王愛峰

摘 ?要：為探究家禽養(yǎng)殖舍消毒前后細(xì)菌總數(shù)的變化情況。運(yùn)用細(xì)菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)方法，對(duì)某養(yǎng)殖公司肉鴨養(yǎng)殖場(chǎng)立體籠養(yǎng)鴨舍的14個(gè)檢測(cè)點(diǎn)消毒前后總數(shù)進(jìn)行了檢測(cè)計(jì)數(shù)。結(jié)果表明： 鴨舍料槽、網(wǎng)床、水線、水碗、側(cè)網(wǎng)處消毒前的菌落總數(shù)分別為14×104、1.6×104、10×104、8.3×104、3.0×104CFU/cm2。消毒后細(xì)菌總數(shù)分別為5.7×104、0.3×104、6.3×104、4.2×104、1.1×104CFU/cm2;10個(gè)檢測(cè)點(diǎn)消毒前污染程度各不相同，消毒細(xì)菌數(shù)均有不同程度下降，消毒效果明顯。

關(guān)鍵詞：細(xì)菌檢測(cè);肉鴨養(yǎng)殖;消毒

中圖分類號(hào)：S858.311.36 ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B ? ? 文章編號(hào)：1673-1085（2019）10-0044-04

1 ?材料與方法

1.1 ?儀器與試劑 ?隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱、立式壓力蒸汽滅菌器、電熱鼓風(fēng)干燥箱、潔凈工作臺(tái)、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、氯化鈉、麥康凱培養(yǎng)基、或微量移液器、吸耳球、試管、無菌培養(yǎng)皿、pH計(jì)或pH比色管或精密pH試紙、無菌棉拭子（棉簽）等。

1.2 ?實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

1.2.1 ?培養(yǎng)基制備 ?配制溶液：稱量好各種原料（營(yíng)養(yǎng)瓊脂等）和準(zhǔn)備干凈容器（錐形瓶等），依據(jù)培養(yǎng)基的配方，準(zhǔn)備并稱取各種原料，按序加入后使其溶解，最后補(bǔ)足所需水分，封口加熱溶解（若在加熱進(jìn)程中水分蒸發(fā)，應(yīng)在全部原料溶解后加水補(bǔ)足）。

調(diào)節(jié)pH值：用pH試紙測(cè)定培養(yǎng)基的pH值，若不符合需要可用10%稀鹽酸或10%氫氧化鈉進(jìn)行調(diào)節(jié)，直到調(diào)節(jié)到中性（7.0～7.2）為止。

過濾：用濾紙趁熱將已配好的培養(yǎng)基過濾?？蓪V紙折疊（浸潤(rùn)）后，鋪在漏斗上過濾。

分裝制作平板培養(yǎng)基：在潔凈工作臺(tái)內(nèi)，將剛剛滅過菌的盛有制備好營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)液的錐形瓶和培養(yǎng)皿放在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，待營(yíng)養(yǎng)瓊脂溶液冷卻至60℃左右，點(diǎn)燃酒精燈，右手托起錐形瓶瓶底，將瓶口在酒精燈上稍微灼燒，左手在酒精燈火焰附近以無菌狀態(tài)打開平皿蓋，傾入瓊脂溶液約15mL左右，輕輕搖晃，使培養(yǎng)基平鋪于平皿底部，放置15min左右待其凝固后倒置過來，標(biāo)注制作日期、名稱等平放在隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)備用。24h后查看，如培養(yǎng)基內(nèi)長(zhǎng)雜菌，棄用。

1.3 ?檢測(cè)場(chǎng)所 ?山東省泰安市某養(yǎng)殖公司肉鴨養(yǎng)殖場(chǎng)立體籠養(yǎng)鴨舍。

1.3.1 ?鴨舍概況 ?本實(shí)驗(yàn)在泰安市某養(yǎng)殖公司的肉鴨養(yǎng)殖示范場(chǎng)采集樣本，該養(yǎng)殖場(chǎng)于2014年10月建成投產(chǎn)，占地10000m2，建筑面積1200m2，建有鋼架結(jié)構(gòu)鴨舍、鴨糞陽光發(fā)酵處理池、消毒間等。養(yǎng)殖示范場(chǎng)設(shè)有三種不同養(yǎng)殖技術(shù)模式，分別是：網(wǎng)上平養(yǎng)，刮糞板機(jī)械清除;上網(wǎng)下床，采用農(nóng)作物秸稈添加微生態(tài)制劑發(fā)酵床發(fā)酵鴨糞處理技術(shù);立體籠養(yǎng)，采用自動(dòng)化傳送帶清理鴨糞。該場(chǎng)消毒設(shè)施及消毒制度健全，消毒藥物齊全，檢測(cè)數(shù)據(jù)真實(shí)可靠且具有代表性。

