梁 毅，寧思思，陳 曉

(廣西壯族自治區(qū)玉林市婦幼保健院檢驗科，廣西玉林 537000)

地中海貧血是一組由于珠蛋白基因的缺陷導致珠蛋白合成障礙所引起的常染色體隱性遺傳性溶血性疾病，其臨床表型可從無癥狀到致命的溶血性貧血[1]。中國南方為地中海貧血高發(fā)地區(qū)，特別是廣西當地人群地中海貧血基因攜帶率高達24.5%[2]。按照存在缺陷的珠蛋白基因的種類，地中海貧血一般可以分為α-、β-、δβ-和εγδβ-地中海貧血等類型，其中α-和β-地中海貧血最為常見[3]。目前該病尚無有效的治療方法，只能通過對婚檢、孕檢夫婦以及胎兒進行準確的地中海貧血基因診斷或產前診斷，來杜絕中、重型患兒的出生，從而降低出生缺陷的概率[2]。地中海貧血基因突變一般分為點突變及缺失突變。目前國內地中海貧血基因診斷的常規(guī)檢測范圍為常見的3種缺失型α-地中海貧血、3種點突變型α-地中海貧血和17種點突變型β-地中海貧血，涵蓋了中國人群中95%以上的α-和β-地中海貧血致病基因缺陷，但仍有5%罕見或未知突變未能進行檢測[4]。在研究及臨床工作中會發(fā)現一些基因型與表型不符或者與遺傳規(guī)律不符的結果，提示該基因型可能是罕見或未知的，如不做進一步檢測，則有可能出現誤檢、漏檢等情況，嚴重時可能會導致重型地中海貧血患兒的出生。本文通過回顧性分析1例罕見重型β-地中海貧血的診斷及基因檢測過程，探討罕見地中海貧血的產前診斷策略。

1 資料與方法

1.1一般資料 孕婦39歲，其丈夫，46歲，夫婦雙方均為廣西籍人。夫婦在縣級醫(yī)院檢查時發(fā)現雙方的血液學表型均為紅細胞平均體積(MCV)、紅細胞平均血紅蛋白含量(MCH)降低，且夫婦雙方的血紅蛋白電泳分析結果顯示血紅蛋白A2(HbA2)升高。該結果提示為小細胞低色素性貧血，夫婦遂到本院進行進一步的地中海貧血相關的檢查。孕婦常規(guī)地中海貧血基因診斷結果為α-和β-地中海貧血均存在突變。其丈夫的基因結果也為α-和β-地中海貧血均存在突變。夫婦同型β-地中海貧血，符合產前診斷指征。簽署產前診斷知情同意書后，孕婦于孕17+5周抽取羊水對胎兒進行產前地中海貧血基因檢測。

1.2標本采集 受檢孕婦及其丈夫分別用真空抗凝采血管采集外周靜脈血3管，每管約3 mL，分別用于血常規(guī)分析、血紅蛋白電泳分析和地中海貧血基因分析。胎兒羊水標本的采集是在超聲引導下，對受檢孕婦行羊膜腔穿刺術抽取羊水15 mL左右，并分裝到2個15 mL的無菌離心管中，每管6～8 mL，其中1管直接進行地中海貧血基因檢測，另1管則經過細胞培養(yǎng)后利用羊水貼壁細胞再進行基因檢測。

1.3血液學一般檢查 采用全自動血液分析儀(購自日本Sysmex公司，型號XE-5000)對受檢孕婦及其丈夫的靜脈血進行常規(guī)檢測；采用全自動高壓毛細管電泳儀(購自法國Sebia公司，型號Capillarys 2 Flex Piercing)按照儀器和配套試劑的操作說明書對血紅蛋白電泳和定量進行檢測、分析。

1.4標本DNA提取 上述所采集的標本均使用全血DNA(溶液型)核酸提取試劑盒(購自中國深圳亞能生物技術有限公司)進行基因組DNA提??；用核酸蛋白檢測儀檢測提取得到的DNA樣本的濃度及純度。要求提取的DNA樣本濃度≥20 ng/μL且純度A260/280=1.7～1.9。

