馮苗，韓立薇，吳穗妹，李玉華，李蕾蕾，李艷秋，張碧云

(廣東省計(jì)劃生育專(zhuān)科醫(yī)院，廣州510600)

子宮內(nèi)膜息肉(EP)是一種常見(jiàn)的宮腔內(nèi)良性病變，是引起不孕癥的常見(jiàn)原因之一。有研究報(bào)道，16.5%～26.5%的不明原因性不孕癥患者合并EP[1]。近年來(lái)，隨著超聲技術(shù)不斷發(fā)展和宮腔鏡廣泛應(yīng)用，EP的檢出率越來(lái)越高。不孕癥患者助孕前常規(guī)行宮腔鏡檢查，EP的檢出率高達(dá)23.6%[2]。目前，EP的病因和發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，普遍認(rèn)為與雌孕激素受體失調(diào)、炎癥刺激、氧化應(yīng)激、細(xì)胞因子表達(dá)異常及細(xì)胞增殖與凋亡失調(diào)等有關(guān)[3]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)是一種作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞因子，具有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、分化，增加微血管通透性及誘導(dǎo)血管生成等作用，是判斷種植窗期子宮內(nèi)膜容受性的生物標(biāo)志物之一。Ki-67是一種與細(xì)胞增殖相關(guān)的核抗原。有研究報(bào)道，VEGF、Ki-67異常表達(dá)與絕經(jīng)后婦女EP形成和術(shù)后復(fù)發(fā)有關(guān)。但在育齡期EP不孕癥患者增殖期與種植窗期子宮內(nèi)膜組織中VEGF、Ki-67表達(dá)的報(bào)道較少。為此，本研究觀察了育齡期EP不孕癥患者增殖期與種植窗期子宮內(nèi)膜組織VEGF、Ki-67表達(dá)變化，旨在探索VEGF、Ki-67異常表達(dá)與EP形成和術(shù)后復(fù)發(fā)及子宮內(nèi)膜容受性的關(guān)系?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2018年4～12月在廣東省計(jì)劃生育專(zhuān)科醫(yī)院就診的、因不孕癥行宮腔鏡檢查發(fā)現(xiàn)宮腔內(nèi)贅生物并經(jīng)病理證實(shí)為EP患者84例(觀察組)，其中初發(fā)63例、復(fù)發(fā)21例，年齡20～35(30.3±3.5)歲，不孕年限1～12(4.7±3.1)年。所有患者經(jīng)全面檢查排除輸卵管、子宮畸形，內(nèi)分泌、免疫系統(tǒng)疾病及男方因素等導(dǎo)致的不孕癥。同期選擇在廣東省計(jì)劃生育專(zhuān)科醫(yī)院就診的，因男方因素所致的不孕癥，宮腔鏡檢查未發(fā)現(xiàn)宮腔內(nèi)贅生物且病理證實(shí)為正常子宮內(nèi)膜者43例(對(duì)照組)，年齡20～40(31.3±3.9)歲，不孕年限1～10(5.6±3.3)年。兩組年齡、不孕年限具有可比性。本研究經(jīng)廣東省計(jì)劃生育專(zhuān)科醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者或其家屬知情同意。

1.2 VEGF、Ki-67表達(dá)檢測(cè) 觀察組入院后行宮腔鏡檢查，其中處于增殖期62例(復(fù)發(fā)21例均處于增殖期)、種植窗期22例，留取EP組織、EP周?chē)?.5～1.0 cm肉眼觀察無(wú)異常子宮內(nèi)膜組織(以下稱(chēng)周?chē)M織)；對(duì)照組入院后亦行宮腔鏡檢查，其中處于增殖期23例、種植窗期20例，留取正常子宮內(nèi)膜組織(以下稱(chēng)正常組織)。