1.3.2 ?消毒模式 ?空棚消毒[1]，進(jìn)鴨苗前一天用改性戊二醛（50%）全棚噴灑消毒[2]。

2 ?樣品采集與處理

2.1 ?樣品采集

2.1.1 ?鴨舍消毒前樣品的采集 ?采樣時(shí)間：在立體籠養(yǎng)鴨舍清理鴨糞、灰塵、雜物等并用水徹底沖洗12h后，實(shí)驗(yàn)人員到鴨舍現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行采集[3，4]。

采樣點(diǎn)確定及采集方法：

空氣中微生物檢測(cè)：采用自然沉降的方法，分別在鴨舍第1、2排頭處，第3、4排末尾和中間，第4、5排末尾各選擇一個(gè)適宜位置，均勻分布，共4個(gè)采集點(diǎn)。距離地面高度約0.5m，避開風(fēng)口，避免人員走動(dòng)，分別放置營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，打開平皿蓋，暴露15min左右蓋上平皿蓋并注明棟舍號(hào)、采樣日期、采樣點(diǎn)號(hào)等備用。

養(yǎng)殖舍物體表面細(xì)菌的采集[5]：鴨舍的料槽、網(wǎng)床、水線、水碗、側(cè)網(wǎng)處各確定2個(gè)采集區(qū)，每個(gè)采集區(qū)均勻分布一個(gè)采集點(diǎn)，共采集10個(gè)點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)采樣面積1×5cm2，每個(gè)點(diǎn)采樣10cm2。采樣方法：點(diǎn)燃酒精燈，試管口灼燒滅菌再打開膠塞，每個(gè)采樣點(diǎn)用滅菌生理鹽水浸潤(rùn)滅菌棉拭子，迅速在采樣點(diǎn)1×5cm2面積內(nèi)橫豎往返均勻涂擦，全部擦拭后，將棉拭子捻轉(zhuǎn)去除手接觸部位放入10ml滅菌生理鹽水試管內(nèi)，再換一采樣點(diǎn)重復(fù)上述操作，兩只棉拭子放入同一滅菌生理鹽水試管，然后注明棟舍號(hào)、采樣日期、采樣點(diǎn)號(hào)等放入試管架上備用，即為該采樣點(diǎn)采集的樣本。

2.1.2 ?鴨舍消毒后樣品的采集 ?鴨舍消毒后進(jìn)鴨前1d，按2.1.1方法和要求進(jìn)行采樣。

2.2 ?待檢樣品處理 ?將空氣中微生物檢測(cè)和養(yǎng)殖舍物體表面細(xì)菌檢測(cè)共14個(gè)采集點(diǎn)的樣本放入同一個(gè)泡沫箱內(nèi)，即為該鴨舍所采集樣品，泡沫箱貼上標(biāo)簽，并注明棟舍號(hào)、采樣區(qū)域、采樣日期等，即為待測(cè)液體樣品1：10稀釋液（10倍液體樣品），室溫條件下保存，帶回樣品處理實(shí)驗(yàn)室備用。

2.2.1 ?待檢液體樣品的稀釋 ?用1mL移液管吸取1mL待檢液體樣本置盛有9mL生理鹽水的無菌試管中，充分混勻，制成1：100的待檢樣品稀釋液[6]。再用1mL移液器吸取1：100待檢樣品稀釋液1mL，沿管壁緩慢注入盛有9mL稀釋液的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面以免使結(jié)果準(zhǔn)確性下降），振搖試管或反復(fù)吹打使其均勻混合，制成1：1000的待檢樣品稀釋液。按上述操作，制備10倍系列待檢樣品稀釋液。每遞增稀釋一次，換用1次1mL無菌吸管。依據(jù)對(duì)樣品污染情況的估計(jì)，選擇2～3個(gè)適宜稀釋度的待檢樣品稀釋液，根據(jù)鴨舍污染程度做了1：100、1：1000和1：10000三個(gè)稀釋度。

