滿麗莉，向殿軍

（1.內(nèi)蒙古民族大學生命科學學院，內(nèi)蒙古通遼028042；2.內(nèi)蒙古民族大學農(nóng)學院，內(nèi)蒙古通遼028042）

2008年世界衛(wèi)生組織的報告顯示，每年有1730萬人死于心血管疾病，占全球年死亡總數(shù)的30%。血栓形成是導致心血管疾病的主要原因，其發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)逐年上升趨勢，目前臨床使用的纖溶酶（如尿激酶、鏈激酶、組織纖溶酶原激活劑）具有成本過高和不良副作用等限制，因此開發(fā)有效性和特異性高的纖溶藥物亟待解決[1-3]。納豆激酶是一種具有廣闊發(fā)展前景的絲氨酸蛋白酶，主要原因在于：①纖溶活性強，活性是纖溶酶的4 倍；②具有激活纖溶酶原活性和直接降解纖維蛋白的雙重功能；③成本低、安全性高；④來源廣泛。因此，納豆激酶的研究備受國內(nèi)外研究人員的關注[4-6]。

發(fā)酵條件優(yōu)化對生物工藝開發(fā)、性能改善和工業(yè)化應用發(fā)揮至關重要的作用。發(fā)酵條件可通過傳統(tǒng)或統(tǒng)計方法來優(yōu)化，傳統(tǒng)方法通常一次改變一個自變量，而將其他變量固定在一個水平上，此方法較為耗時，往往不易獲得最優(yōu)條件，應用統(tǒng)計方法可消除傳統(tǒng)方法的局限性，能降低試驗次數(shù)，節(jié)省時間和資源，同時有利于分析變量之間的交互作用[7]。近年來，響應面法（response surface methodology，RSM）在生物過程優(yōu)化方面得到了廣泛地應用，RSM 是一種有效用于設計試驗、建立模型、評估因素影響、交互作用及獲得最佳條件的統(tǒng)計方法[8]。納豆激酶的微生物發(fā)酵過程較為復雜，理解、控制和優(yōu)化發(fā)酵過程是一個關鍵步驟，通過響應面法建模為發(fā)酵過程的分析、設計和操作提供有用的信息，建立發(fā)酵動力學數(shù)學模型成為發(fā)酵行為的首要目標。本研究首先通過單因素試驗，檢測溫度、初始pH 值、接種量、裝液量及搖床轉(zhuǎn)速對枯草芽孢桿菌MX-6 納豆激酶合成量的影響，再以溶圈直徑為響應值，應用響應面法中的Box-Benhnken 設計建模，確定最佳產(chǎn)酶條件，旨在為更合理地應用和開發(fā)納豆激酶提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 菌種

枯草芽孢桿菌MX-6（Bacillus subtilis MX-6）由豆豉中篩選鑒定獲得。

1.1.2 試劑及培養(yǎng)基

凝血酶（1 000 U）：中國藥品生物制品檢定所；纖維蛋白原、瓊脂糖：美國Sigma 公司；其它藥品均為國產(chǎn)分析純。

基礎種子培養(yǎng)基：蛋白胨1%，牛肉膏0.3%，NaCl 0.5%，pH 7.2。

基礎發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖2%，蛋白胨2%，NaCl 0.5%，pH 7.2。

1.1.3 主要儀器設備

SW-CT 型超凈工作臺：鄭州南北儀器設備有限公司；MJ-54A/MJ-78A 型STIK 滅菌鍋：北京天賜科儀商貿(mào)有限公司；BPH-9082 型電熱恒溫培養(yǎng)箱：濟南來寶醫(yī)療器械有限公司；Microfuge16 型離心機：美國貝克曼公司；WS-600 型恒溫振蕩培養(yǎng)箱：德國Wiggens 公司；DHP-600 恒溫培養(yǎng)箱：常州中捷試驗儀器制造有限公司；110-801 型三量ip67 防水原點數(shù)顯卡尺不銹鋼零點電子游標尺：東莞市景有模具五金有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養(yǎng)方法及優(yōu)化前發(fā)酵條件

