNA是長度大于200個(gè)核苷酸，具有多種調(diào)控功能的一類RNA分子，能夠通過調(diào)節(jié)染色質(zhì)重塑、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾等生物學(xué)過程，參與慢性炎癥、自身免疫性疾病及惡性腫瘤等疾病的發(fā)生、發(fā)展過程[10]。有研究表明，lncRNA能夠在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)，通過調(diào)控多種靶基因來發(fā)揮癌基因或抑癌基因作用，從而影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[11]。GAS5屬于lncRNA家族成員之一，定位于人染色體1q25.1。近年研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA GAS5可通過直接作用或與miRNA相互作用影響靶基因表達(dá)，在多種惡性腫瘤中發(fā)揮抑癌作用[12]。但lncRNA GAS5在宮頸癌中作用的報(bào)道較少。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織lncRNA GAS5相對表達(dá)量明顯低于癌旁正常組織，表明lncRNA GAS5在宮頸癌中可能亦具有抑癌作用。目前，lncRNA GAS5在宮頸癌中具體的作用機(jī)制尚不清楚，可能與lncRNA GAS5基因啟動子甲基化導(dǎo)致基因表達(dá)沉默有關(guān)；也可能與miRNA可結(jié)合于lncRNA GAS5信使RNA，使lncRNA GAS5穩(wěn)定性下降，從而抑制lncRNA GAS5表達(dá)有關(guān)[13]。Li等[14]研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA GAS5過表達(dá)能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白D1、p21和凋亡蛋白酶激活因子1表達(dá)，抑制卵巢癌細(xì)胞增殖。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織lncRNA GAS5相對表達(dá)量與腫瘤直徑、FIGO分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，與患者年齡、組織分化程度、腫瘤浸潤深度無關(guān)，提示lncRNA GAS5低表達(dá)與宮頸癌惡性進(jìn)展有關(guān)，與Li等[14]報(bào)道基本一致。

miRNA是一種長度為20～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，能夠通過調(diào)節(jié)靶基因蛋白表達(dá)，在機(jī)體生長、發(fā)育等方面發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。近年研究發(fā)現(xiàn)，miRNA還可作為多種腫瘤早期診斷和預(yù)后判斷的生物標(biāo)志物[15]。miR-205是miRNA家族的重要成員。既往研究發(fā)現(xiàn)，miR-205在非小細(xì)胞肺癌、子宮內(nèi)膜癌等組織中異常表達(dá)，可通過激活雷帕霉素靶蛋白信號通路，促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶9表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，有望成為腫瘤早期診斷和預(yù)后判斷的生物標(biāo)志物[6，16]。但miR-205在宮頸癌中作用的報(bào)道較少。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織miR-205相對表達(dá)量明顯高于癌旁正常組織，提示miR-205有可能參與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展，但其具體作用機(jī)制尚不清楚。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織miR-205相對表達(dá)量與FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤浸潤深度有關(guān)，與患者年齡、腫瘤直徑、組織分化程度無關(guān)，提示miR-205高表達(dá)與宮頸癌惡性進(jìn)展有關(guān)，與Ma等[17]報(bào)道基本一致，其作用機(jī)制可能與miR-205具有促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)標(biāo)志物基因的表達(dá)有關(guān)[18]。

有研究報(bào)道，lncRNA SNHG5可作為競爭性內(nèi)源RNA結(jié)合并抑制miR-205表達(dá)，進(jìn)而抑制腫瘤惡性進(jìn)展，而敲除lncRNA SNHG5表達(dá)后miR-205表達(dá)升高，則可促進(jìn)腫瘤惡性進(jìn)展[19]。本研究相關(guān)性分析顯示，宮頸癌組織lncRNA GAS5表達(dá)與miR-205表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，表明lncRNA GAS5亦能通過結(jié)合并抑制miR-205表達(dá)，進(jìn)而抑制宮頸癌惡性進(jìn)展[20]，但二者具體的相互作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，宮頸癌組織lncRNA GAS5表達(dá)下調(diào)、miR-205表達(dá)上調(diào)，二者共同參與宮頸癌形成和惡性進(jìn)展。lncRNA GAS5、miR-205有可能成為宮頸癌篩查的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。