謝潤桂，何 怡，魏順娣，張曉燕

(東莞市婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心，廣東東莞 523107)

胎兒染色體非整倍體的無創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測(NIPT)是利用大規(guī)模平行測序技術(shù)對母體外周血中的胎兒游離DNA片段(包含胎兒游離DNA)進(jìn)行深度測序，并將結(jié)果進(jìn)行生物信息分享，可以從中獲得胎兒的遺傳信息[1]。目前NIPT已廣泛用于產(chǎn)前篩查，13-三體、18-三體和21-三體靈敏度和特異度[2]的檢測，但是，同任何篩查方法一樣，假陽性和假陰性時(shí)常發(fā)生。通過臨床實(shí)踐與案例研究發(fā)現(xiàn)NIPT結(jié)果與實(shí)際胎兒核型之間存在差異，其發(fā)生率在0.1%～0.3%。該現(xiàn)象的生物學(xué)原因主要包括限制性胎盤嵌合、雙胎一胎凋亡、母親染色體異常、DNA拷貝數(shù)異常、母血中胎兒DNA含量低以及母親罹患腫瘤等因素[3-5]。本文通過分析在東莞市婦幼保健院NIPT檢測發(fā)現(xiàn)的86例NIPT假陽性病例，在胎兒分娩后留取的胎盤組織及母親外周血標(biāo)本，采用高通量測序方法進(jìn)行驗(yàn)證，探討NIPT產(chǎn)生假陽性的原因，以及相應(yīng)的預(yù)防措施。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2016年10月至2018年7月在東莞市婦幼保健院檢測出現(xiàn)的NIPT陽性而羊水穿刺核型分析和CMA檢測驗(yàn)證胎兒染色體正常的假陽性病例86例。在胎兒分娩后留取的胎盤組織及母親外周血標(biāo)本，采用高通量測序方法進(jìn)行驗(yàn)證。本研究經(jīng)東莞市婦幼保健院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有孕婦簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1樣本采集方法 樣本采集與孕婦分娩后，采集孕婦靜脈血7～10 mL，使用Cell-Free DNA BCT 管，采血后顛倒混勻8～10次，24 h后進(jìn)行血漿分離。同時(shí)進(jìn)行胎盤組織采樣，每個(gè)胎盤選6個(gè)采樣點(diǎn)，在胎盤的胎兒面和母體面分別間隔一定位置表層獲取3個(gè)黃豆大小(長：0.5～1.0 cm,寬：0.5～1.0 cm，深：0.2～0.3 cm)的胎盤組織，用少量生理鹽水洗凈母血，分別按標(biāo)注置于對應(yīng)的2 mL無菌小型離心管中，最后將標(biāo)本以-20 ℃儲(chǔ)存于實(shí)驗(yàn)室。

1.2.2高通量測序檢測 基因組DNA提取、測序文庫構(gòu)建和質(zhì)量控制，用試劑盒提取基因組DNA，測定基因組DNA濃度，然后在-20 ℃保存。根據(jù)晶芯胎兒染色體非整倍體T21、T18、T13檢測試劑盒的說明進(jìn)行文庫構(gòu)建、質(zhì)量控制和匯集。使用半導(dǎo)體測序儀用于DNA測序。測序讀數(shù)被過濾并與人類參考基因組(HG19)比對。

1.2.3NIPT假陽性評估方法 NIPT檢測提示染色體異常，而胎兒染色體與羊水核型分析和CMA正常，則判定為NIPT假陽性。本研究采用高通量測序法在胎兒出生后同時(shí)檢測胎盤和母親外周血中的染色體異常情況，將檢測結(jié)果與孕期檢測的NIPT結(jié)果對比，如果NIPT結(jié)果與胎盤測定結(jié)果一致，則判定NIPT假陽性來源于胎盤細(xì)胞；如果NIPT結(jié)果與母血測定結(jié)果一致，則判定NIPT假陽性來源于母體細(xì)胞。如果兩者檢測結(jié)果正常，無法判定NIPT假陽性的來源，判定為未知來源。

2 結(jié) 果

經(jīng)高通量測序法檢測驗(yàn)證，在86例NIPT假陽性標(biāo)本中64例胎盤檢測結(jié)果與NIPT相符，母血結(jié)果正常，占74.4%，其中檢測結(jié)果為性染色異常9例，常染色體異常55例；12例母血檢測結(jié)果與NIPT結(jié)果相符，胎盤結(jié)果正常，占14.0%，其中檢測結(jié)果為性染色異常10例，常染色體異常2例；10例胎盤與母血結(jié)果均正常，NIPT假陽性來源不明，占11.6%。在64例胎盤來源假陽性病例中有47例為限制性胎盤嵌合，占73.4%。NIPT檢測提示常染色體異常的63例中2例證實(shí)假陽性來源于母血，占3.2%，而性染色體異常23病例中10例假陽性病例來源于母血，占43.5%。見表1。