培養(yǎng)方法：挑取枯草芽孢桿菌MX-6 接種于裝有50 mL 基礎種子培養(yǎng)基的250 mL 錐形瓶中，37 ℃，160 r/min 條件下振蕩培養(yǎng) 12 h（OD600=1.5～1.6）。

優(yōu)化前發(fā)酵條件：將培養(yǎng)的菌液按5%接種于裝有50 mL 基礎發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL 錐形瓶中，30 ℃，初始pH 7.2，160 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)72 h。

1.2.2 納豆激酶活力的測定

發(fā)酵液以 5 000 r/min 離心 10 min，取 10 μL 上清液用于納豆激酶活性的測定。納豆激酶活力的測定采用纖維蛋白平板法[9]，溶圈直徑采用電子游標尺測定。

1.2.3 單因素試驗

1.2.3.1 溫度對枯草芽孢桿菌MX-6 產(chǎn)納豆激酶的影響

將培養(yǎng)的菌液按5%接種于裝有50 mL 基礎發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL 錐形瓶中，發(fā)酵溫度分別為22、27、32、37、42 ℃，初始 pH 7.2，160 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)72 h，獲得粗酶液，按照1.2.2 的方法測定納豆激酶活性。

1.2.3.2 初始pH 值對枯草芽孢桿菌MX-6 產(chǎn)納豆激酶的影響

將培養(yǎng)的菌液按5%接種于裝有50 mL 基礎發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL 錐形瓶中，30 ℃，初始pH 值分別為4、5、6、7、8，160 r/min 條件下振蕩培養(yǎng) 72 h，獲得粗酶液，按照1.2.2 的方法測定納豆激酶活性。

1.2.3.3 接種量對枯草芽孢桿菌MX-6 產(chǎn)納豆激酶的影響

將培養(yǎng)的菌液分別按1%、2%、3%、4%、5 %接種于裝有50 mL 基礎發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL 錐形瓶中，30 ℃，初始 pH 7.2，160 r/min 條件下振蕩培養(yǎng) 72 h，獲得粗酶液，按照1.2.2 的方法測定納豆激酶活性。

1.2.3.4 裝液量對枯草芽孢桿菌MX-6 產(chǎn)納豆激酶的影響

將培養(yǎng)的菌液按5%接種于分別裝有25、50、75、100、125 mL 基礎發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL 錐形瓶中，30 ℃，初始 pH 7.2，160 r/min 條件下振蕩培養(yǎng) 72 h，獲得粗酶液，按照1.2.2 的方法測定納豆激酶活性。

1.2.3.5 搖床轉(zhuǎn)速對枯草芽孢桿菌MX-6 產(chǎn)納豆激酶的影響

將培養(yǎng)的菌液按5%接種于裝有50 mL 基礎發(fā)酵培養(yǎng)基的 250 mL 錐形瓶中，30 ℃，初始 pH 7.2，分別在 160、170、180、190、200 r/min 條件下振蕩培養(yǎng) 72 h，獲得粗酶液，按照1.2.2 的方法測定納豆激酶活性。

1.2.4 響應面法優(yōu)化納豆激酶發(fā)酵條件

應用Design-Expert 軟件中的Box-Benhnken 設計構建模型，響應面法尋找最佳發(fā)酵條件。以溫度（A）、初始 pH 值（B）、接種量（C）、裝液量（D）、搖床轉(zhuǎn)數(shù)（E）5 個因素為自變量，溶圈直徑（mm）為響應值，運用五因素三水平的響應面分析試驗，共46 個試驗點，其中40 個為析因子，6 個為中心試驗。試驗因素水平見表1。

表1 響應面因素水平表Table 1 Factors and levels of the response surface methodology

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

應用SPSS 17.0 軟件中的One-way analysis of variance 計算標準差。采用Design-Expert 8.0.6 軟件中Box-Benhnken 設計進行響應面數(shù)據(jù)分析。

2 結果與分析

2.1 溫度對納豆激酶活力的影響

溫度對枯草芽孢桿菌MX-6 產(chǎn)納豆激酶的影響見圖1。

圖1 溫度對枯草芽孢桿菌MX-6 產(chǎn)納豆激酶的影響Fig.1 Effect of temperature on nattokinase production in Bacillus subtilis MX-6

