徐新民，宓連芳，徐 飛，張 燕，方 茜，李瑞紅，李 敏，王慧珠，王雅杰

AIDS是由HIV感染引起的一種嚴(yán)重傳染性疾病。新型隱球菌感染是AIDS患者最常見的機(jī)會(huì)性感染之一。該菌主要以出芽的方式進(jìn)行生殖，可通過呼吸道傳播而感染免疫缺陷人群[1]。其可感染腦膜和腦實(shí)質(zhì)進(jìn)而導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的一種真菌感染[2]?，F(xiàn)對我院74例AIDS合并新型隱球菌感染患者的臨床表現(xiàn)以及新型隱球菌的藥物敏感（藥敏）試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，為臨床該類患者的早期診斷及合理用藥提供科學(xué)依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 對象 本研究收集了74例2009年1月—2018年6月于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院就診的AIDS合并新型隱球菌感染患者作為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①HIV抗體陽性；②病原學(xué)檢查提示腦脊液涂片或墨汁染色找到隱球菌或培養(yǎng)見到隱球菌生長；③亞急性或慢性起病，患者頭痛，伴有低熱、惡心、嘔吐和腦膜刺激征表現(xiàn)；④影像學(xué)發(fā)現(xiàn)有腦膜增強(qiáng)反應(yīng)和腦實(shí)質(zhì)內(nèi)的局限性炎癥病灶。至少包括前2項(xiàng)，即可入選。排除標(biāo)準(zhǔn)：僅臨床疑診，未找到病原學(xué)診斷依據(jù)者。

1.2 儀器和試劑 法國生物梅里埃公司的血瓊脂平板、沙保羅瓊脂培養(yǎng)基、API 20C AUX酵母菌鑒定試劑盒和ATB FUNGUS 3藥敏試劑條。

1.3 方法

1.3.1 臨床資料收集 收集并分析患者臨床表現(xiàn)，輔助性T細(xì)胞亞群中CD4+、CD8+T細(xì)胞計(jì)數(shù)和腦脊液檢測結(jié)果等資料。

1.3.2 分離和鑒定 對臨床送檢標(biāo)本嚴(yán)格按照全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程進(jìn)行操作。血液標(biāo)本按照血培養(yǎng)采集流程進(jìn)行，血培養(yǎng)瓶陽性報(bào)警后，轉(zhuǎn)種血平板和麥康凱平板；腦脊液標(biāo)本進(jìn)行3000×g，15 min離心后，取其沉淀接種血平板和巧克力平板；肺泡灌洗液標(biāo)本同樣也是3000×g，15 min離心，取其沉淀接種血平板、麥康凱平板和巧克力平板。培養(yǎng)后挑取可疑菌落進(jìn)行革蘭染色，鏡檢見到酵母樣真菌孢子后，挑取單個(gè)菌落接種于沙保羅瓊脂培養(yǎng)基，24 h后，菌種用API 20C AUX酵母菌鑒定試劑條進(jìn)一步鑒定。

1.3.3 藥敏試驗(yàn) 采用微量肉湯稀釋法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。將分離出的酵母樣真菌制備成2.0麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙?，取?0 μl加入到ATB F2培養(yǎng)液中，混勻后取135 μl加入ATB FUNGUNS 3藥敏試劑條中每個(gè)凹狀的藥敏孔中，置于35 ℃溫箱中，48 h判讀結(jié)果，判讀標(biāo)準(zhǔn)按照說明書進(jìn)行。所有藥敏結(jié)果根據(jù)CLSI M27-A3和ATB FUNGS 3建立的折點(diǎn)判讀，將受試菌分為敏感、中介或者耐藥。

1.4 質(zhì)量控制 質(zhì)控菌株為白色念珠菌 ATCC64500，由國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗(yàn)中心提供。

2 結(jié) 果

2.1 臨床表現(xiàn) 74例患者中，89.19%（66/74）為男性，年齡≤40歲者占60.81%（45/74），體質(zhì)量下降者占47.30%（35/74）。臨床表現(xiàn)中，頭痛占58.11%（43/74），發(fā)熱占51.35%（38/74），嘔吐占18.91%（14/74），咳嗽占13.51%（10/74）。見表1。

表1 74例AIDS合并新型隱球菌感染患者的臨床特點(diǎn)Table 1 Clinical features of 74 AIDS patients with Cryptococcal neoformans infection