2.2.2 ?細(xì)菌培養(yǎng) ?在進(jìn)行10倍遞增稀釋時(shí)，同時(shí)吸取1mL待檢樣品稀釋液于無菌平皿內(nèi)，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平行試驗(yàn)。每個(gè)檢測(cè)區(qū)域1：100、1：1000和1：10000三個(gè)稀釋度分別做兩個(gè)平行試驗(yàn)，同時(shí)吸取1mL滅菌生理鹽水加入一個(gè)無菌平皿內(nèi)作空白對(duì)照。共做35個(gè)培養(yǎng)平皿，包括34個(gè)檢測(cè)，1個(gè)空白對(duì)照。34個(gè)檢測(cè)包括：4個(gè)空氣檢測(cè)，30個(gè)養(yǎng)殖舍物體表面檢測(cè)（每個(gè)采集點(diǎn)6個(gè)平皿，5個(gè)采樣點(diǎn)，共30個(gè)）。及時(shí)將冷卻至60℃的營(yíng)養(yǎng)瓊脂溶液培養(yǎng)基（可先放置于60℃±1℃恒溫水浴箱中保溫）傾注約15mL到平皿，并緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使其混合均勻。待瓊脂凝固后，將平板倒置，放入隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱37±1℃培養(yǎng)24±2h[7，8]。

2.2.3 ?菌落計(jì)數(shù) ?即計(jì)算55cm2平皿表面的菌落總數(shù)，可用肉眼直接觀察，必要時(shí)用放大鏡或菌落計(jì)數(shù)器，記錄相應(yīng)稀釋倍數(shù)的菌落數(shù)量以防遺漏[7]。菌落計(jì)數(shù)以菌落形成單位（colony-forming units，CFU）表示。

2.2.4 ?菌落總數(shù)的計(jì)算與報(bào)告 ?菌落數(shù)小于100 CFU時(shí)，按“四舍五入”原則修約，以整數(shù)報(bào)告;菌落數(shù)大于或等于100CFU時(shí)，第3位數(shù)字采用“四舍五入”原則修約后，取前2位數(shù)字，后面用0代替?zhèn)€位數(shù);也可用10的指數(shù)形式來表示，按“四舍五入”原則修約后，取前2位數(shù)字;若所有平板上為蔓延菌落而無法計(jì)數(shù)，則報(bào)告菌落蔓延;若空白對(duì)照上有菌落生長(zhǎng)，則此次檢測(cè)結(jié)果無效（平面取樣以CFU/cm2為報(bào)告單位，稱重取樣以CFU/g為單位報(bào)告，體積取樣以CFU/mL為單位報(bào)告）。

菌落總數(shù)測(cè)定根據(jù)《GB4789.2-2010菌落總數(shù)測(cè)定》進(jìn)行相應(yīng)處理，大腸桿菌測(cè)定根據(jù)《GB4789.38-2012大腸埃希菌計(jì)數(shù)》中所記錄方法進(jìn)行處理，金黃色葡萄球菌根據(jù)《GB4789.10-2010金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》中所記錄方法進(jìn)行處理，霉菌根據(jù)《GB4789.15-2010霉菌和酵母計(jì)數(shù)》中所記錄方法進(jìn)行處理。

3 ?結(jié)果與分析

3.1 ?細(xì)菌總數(shù)檢測(cè)結(jié)果 ?按上述方法，對(duì)某立體籠養(yǎng)鴨舍消毒前料槽、網(wǎng)床、水線、水碗、側(cè)網(wǎng)等物體表面和空氣沉降檢測(cè)細(xì)菌總數(shù)的計(jì)算結(jié)果[9]，見表1和表2。

3.2 ?消毒效果檢測(cè)結(jié)果 ?按上述方法，對(duì)某立體籠養(yǎng)鴨舍消毒后料槽、網(wǎng)床、水線、水碗、側(cè)網(wǎng)等物體表面和空氣沉降檢測(cè)細(xì)菌總數(shù)的計(jì)算結(jié)果，見表3和表4。