所有組織10%中性甲醛固定，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟，常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片。切片經(jīng)59 ℃電熱恒溫干燥箱過(guò)夜，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，3% H2O2室溫孵育5～10 min以滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，微波加熱修復(fù)抗原。5%正常山羊血清封閉10～15 min，分別加入鼠抗人VEGF單克隆抗體、兔抗人Ki-67多克隆抗體，4 ℃濕盒中孵育過(guò)夜。次日，加入生物素化二抗，37 ℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察。用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，用已知陽(yáng)性的乳腺癌組織作為陽(yáng)性對(duì)照。

采用雙盲法由兩位病理科醫(yī)師獨(dú)立閱片。VEGF陽(yáng)性染色定位于細(xì)胞質(zhì)，呈淺黃色至棕褐色顆粒；Ki-67陽(yáng)性染色定位于細(xì)胞核，呈淺黃色至棕褐色顆粒。每張切片隨機(jī)選取10個(gè)400倍視野，評(píng)估染色強(qiáng)度；計(jì)數(shù)每視野陽(yáng)性細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞比例。染色強(qiáng)度評(píng)分：未著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽(yáng)性細(xì)胞比例評(píng)分：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為0分，<5%為1分，5%～<50%為2分，50%～<70%為3分，≥70%為4分。以染色強(qiáng)度評(píng)分和陽(yáng)性細(xì)胞比例評(píng)分綜合評(píng)價(jià)，二者之和≥3分為VEGF或Ki-67陽(yáng)性表達(dá)[4]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組增殖期VEGF、Ki-67陽(yáng)性表達(dá)比較 見(jiàn)表1。

表1 兩組增殖期VEGF、Ki-67陽(yáng)性表達(dá)比較[例(%)]

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與同發(fā)病狀態(tài)周?chē)M織比較，#P<0.05。

2.2 兩組種植窗期VEGF、Ki-67陽(yáng)性表達(dá)比較 見(jiàn)表2。

表2 兩組種植窗期VEGF、Ki-67陽(yáng)性表達(dá)比較[例(%)]

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

3 討論

EP是子宮內(nèi)膜基底層的局限性良性增生，有蒂突向?qū)m腔，由少量致密纖維結(jié)締組織組成的間質(zhì)、管壁較厚的血管及子宮內(nèi)膜腺體組成，好發(fā)于育齡期或圍絕經(jīng)期婦女，是引起育齡期婦女不孕癥的常見(jiàn)原因之一[5，6]。目前，臨床治療通常采用宮腔鏡電切術(shù)。EP切除后不僅能提高育齡期不孕癥患者自然妊娠率，還能改善輔助生殖技術(shù)助孕的育齡期不孕癥患者妊娠結(jié)局，但術(shù)后復(fù)發(fā)率高達(dá)13.3%[7]。眾所周知，子宮內(nèi)膜在正常月經(jīng)周期中經(jīng)歷增殖、分化、脫落的周期性變化，而EP組織同正常子宮內(nèi)膜一樣也存在周期性變化。因此推測(cè)，EP在宮腔內(nèi)占位機(jī)械性干擾胚胎著床并造成子宮內(nèi)膜微環(huán)境改變，有可能是導(dǎo)致EP不孕的重要原因[6，8]。