2.2 菌株分離情況 74例患者中，從血液中分離出24株隱球菌，腦脊液中分離出44株隱球菌，肺泡灌洗液中分離出6株隱球菌，經(jīng)鑒定均為新型隱球菌。

2.3 腦脊液檢測及CD4+、CD8+T細(xì)胞計(jì)數(shù)等結(jié)果 74例患者中，68.91%（51/74）患者的腦脊液壓力偏高，81.08%的患者腦脊液WBC計(jì)數(shù)＞10×106細(xì)胞/L ；70.27%的患者腦脊液墨汁染色陽性（即見到新型隱球菌）；100%的患者血液或腦脊液新型隱球菌抗原陽性；93.24%（69/74）的患者CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)＜100細(xì)胞/μl，但CD8+T細(xì)胞計(jì)數(shù)≤500 細(xì)胞/μl的只有9例，占12.16%。見表2。

表2 AIDS合并新型隱球菌感染患者腦脊液檢測及CD4+、CD8+ T細(xì)胞計(jì)數(shù)情況Table 2 Results of cerebrospinal fluid test and CD4+,CD8+ T cell count in AIDS patients with Cryptococcal neoformans infection

2.4 預(yù)后、治療及轉(zhuǎn)歸情況 74例患者中合并梅毒者21例，合并丙型肝炎者4例，合并巨細(xì)胞病毒感染者8例。針對新型隱球菌感染，臨床使用的抗真菌藥物主要是兩性霉素B、5-氟胞嘧啶、氟康唑和伏立康唑，詳見表3。同時(shí)使用甘露醇、甘油果糖等藥物脫水降低顱內(nèi)壓，使用糖皮質(zhì)激素抑制炎癥反應(yīng)。經(jīng)上述治療后，93.24%（69/74）的患者好轉(zhuǎn)，3例放棄治療，2例死亡。

2.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 采用微量肉湯稀釋法對分離所得的60株新型隱球菌進(jìn)行藥敏分析。根據(jù)試劑盒說明書，只有5-氟胞嘧啶和氟康唑2種藥物有判讀標(biāo)準(zhǔn)，敏感率分別是91.67%和83.33%。同時(shí)，也分析了兩性霉素B、伊曲康唑和伏立康唑的藥敏結(jié)果。其最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration, MIC）值分布情況見表4。2例死亡的患者都采用了5-氟胞嘧啶聯(lián)合氟康唑治療，但體外藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示其中1株菌對5-氟胞嘧啶耐藥，對氟康唑中介，而1株菌對5-氟胞嘧啶中介，對氟康唑耐藥。

表3 不同治療方案及預(yù)后（%）Table 3 Different treatment regimens and prognosis(%)

表4 60株新型隱球菌對5種抗真菌藥的藥敏情況分析Table 4 Analysis of drug sensitivity of 60 Cryptococcal neoformans strains to 5 antifungal drugs

3 討 論

AIDS已成為威脅我國公眾健康的重要公共衛(wèi)生問題[3]，該類患者的細(xì)胞免疫功能缺陷，易發(fā)生各種機(jī)會(huì)性感染，新型隱球菌感染即是最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染[2]，可導(dǎo)致每年約100萬例HIV/AIDS患者發(fā)生隱球菌性腦膜炎，造成約62.5萬人死亡[4]。正常人群中隱球菌性腦膜炎的發(fā)病率為0.15%，而在AIDS患者中高達(dá)6.50%[5]。流行病學(xué)研究顯示，新型隱球菌感染呈全球分布，主要引起免疫缺陷患者感染，如HIV/AIDS患者和CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)少于50細(xì)胞/μl的患者[6-8]。