1.5常見地中海貧血基因檢測 目前常見的3種缺失型α-地中海貧血為-SEA、-α3.7、-α4.2，常用多重跨越斷裂點聚合酶鏈式反應(Gap-PCR)方法來檢測。常見的3種點突變型α-地中海貧血(CS、QS、WS)和17種點突變型β-地中海貧血CD41-42、CD43、IVS-Ⅱ-654、-28、-29、-32、CD71-72、βE、CD17、CD31、CD14-15、CD27-28、IVS-Ⅰ-1、IVS-Ⅰ-5、CAP+1、Int、-30)一般使用聚合酶鏈式反應/反向點雜交法(RDB-PCR)來檢測[1,4]。采用相應類型的地中海貧血基因檢測試劑盒(購自中國深圳亞能生物技術有限公司)進行常見地中海貧血的檢測，具體步驟按照試劑盒說明書進行。

1.6β-珠蛋白基因序列檢測 吸取受檢孕婦及其丈夫的靜脈血1 mL分別置于1.5 mL的小型離心管中，將培養(yǎng)好的部分胎兒羊水貼壁細胞也置于1.5 mL的小型離心管中，做好標記和說明，然后寄送到中國深圳亞能生物技術有限公司進行β-珠蛋白基因序列的測序。

2 結 果

2.1血液學檢測結果 受檢孕婦及其丈夫的血常規(guī)和血紅蛋白電泳結果顯示，孕婦及其丈夫的MCV和MCH均減低，提示二者均可能有小細胞低色素性貧血。孕婦及其丈夫的血紅蛋白電泳結果顯示HbA2和HbF均升高。綜合分析二者的血液學結果，判斷為地中海貧血初篩陽性。見表1。

表1 受檢孕婦及其丈夫血液學檢查結果

表2 受檢孕婦、其丈夫及胎兒的地中海貧血基因檢查結果

2.2常見地中海貧血基因的檢測結果 常見地中海貧血基因檢查結果表明，受檢孕婦發(fā)現基因型為-α4.2/αα、41-42M/βN，同時攜帶有α-和β-地中海貧血。其丈夫地中海貧血基因檢測結果為-α3.7/αα、-28M/βN，也是同時攜帶有α-和β-地中海貧血。胎兒發(fā)現基因型為αα/αα、41-42M/41-42M，從結果可以看出α-地中海貧血基因檢測無異常，存在β-地中海貧血，但是β-地中海貧血的基因型不符合遺傳學規(guī)律。為了保證結果的準確性，對上述三者的地中海貧血基因檢測了進行復查，復查結果與第1次結果一致。受檢孕婦否認非親子可能。為了尋找β-地中海貧血的基因型不符合遺傳學規(guī)律的原因，遂對三者的β-珠蛋白基因進行了測序。見表2、圖1。

注：A表示正常對照；B表示受檢孕婦；C表示孕婦的丈夫；D表示胎兒(羊水)
圖1 β-地中海貧血RDB-PCR結果

2.3β-珠蛋白基因序列的檢測結果 測序結果顯示，孕婦的β-珠蛋白基因存在CD41-42(-TTCT)突變雜合子，與常見地中海貧血基因檢測結果一致。其丈夫的β-珠蛋白基因測序結果除了檢測到常見地中海貧血基因所檢測到的-28(A->G突變外，還發(fā)現了罕見的CD43(GAG→AAG)突變見。胎兒(羊水)的測序結果為同時存在CD41-42(-TTCT)突變和罕見的CD43(GAG→AAG)突變。胎兒的β-珠蛋白基因測序結果符合遺傳學規(guī)律。見圖2。

