田亞東 鄒 旸 韓琳潔 劉 正 郝東升 鐘 成 彭傳文 范 寰

（1.天津科技大學(xué)工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300457；2.天津嘉立荷牧業(yè)集團(tuán)有限公司，天津300402；3.天津市畜牧獸醫(yī)研究所，天津300381）

黃曲霉是一類生命力極其頑強(qiáng)的腐敗微生物[1]，在動(dòng)物飼料中生長會(huì)導(dǎo)致對人體和動(dòng)物的傷害，同時(shí)也是在飼料儲(chǔ)存、貯藏過程中引起飼料腐敗霉化的主要污染源之一。國內(nèi)外對如何抑制黃曲霉生長進(jìn)行了大量研究，如熱處理、紅外線處理等物理方法，添加乳酸、苯甲酸等添加劑的化學(xué)方法等，但隨著實(shí)際應(yīng)用，這些傳統(tǒng)方法尚未證明是經(jīng)濟(jì)有效可行的[2-3]。研究和開發(fā)綠色飼料添加劑產(chǎn)品，已經(jīng)成為世界性的研究課題。目前國內(nèi)外研究表明，部分乳酸菌對黃曲霉的生長和毒素的形成有一定的抑制作用[4]。植物乳桿菌、乳酸片球菌和凝結(jié)芽孢桿菌三者均為同型發(fā)酵乳酸菌[5]。在發(fā)酵過程中的代謝產(chǎn)物如有機(jī)酸和細(xì)菌素等物質(zhì)均對雜菌有一定的抑制作用，可作為天然綠色的生物防腐劑[6]。王麗學(xué)等[7]前期研究表明凝結(jié)芽孢桿菌、植物乳桿菌和乳酸片球菌復(fù)合微生物菌劑能有效提高全株玉米青貯品質(zhì)。本研究以這三種菌及其混合培養(yǎng)液為研究對象，研究這三種同型發(fā)酵乳酸菌及混合培養(yǎng)液對黃曲霉的抑菌作用，以期為飼料微生物添加劑的研制提供指導(dǎo)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)菌株：植物乳桿菌lactobacillus plantarumACCC11016 購自于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心；乳酸片球菌Pediococcus acidilacticiCGMCC 1.4購自于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；凝結(jié)芽孢桿菌Bacillus coagulansACCC10229購自于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心；黃曲霉菌Aspergillus flavusCICC NO.2219 購自于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

培養(yǎng)基：MRS 培養(yǎng)基（Modified MRS Medium Base，MRS）購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；馬鈴薯葡萄糖（PDA）固體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，瓊脂8 g，溶于1 L去離子水，121 ℃滅菌20 min，參考張國華[8]所描述的配方配制。

試驗(yàn)儀器：LRH-250A 生化培養(yǎng)箱，由韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)；HNTC-2027 恒溫培養(yǎng)振蕩器，由天津歐諾儀器股份有限公司生產(chǎn)；SBA-40E 生物傳感分析儀，由山東省科學(xué)院生物研究所生產(chǎn)；UV-6100 紫外可見分光光度計(jì)，由上海美譜達(dá)儀器有限公司生產(chǎn)；常規(guī)試劑及儀器由本實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種的活化

用無菌接種環(huán)從凍存管中取出植物乳桿菌、乳酸片球菌和凝結(jié)芽孢桿菌，分別于MRS 固體斜面上劃線，置35 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至出現(xiàn)菌落，如此活化2次后挑取單菌落接于MRS液體培養(yǎng)基中35 ℃，120 r/min培養(yǎng)過夜，備用。

1.2.2 生長曲線、pH 值以及發(fā)酵液葡萄糖殘留量（RG）的測定

分別將活化好的植物乳桿菌、乳酸片球菌、凝結(jié)芽孢桿菌和三種菌株以O(shè)D600nm值1:1:1 比例的混合菌按10%（v:v）接種量接于MRS 液體培養(yǎng)基中，35 ℃，120 r/min 培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)期間定時(shí)取樣測定菌液的OD600nm吸光度、pH 值和RG 值，繪制各菌株生長曲線、pH 變化曲線和RG 變化曲線，以觀察各菌種單獨(dú)培養(yǎng)及混合培養(yǎng)的生長變化，每組試驗(yàn)3 個(gè)重復(fù)。