AIDS合并新型隱球菌感染在臨床表現(xiàn)、腦脊液常規(guī)及生化檢查方面與結(jié)核性腦膜炎有許多相似處，臨床應(yīng)予以鑒別[9]。新型隱球菌感染的診斷除了通過臨床表現(xiàn)、常用的檢查方法（如腦脊液常規(guī)、生化等）判斷外，還可借助隱球菌莢膜多糖抗原檢測、腦脊液涂片、培養(yǎng)、墨汁染色和影像學(xué)檢查等進(jìn)行診斷。本研究結(jié)果表明，AIDS合并新型隱球菌感染患者的腦脊液壓力明顯增高，一般為200～400 mmH2O。以往研究顯示顱內(nèi)高壓是AIDS合并新型隱球菌性腦膜炎患者預(yù)后不良的重要指標(biāo)，腦脊液蛋白輕度增高，糖減低，氯一般變化不大[10-11]，這與本研究結(jié)果相似。本研究74例患者中，合并梅毒感染的有21例，占28.37%，可能是HIV破壞了機(jī)體的免疫系統(tǒng)，增加了機(jī)體感染其他病原體的機(jī)會(huì)。在臨床表現(xiàn)方面約有50%以上的患者有發(fā)熱和頭痛的癥狀，也有些患者存在嘔吐、咳嗽、乏力、納差、意識(shí)恍惚等癥狀，其原因可能是新型隱球菌主要經(jīng)呼吸道傳播，并且易侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)，可感染腦膜和腦實(shí)質(zhì)進(jìn)而導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染，患者在不同感染階段出現(xiàn)了不同的臨床表現(xiàn)。

本研究中，所檢測的60株新型隱球菌體外對5-氟胞嘧啶和氟康唑2種藥物的敏感率分別是91.67%和83.33%。有2株菌株對5-氟胞嘧啶耐藥，3株菌株對氟康唑耐藥。有研究顯示，在體外藥敏試驗(yàn)中新型隱球菌對兩性霉素B的MIC值較低[12]，本研究中90.00%（54/60）的菌株對兩性霉素B的MIC值≤0.5，說明其對兩性霉素B敏感性較好，與以上研究結(jié)果一致。唑類抗真菌藥物主要用于鞏固維持階段的治療，其中氟康唑?yàn)榫S持治療的首選藥物，但本研究中，60株中有3株新型隱球菌對氟康唑耐藥，1例患者因此死亡，說明臨床用藥前非常有必要進(jìn)行體外藥敏試驗(yàn)。

AIDS合并新型隱球菌感染的用藥治療方面，一般分誘導(dǎo)期、鞏固期及維持治療期3個(gè)治療階段。2010年我國發(fā)布了《隱球菌感染診治專家共識(shí)》[13]，對HIV感染合并中樞神經(jīng)系統(tǒng)隱球菌感染者的初始治療采取兩性霉素B聯(lián)合5-氟胞嘧啶至少8周，使用氟康唑或伊曲康唑鞏固治療至少12周的方案。本研究中有11例患者初始治療采用了兩性霉素B聯(lián)合5-氟胞嘧啶，癥狀均有不同程度緩解，氟康唑因其較低的毒性常作為鞏固和維持期治療的首選用藥[13-14]。

有研究顯示，AIDS合并新型隱球菌感染患者接受兩性霉素B聯(lián)合5-氟胞嘧啶治療或兩性霉素B聯(lián)合氟康唑治療6周時(shí)的臨床療效無明顯差異，并且前者易出現(xiàn)骨髓抑制的不良反應(yīng)[15]，而本研究中11例兩性霉素B聯(lián)合5-氟胞嘧啶治療的患者中，沒有發(fā)現(xiàn)該不良反應(yīng)。

本研究的74例患者中采用了6種治療方案，其中5-氟胞嘧啶聯(lián)合氟康唑和兩性霉素B，5-氟胞嘧啶聯(lián)合氟康唑2種治療方案占的比例較大，分別是25例（33.78%）和24例（32.43%），但采用5-氟胞嘧啶聯(lián)合氟康唑治療患者中有2例死亡、1例未治愈。分析藥敏試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1例死亡患者對5-氟胞嘧啶耐藥，對氟康唑中介，另1例死亡患者對5-氟胞嘧啶中介，對氟康唑耐藥，2例未治愈患者分離的新型隱球菌對5-氟胞嘧啶和氟康唑均耐藥，這提示臨床治療該類疾病時(shí)一定要結(jié)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果選擇藥物。

總之，新型隱球菌感染仍是AIDS患者發(fā)病或死亡的一個(gè)重要原因，其臨床表現(xiàn)以頭痛、發(fā)熱為主，腦脊液壓力大部分＞200 mmH2O，新型隱球菌對多種抗真菌藥物敏感，臨床可以根據(jù)患者的疾病進(jìn)展采用不同治療方案，大部分患者轉(zhuǎn)歸較好，但5-氟胞嘧啶聯(lián)合氟康唑治療的方案中出現(xiàn)2例死亡，1例未治愈，提示該治療方案可能不是臨床治療的首選。