注：A結果表示受檢孕婦；B、C結果表示孕婦的丈夫；D、E結果表示胎兒(羊水)；箭頭所指位點為突變位點
圖2 β-珠蛋白基因測序結果

3 討 論

地中海貧血是世界上最常見的血紅蛋白病之一，其分子基礎較為復雜且突變類型繁多[3]。目前世界上α-珠蛋白基因突變多達300多種，中國人群中發(fā)現約22種，β-地中海貧血突變多達200多種，中國人群中已報道的約46種[5-6]。目前，常規(guī)的地中海貧血基因檢測只涵蓋了常見的3種缺失型和3種點突變型α-地中海貧血以及17種點突變型β-地中海貧血，無法檢測該范圍外的較為罕見或未知的地中海貧血類型。宋春林等[7]研究發(fā)現，用二代高通量測序方法檢測1 368例標本，共發(fā)現523例陽性結果，比常規(guī)方法多發(fā)現了25例，檢出率提高了4.81%。由此可見罕見及未知類型地中海貧血在地中海貧血中占有一定的比例，如不做進一步檢測，則容易出現漏診、誤診，從而延誤產前診斷，更嚴重的會導致重型地中海貧血患兒的出生。

在本研究中，前期發(fā)現受檢孕婦及其丈夫的血常規(guī)檢查結果均顯示為地中海貧血初篩，經遺傳咨詢后雙方進行了地中海貧血基因檢測。常見地中海貧血基因檢測結果顯示夫婦雙方均為地中海貧血攜帶者，且兩人有同型β-地中海貧血，符合產前診斷指征，因此抽取胎兒羊水進行常見地中海貧血基因產前診斷。單從結果分析，胎兒基因型為αα/αα、41-42M/41-42M，為β-地中海貧血純合子突變，屬于重型地中海貧血。但結合孕婦及其丈夫的地中海貧血基因型分析后發(fā)現，胎兒的基因型不符合遺傳學規(guī)律。為了尋找導致這一現象的發(fā)生原因，筆者首先對所有檢測結果進行了復查，復查基因型與第1次基因型一致，排除做錯標本的可能性。經詢問后，受檢孕婦否認非親子可能。最后考慮是否為罕見地中海貧血影響了檢測。對三者的β-珠蛋白基因進行了測序，結果發(fā)現，孕婦的丈夫為β-珠蛋白基因-28突變合并罕見的CD43(GAG→AAG)突變的雙重雜合子，胎兒遺傳了來自母親的β-珠蛋白基因41-42突變及父親的CD43(GAG→AAG)突變，也是雙重雜合子，結果符合遺傳學規(guī)律。β-珠蛋白基因CD43(GAG→AAG)突變是1種極為罕見的異常血紅蛋白突變，目前關于該突變的報道還比較少。2008年HOYER等[8]報道了在白種人群中發(fā)現了這一突變。直到2010年，莫桂玲等[9]在中國人群中首次發(fā)現了這種突變，ZHAO等[10]在2017年也在中國人群中檢測到了該突變。這種突變是導致常規(guī)檢測所得結果不符合遺傳學規(guī)律重要原因，因為該突變剛好在β膜條上41-42N探針所覆蓋的范圍附近，導致41-42N探針雜交不上去，最終導致β膜產品41-42N位點不顯色，結果判讀時便被判讀為41-42M/41-42M純合子。由此可見，有些罕見地中海貧血的存在可能會影響到常規(guī)地中海貧血基因檢測的結果，從而影響檢測的準確性，導致誤診。這也提示在進行胎兒地中海貧血基因產前診斷時，需結合其父母的地中海貧血基因結果聯合判斷。同時也提示當常規(guī)基因檢測結果與臨床表型不吻合時，應考慮該結果是否含有罕見或未知的地中海貧血類型，當與遺傳規(guī)律不符的結果時，也應考慮該結果是否含有罕見或未知的地中海貧血類型。

綜上所述，建議地中海貧血產前診斷的診斷策略：首先應嚴格按照地中海貧血篩查到診斷的步驟對可疑的夫婦進行檢查，胎兒的地中海貧血基因檢查結果應結合其父母的基因結果綜合分析。特別是存在父母一方存在檢測結果與臨床表型不吻合的情況或胎兒結果不符合遺傳學規(guī)律時，需應用基因測序等方法進一步檢測，聯合應用多種方法進行確診，避免漏診、誤診，從而避免重型地中海貧血患兒的出生。這對減緩社會壓力和實現優(yōu)生優(yōu)育具有重要的意義。