VEGF是血小板生長(zhǎng)因子超家族的重要成員之一，是目前已知作用最強(qiáng)的促血管生成因子，能直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，通過(guò)與其特異性受體結(jié)合，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖并增加其通透性，介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移和浸潤(rùn)，從而有利于血管形成[9]。VEGF在月經(jīng)周期各時(shí)期子宮內(nèi)膜中均有表達(dá)，對(duì)內(nèi)膜血管生成和血管通透性改變及月經(jīng)來(lái)潮后內(nèi)膜再生至關(guān)重要。在增殖期，子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞表達(dá)的VEGF主要作用于間質(zhì)，可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、新生血管形成。在分泌期，子宮內(nèi)膜VEGF表達(dá)增加，可使內(nèi)膜微血管密度和血管通透性增加，內(nèi)膜間質(zhì)明顯水腫，為胚胎著床提供了必需的條件。在增殖期，對(duì)照組子宮內(nèi)膜組織VEGF弱陽(yáng)性表達(dá)，有利于血管生成，從而促進(jìn)月經(jīng)后的內(nèi)膜修復(fù)；觀察組無(wú)論是初發(fā)還是復(fù)發(fā)EP組織VEGF陽(yáng)性表達(dá)均明顯高于周?chē)M織和對(duì)照組，EP組織VEGF過(guò)表達(dá)引起組織內(nèi)新生血管過(guò)度生成并伴有間質(zhì)纖維組織增加，顯微鏡下可見(jiàn)成束或成索的大血管，這是EP組織區(qū)別于正常子宮內(nèi)膜組織的一個(gè)重要特征[10]；復(fù)發(fā)EP組織VEGF陽(yáng)性表達(dá)明顯高于初發(fā)EP組織，VEGF高表達(dá)反映了血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷徙和血管構(gòu)建水平高，這可能是導(dǎo)致EP復(fù)發(fā)的原因之一。VEGF作為判斷子宮內(nèi)膜容受性的生物學(xué)標(biāo)志之一，能為種植提供血管化的容受性。在種植窗期，對(duì)照組子宮內(nèi)膜組織VEGF陽(yáng)性表達(dá)增加，有助于胚胎著床和早期絨毛血管形成；觀察組EP組織及周?chē)M織VEGF陽(yáng)性表達(dá)均明顯低于對(duì)照組，其陽(yáng)性表達(dá)降低可能與子宮內(nèi)膜下血流灌注減少，從而影響子宮內(nèi)膜容受性有關(guān)[11]，最終導(dǎo)致胚胎著床失敗，繼而引起不孕[12]。

Ki-67是一種與細(xì)胞增殖相關(guān)的核抗原，定位于人10號(hào)染色體，其功能與有絲分裂密切相關(guān)[13]。Ki-67反映細(xì)胞增殖活性的效果要明顯優(yōu)于PCNA指數(shù)、DNA指數(shù)、DNA倍體含量等指標(biāo)。Ki-67在增生期子宮內(nèi)膜組織中弱表達(dá)，而在分泌期子宮內(nèi)膜組織中幾乎不表達(dá)。有研究證實(shí)，Ki-67過(guò)表達(dá)在子宮內(nèi)膜病變的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用。對(duì)照組增殖期子宮內(nèi)膜組織Ki-67弱表達(dá)，表明處于活躍的增生狀態(tài)，有利于子宮內(nèi)膜修復(fù)和再生[14]；觀察組無(wú)論是初發(fā)EP組織還是復(fù)發(fā)EP組織Ki-67陽(yáng)性表達(dá)均明顯高于周?chē)M織和對(duì)照組；而種植窗期，兩組子宮內(nèi)膜組織幾乎無(wú)Ki-67陽(yáng)性表達(dá)，從而限制了子宮內(nèi)膜增生，有利于子宮內(nèi)膜的周期性脫落。這些結(jié)果表明，Ki-67高表達(dá)可能與EP的形成及術(shù)后復(fù)發(fā)有關(guān)，Ki-67表達(dá)增加是細(xì)胞增殖活性和有絲分裂增強(qiáng)的標(biāo)志，提示EP是一種細(xì)胞增殖性疾病，腺體細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞有絲分裂增強(qiáng)，有更多的細(xì)胞進(jìn)入增殖周期，但局限于EP內(nèi)，并不是組織失控性增生[15]，故在育齡婦女中起源于EP的子宮內(nèi)膜癌非常少見(jiàn)。EP病理組織學(xué)常見(jiàn)的是單純性或復(fù)雜性增生，伴或不伴整個(gè)子宮內(nèi)膜增生[16]。

綜上所述，EP不孕癥患者增殖期EP組織VEGF、Ki-67高表達(dá)可能與EP形成和術(shù)后復(fù)發(fā)有關(guān)，而種植窗期EP組織VEGF低表達(dá)可能與子宮內(nèi)膜容受性欠佳有關(guān)。這一結(jié)論有可能為EP不孕癥患者治療方案選擇乃至研發(fā)治療EP的靶向藥物提供理論依據(jù)。