1.2.3 菌種的平板計(jì)數(shù)

將上述活化后的植物乳桿菌、乳酸片球菌、凝結(jié)芽孢桿菌及混合培養(yǎng)的菌液用0.85%(w:v)的無菌PBS緩沖液分別稀釋至10-7、10-8、10-9、10-10后進(jìn)行涂布，35 ℃培養(yǎng)過夜，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，每組試驗(yàn)3個(gè)重復(fù)。

1.2.4 抑菌試驗(yàn)

1.2.4.1 黃曲霉孢子懸液的制備及指示菌濃度的確定

將黃曲霉接種在PDA 平面培養(yǎng)基上，在30 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 d后，加入一定量的無菌PBS 緩沖液刮取斜面上的孢子，將黃曲霉菌孢子洗下，收集到離心管中，用無菌的PBS 緩沖液洗滌3 次后，再用無菌紗布過濾3 次除去黃曲霉菌孢子的菌絲，進(jìn)行血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。將孢子懸液濃度調(diào)整為103、104、105、106、107孢子/ml，涂布到PDA平板上30 ℃培養(yǎng)[9]。

1.2.4.2 發(fā)酵上清濃縮液的制備

將上述活化后的植物乳桿菌、乳酸片球菌、凝結(jié)芽孢桿菌及混合培養(yǎng)的菌種接種到MRS液體培養(yǎng)基中35 ℃、120 r/min培養(yǎng)24 h后測定pH值，在4 ℃、10 000 r/min下離心15 min，取上清液，用酸度計(jì)測量其pH值，然后將上清液旋蒸濃縮10倍，待用。

1.2.4.3 抑菌活性的測定

抑菌實(shí)驗(yàn)采用瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行測定，取指示菌孢子懸液100 μl（每個(gè)平板約含106個(gè)孢子）與經(jīng)融化后保持在45 ℃左右的PDA半固體培養(yǎng)基混勻后倒入平板上，凝固后用內(nèi)徑8 mm打孔器打孔，分別將100 μl植物乳桿菌、乳酸片球菌、凝結(jié)芽孢桿菌及混合培養(yǎng)的上清濃縮液注入孔中，于4 ℃水平放置預(yù)擴(kuò)散24 h后30 ℃培養(yǎng)12 h 測量其抑菌圈直徑，每組試驗(yàn)3 個(gè)重復(fù)[10-11]。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)分析和圖表制作分別由IBM SPSS statistic 20.0 和Microsoft Excel 2010 完成，數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果

2.1 菌種的生長曲線

圖1 植物乳桿菌、乳酸片球菌、凝結(jié)芽孢桿菌及混合培養(yǎng)的生長曲線

圖1 可見，從植物乳桿菌的生長曲線圖可以看出，在2 h 左右的遲緩期后開始進(jìn)入對數(shù)生長期，在22 h時(shí)達(dá)到最大OD600nm值3.482±0.003；起始pH值為5.40 在2 h 后迅速下降，在22 h 時(shí)達(dá)到最低值4.16±0.021；從發(fā)酵液葡萄糖殘留量的變化曲線可以看出，以每2 h接近1.0 g/l 的下降趨勢下降，22 h時(shí)RG值最低，為7.58±0.144，與起始發(fā)酵液RG 值相比下降了8.25 g/l。