表1 86例NIPT假陽性原因驗(yàn)證結(jié)果

3 討 論

孕婦外周血胎兒游離DNA(cffDNA)的NIPT是應(yīng)用高通量基因測序等分子遺傳技術(shù)檢測孕期母體外周血中胎兒游離DNA片段，以評估胎兒常見染色體非整倍體異常風(fēng)險(xiǎn)[6]。母體外周血中cffDNA片段的濃度非常低(3%～6%)[7]。cffDNA具有獨(dú)特的生理性質(zhì)：(1)孕婦血漿中的cffDNA隨著孕周的增加而增加[8]；(2)cffDNA均有小片段形式存在，片段長度大都小于300 bp；(3)清除速度快，cffDNA的半衰期為16.3 min，胎盤娩出后的2 h內(nèi)快速消除[9]。NIPT檢測母親外周血中的片段長度為75～250 bp的cffDNA,并將游離DNA數(shù)量定位到染色體相應(yīng)的位置上，從而得到染色體不同位置DNA數(shù)量的比例關(guān)系，從而推斷染色體是否存在缺失、重復(fù)或數(shù)目異常。NIPT結(jié)果陽性代表胎兒母親外周血中的各種cffDNA的比例關(guān)系不正常，可能是與母親血液系統(tǒng)相連通胎兒滋養(yǎng)層的異常核型細(xì)胞引起,也能是由母親異常核型細(xì)胞本身引起，也可能有一部分來源于通過輸血、免疫治療、器官移植等形式輸入體內(nèi)的外來異常核型細(xì)胞導(dǎo)致。母體外周血中cffDNA的來源以及含量變化等生物因素，都會(huì)影響NIPT檢測準(zhǔn)確性，表現(xiàn)為NIPT結(jié)果、染色體核型分析及CMA結(jié)果三者之間存在不一致情況[10-11]。

NIPT檢測的cffDNA絕大部分來源于胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞，胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞與胎兒都是由同一個(gè)合子發(fā)育而來，將發(fā)育為胎盤，合子形成后，一部分細(xì)胞發(fā)育成胎盤的細(xì)胞系，一部分細(xì)胞發(fā)育成胎兒的細(xì)胞系。正常情況，兩者的遺傳物質(zhì)是相同的。如果胎盤細(xì)胞系的部分細(xì)胞出現(xiàn)有絲分裂錯(cuò)誤，那么將會(huì)出現(xiàn)限制性胎盤嵌合體，即胎盤出現(xiàn)正常與異常的染色體嵌合體，而胎兒核型正常[12]。這種情況胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞釋放cffDNA的分子劑量會(huì)異常，同時(shí)引起孕婦血漿中cffDNA的分子劑量異常，NIPT檢測結(jié)果顯示為陽性，而胎兒染色體是正常的，即出現(xiàn)假陽性結(jié)果。本研究發(fā)現(xiàn)NIPT假陽性大部分來源于胎盤，占74.4%，其中大部分的胎盤來源假陽性病例驗(yàn)證結(jié)果提示限制性胎盤嵌合體。因此胎盤來源的異常染色體是導(dǎo)致NIPT假陽性的主要原因。

母體血漿DNA大部分來源于母體基因組，cffDNA約占10%～20%[13]。雖然在高通量測序前，經(jīng)過分離和純化去除了部分的母體基因組DNA，但是如果母血中存在異常DNA，仍會(huì)影響cffDNA的測定，出現(xiàn)假陽性結(jié)果。性染色體異常在母血中最常見，其中性染色體嵌合是最常見的母體染色體嵌合異常，其發(fā)生率1/400[14]。由于女性擁有兩條X染色體，而且存在劑量補(bǔ)償和“選擇性失活”現(xiàn)象，女性的X染色體異常通常不會(huì)引起嚴(yán)重表型，其中X三體、嵌合型的X單體或X染色體的結(jié)構(gòu)異常女性一般都有生育能力[15]。而對于常染色體異常，數(shù)目異常者除21-三體外通常不能存活，也沒有生育能力，只有小片段的缺失或者重復(fù)攜帶者才能存活和生育，因此性染色體異常在母體中最常見，性染色體異常攜帶者比例高是導(dǎo)致母血來源的NIPT假陽性的主要原因。本研究中12例母體來源假陽性有10例是X染色體異常，說明X染色體異常在孕婦中攜帶率最高。所以NIPT檢測時(shí)如果性染色體異常，很可能來源于母血，應(yīng)同時(shí)對母體白細(xì)胞進(jìn)行染色體檢測，以排除母體來源的可能，將會(huì)提高NIPT對性染色體檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，避免病人妊娠期間不必要的緊張和壓力。

本研究還有10例假陽性病例同時(shí)檢測了胎盤組織和母血均正常，NIPT假陽性來源不明。NIPT檢測一般在孕早中期距離分娩有6、7個(gè)月時(shí)間，引起NIPT假陽性的異常cffDNA可能已經(jīng)消失了，因此，本方法無法找到引起NIPT假陽性原因。對游離DNA劑量變化的來源檢測還需要進(jìn)一步提高現(xiàn)有檢測技術(shù)。

高通量測序法驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)胎盤和母血中異常游離DNA釋放入母血是NIPT假陽性的主要原因。對NIPT結(jié)果為性染色體異常病例，應(yīng)排除性染色體異常源自母血的可能性。NIPT能夠準(zhǔn)確檢測母血總游離DNA的劑量變化，但無法分辨游離DNA劑量變化的來源。