4 ?討論與結(jié)論

隨著養(yǎng)禽業(yè)日新月異的發(fā)展使得細(xì)菌的檢測(cè)方法在鑒定技術(shù)有新突破，不僅實(shí)現(xiàn)了對(duì)病原微生物進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，而且更適合于病原菌全面、快速、高質(zhì)量檢測(cè)的需要，為臨床提供及時(shí)準(zhǔn)確的細(xì)菌鑒定結(jié)果，在一定程度上有助于緩解傳染病過度危害肉鴨的問題，減輕了養(yǎng)殖戶和養(yǎng)殖公司的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，促進(jìn)行業(yè)的健康發(fā)展。

消毒前后檢測(cè)結(jié)果對(duì)比顯示，消毒后帶菌量下降較為明顯[10]，菌落數(shù)小于6.0×104CFU/cm2的物表所占比例達(dá)到75%，采樣點(diǎn)中料槽是帶菌量最大的物表，消毒前平均帶菌量為14×104CFU/cm2，消毒后為5.7×104CFU/cm2，結(jié)果表明有效消毒后，能大量清除物表暫居菌的數(shù)量，消毒后的平均合格率達(dá)90%以上。

所以對(duì)禽舍消毒必須要高度重視，使用的消毒劑種類、使用劑量、消毒方法、消毒時(shí)間長(zhǎng)短、禽舍內(nèi)溫濕度等不同均會(huì)產(chǎn)生不同的消毒效果。當(dāng)平均合格率達(dá)到90%以上，即可證明禽舍的完成消毒且消毒合格，允許進(jìn)行下一批次肉鴨的飼養(yǎng);若平均合格率在90%以下，則說明此次消毒不合格，需要再次進(jìn)行消毒，直至消毒合格后方可進(jìn)行下一批次肉鴨的飼養(yǎng)。

參考文獻(xiàn)：

[1] ?齊勝利，孔慶友，何閃. 種鴨場(chǎng)空棚消毒的六大步驟[J].國(guó)外畜牧學(xué)-豬禽，2013，33（10）：42～44.

[2] ?翟洪民.鴨舍消毒方法及注意事項(xiàng)[J].養(yǎng)禽與禽病防治，2014，5：40～41.

[3] ?王光鋒，李舫，靖吉強(qiáng)，等.種鴨場(chǎng)空舍期不同消毒模式的效果比較[J].中國(guó)家禽，2015，37（8）：64～68.

[4] ?蘇益瓊.旱養(yǎng)肉鴨舍建設(shè)及消毒[J].畜牧獸醫(yī)報(bào)，2015，7：1 .

[5] ?吳水菊.病歷夾細(xì)菌檢測(cè)及消毒[J].臨床護(hù)理雜志，2006，5（1）：53～54.

[6] ?武世珍，靖吉強(qiáng)，王光峰，等.網(wǎng)養(yǎng)肉鴨舍不同消毒模式對(duì)金黃色葡萄球菌的消毒效果[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2016（8）：128～130.

[7] ?李穎，李婷.影響乳酸菌平板菌落計(jì)數(shù)的方法研究[J].中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥，2016，11，（16）：287～288.

[8] ?王瑞蓮，林裕龍.細(xì)菌檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J].國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2014，35（16）：2200～2201.

[9] ?沈小芳.辦公室電腦鍵盤、鼠標(biāo)表面消毒前后細(xì)菌污染狀況[J].環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué)，2010，27（3）：160～161.

[10] ?楊竹蘭，劉智勇，甘露，等.臨床病區(qū)終末消毒前后物表暫居菌的比較研究[J].國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2015，36（11）：1491～1493.

[11] ?Branch-Elliman MD， Ernie RR. Direct feedback with the ATP luminometer as a process improvement tool for terminal cleaning of patient rooms[J]. Am J Infect Control.2014（42）：195～197.

[12] ?Xie P， Wang Y M， Wang C， et al. Effect of different fat sources in parental diets on growth performance， villus morphology， digestive enzymes and colorectal microbiota in pigeon squab[J]. Archives of Animal Nutrition，2015，67（2）：147～160.

[13] ?Bullman S，Luce B，Sleator R D.Molecular diagnostics the changing culture of medical microbiology[J]. Bioengineered， 2015，3（1）：1～7.