從乳酸片球菌的生長曲線圖可以看出，在2 h 左右的遲緩期后開始進(jìn)入對數(shù)生長期，在20 h時(shí)達(dá)到最大OD600nm值4.686±0.006；其pH 值從起始5.37 經(jīng)過22 h下降到最低值4.21；與植物乳桿菌不同的是乳酸片球菌發(fā)酵液的RG 值要更低，24 h 時(shí)分別為7.58±0.144、4.42±0.144(P＜0.05)；與植物乳桿菌相比，乳酸片球菌的OD600nm值更高，24 h 分別為3.482±0.003、4.532±0.002(P＜0.05)。

與以上兩種菌株不同的是，凝結(jié)芽孢桿菌在6 h左右才開始進(jìn)入對數(shù)生長期，而且對數(shù)期較短，12 h左右其OD600nm值達(dá)到最大值4.361±0.011；其pH 值在14 h時(shí)開始達(dá)到最低值4.26±0.025，從12～24 h之間，其pH 值變化不大，接近平穩(wěn)；其發(fā)酵液的RG 值在22 h 時(shí)最低7.00±0.250，介于植物乳桿菌與乳酸片球菌之間（P＜0.05）。

三種菌以O(shè)D600nm值1:1:1 接種的混合培養(yǎng)液，在2 h 左右進(jìn)入對數(shù)生長期，2～8 h 之間OD600nm值變化較快，8～20 h 之間有段緩慢的增長期，20 h達(dá)到最大值3.741±0.003；同樣其發(fā)酵液的pH 值變化也有兩段變化，在22～24 h 時(shí)達(dá)到最低為4.24±0.006；其發(fā)酵液RG 值在24 h 時(shí)最低7.67±0.289，6～8 h 和14～18 h 兩段時(shí)間，RG 值有兩個(gè)明顯變化(P＜0.05)。

2.2 菌種的活菌計(jì)數(shù)

表1 菌種發(fā)酵活菌測定結(jié)果(lg cfu/g)

由表1 可知同行數(shù)據(jù)，植物乳桿菌培養(yǎng)液在4～24 h 期間各時(shí)間點(diǎn)活菌數(shù)差異顯著(P＜0.05)，說明4～16 h 處于對數(shù)生長期，16～24 h 處于衰退期；乳酸片球菌培養(yǎng)液4～16 h 處于對數(shù)生長期，各時(shí)間點(diǎn)活菌數(shù)差異顯著(P＜0.05)，16～24 h 處于穩(wěn)定期，各時(shí)間點(diǎn)活菌數(shù)差異不顯著(P＞0.05)；凝結(jié)芽孢桿菌培養(yǎng)液在4～24 h 期間各時(shí)間點(diǎn)活菌數(shù)差異顯著(P＜0.05)，4～10 h 處于對數(shù)生長期，10～24 h 處于衰退期；混合培養(yǎng)液在4～24 h 期間各時(shí)間點(diǎn)活菌數(shù)差異顯著(P＜0.05)，說明4～16 h 處于對數(shù)生長期，16～24 h 處于衰退期。

由表1 同列數(shù)據(jù)可見，只有三組數(shù)據(jù)12 h 乳酸片球菌與混合培養(yǎng)液、16 h 乳酸片球菌和凝結(jié)芽孢桿菌培養(yǎng)液無顯著性差異外(P＞0.05)，同一時(shí)間其他不同菌種之間的培養(yǎng)液活菌數(shù)之間均是顯著性差異(P＜0.05)。在三種菌及其混合培養(yǎng)24 h 過程中，植物乳桿菌、乳酸片球菌、凝結(jié)芽孢桿菌及其混合培養(yǎng)液分別在16、16、12、16 h 左右活菌數(shù)達(dá)到最大值。

2.3 指示菌黃曲霉孢子懸液濃度的確定

圖2 為不同濃度的黃曲霉孢子懸液生長48 h 后的對比圖，孢子懸液濃度為103孢子/ml 和104孢子/ml的平板，黃曲霉生長時(shí)間需5～7 d，實(shí)驗(yàn)周期過長。孢子懸液濃度為107孢子/ml 的平板，因孢子濃度過高，黃曲霉菌絲生長及孢子萌發(fā)過快，不易觀察抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在105孢子/ml 和106孢子/ml 中進(jìn)行選擇，從生長狀況及易于觀察方面考慮，故均以106孢子/ml濃度的菌懸液進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。

2.4 菌種發(fā)酵上清濃縮液的抑菌直徑

圖3 是三種菌及其混合培養(yǎng)的上清濃縮液的抑制黃曲霉效果圖。從表2 可以看出，以濃度為106孢子/ml 黃曲霉為指示菌的六組數(shù)據(jù)，其中植物乳桿菌和乳酸片球菌的抑菌直徑最大（P＜0.05）。

圖2 不同濃度黃曲霉孢子生長對比（48 h）

表2 菌種發(fā)酵后上清濃縮液抑菌圈直徑的測定結(jié)果

3 討論

乳酸菌是人和動(dòng)物腸道內(nèi)主要的益生菌，當(dāng)機(jī)體攝入乳酸菌等益生菌后，能在腸道內(nèi)迅速成為優(yōu)勢菌群，抑制其他有害微生物的繁殖，增加乳酸含量，降低腸道pH值，并且提高飼料適口性[12]。

黃曲霉菌是發(fā)霉變質(zhì)飼料中最常見的一種真菌，其代謝產(chǎn)物具有很強(qiáng)的致病性和致癌性。有研究表明，部分乳酸菌對黃曲霉菌的生長和產(chǎn)毒具有抑制作用，徐進(jìn)等[13]在研究中發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌可顯著抑制黃曲霉生長與產(chǎn)毒。鄭瑋麗等[14]在研究中發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌和副干酪乳桿菌對發(fā)酵乳產(chǎn)品壞包中的酵母菌、霉菌有不同程度抑制作用。而國內(nèi)關(guān)于植物乳桿菌、乳酸片球菌和凝結(jié)芽孢桿菌及三種菌混合培養(yǎng)物對黃曲霉生長抑制鮮為報(bào)道。

Choi等[15]在研究中發(fā)現(xiàn)15 ℃條件下，泡菜發(fā)酵前期起主導(dǎo)作用的是檸檬明串珠菌，發(fā)酵后期清酒乳桿菌等乳桿菌開始發(fā)揮作用。張冬梅等[16]研究發(fā)現(xiàn)泡菜發(fā)酵前期腸膜明串珠菌占優(yōu)勢，發(fā)酵后期戊糖乳桿菌成為優(yōu)勢菌。本研究結(jié)合植物乳桿菌、乳酸片球菌、凝結(jié)芽孢桿菌單獨(dú)培養(yǎng)及混合培養(yǎng)液的生長曲線、pH 值、RG 值、活菌計(jì)數(shù)及對黃曲霉的抑菌直徑，混合培養(yǎng)液的OD600nm值、pH 值、RG 值及活菌數(shù)最大值在發(fā)酵過程中均介于三種菌之間，其24 h 發(fā)酵后上清濃縮液的抑菌直徑介于三者之間，且混合培養(yǎng)的對數(shù)生長期明顯變長，推測三種菌在混合培養(yǎng)過程中菌種生長可能會(huì)有先后順序，其原因有待進(jìn)一步研究。

Lavermicocca P[17-18]分離獲得一株植物乳桿菌21B（L.plantarum 21B），將其發(fā)酵上清液濃縮10倍后進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明該菌能抑制黃曲霉FTDC3226 在內(nèi)的十幾種真菌的生長，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

4 結(jié)論

在抑菌試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)乳酸片球菌、植物乳桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌及其混合培養(yǎng)的上清濃縮液均對黃曲霉的生長有抑制作用；乳酸片球菌、植物乳桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌及其三者混合培養(yǎng)的上清濃縮液的抑菌直徑分 別 為(15.860±0.050) mm、(15.737±0.155) mm、(14.287±0.096) mm和(15.173±0.032) mm；其中植物乳桿菌和乳酸片球菌的抑菌直徑最大（P＜0.05）。