溫度為37 ℃時，納豆激酶活性最大，溶圈直徑可達（18.23±0.17）mm。溫度為22 ℃或42 ℃產(chǎn)酶活性均較低，22 ℃菌體生長較緩慢，42 ℃菌體生長迅速，但提早進入衰亡期，近而影響納豆激酶的合成量。

2.2 初始pH值對納豆激酶活力的影響

初始pH 值對枯草芽孢桿菌MX-產(chǎn)納豆激酶的影響見圖2。

圖2 初始pH 對枯草芽孢桿菌MX-6 產(chǎn)納豆激酶的影響Fig.2 Effect of initial pH on nattokinase production in Bacillus subtilis MX-6

初始pH 值為7.0 時，納豆激酶的活性最大，溶圈直徑可達（18.19±0.32）mm，表明枯草芽孢桿菌MX-6適宜產(chǎn)酶條件為近中性。當初始pH 值為4 或8 時產(chǎn)酶活性均較低，說明酸性或堿性條件不利于納豆激酶的合成，可能是培養(yǎng)基中的H+或OH-會改變菌體內(nèi)納豆激酶的活力和結構所導致的。

2.3 接種量對納豆激酶活力的影響

接種量對枯草芽孢桿菌MX-產(chǎn)納豆激酶的影響見圖3。

圖3 接種量對枯草芽孢桿菌MX-6 產(chǎn)納豆激酶的影響Fig.3 Effect of inoculation amount on nattokinase production in Bacillus subtilis MX-6

由圖3 可知，接種量為3%時，納豆激酶的活性最大，溶圈直徑可達（17.57±0.14）mm。接種量過大（5%）會使營養(yǎng)物質(zhì)快速消耗，接種量過?。?%）會影響菌體內(nèi)某些輔酶和維生素的擴散，均不利于酶的合成。

2.4 裝液量對納豆激酶活力的影響

裝液量對枯草芽孢桿菌MX-產(chǎn)納豆激酶的影響見圖4。

由圖4 可知，裝液量為50 mL 時，納豆激酶的活性最大?？莶菅挎邨U菌MX-6 為需氧菌，裝液量過大（125 mL）會使溶氧量過低，裝液量過?。?5 mL），由于發(fā)酵中水分蒸發(fā)易導致菌體提早衰亡，不利于納豆激酶的工業(yè)化生產(chǎn)。

圖4 裝液量對枯草芽孢桿菌MX-6 產(chǎn)納豆激酶的影響Fig.4 Effect of liquid medium volume on nattokinase production in Bacillus subtilis MX-6

2.5 搖床轉(zhuǎn)速對納豆激酶活力的影響

搖床轉(zhuǎn)速對枯草芽孢桿菌MX-產(chǎn)納豆激酶的影響見圖5。

圖5 搖床轉(zhuǎn)數(shù)對枯草芽孢桿菌MX-6 產(chǎn)納豆激酶的影響Fig.5 Effect of shaker speed on nattokinase production in Bacillus subtilis MX-6

由圖5 可知，搖床轉(zhuǎn)速為170 r/min 時，納豆激酶的活性最大，溶圈直徑可達（16.37±0.18）mm。適宜的搖床轉(zhuǎn)速能提高溶氧量，有利于枯草芽孢桿菌MX-6的生長及納豆激酶合成。

2.6 響應面法優(yōu)化納豆激酶的發(fā)酵條件

2.6.1 模型建立及顯著性分析

以溶圈直徑為響應值，運用Box-Benhnken 設計46 組試驗。Box-Benhnken 試驗設計及結果見表2。

表2 Box-Benhnken 試驗設計及結果Table 2 Experiment design and results of BBD

續(xù)表2 Box-Benhnken 試驗設計及結果Continue table 2 Experiment design and results of BBD

二次回歸模型為：Y=-450.691 52+4.272 02A+16.533 75B+5.890 37C+0.116 07D+3.808 16E+7.500 00×103AB-5.000 00×104AC+ 1.000 00×104AD-5.000 00×105AE+1.293 41×1014BC+2.000 00×104BD-2.500 00×104BE-2.700 00×103CD+2.500 00×104CE+1.200 00×104DE-0.058 858A2-1.208 13B2-0.953 96C2-1.367 67×103D2-0.011 206E2。

對二次回歸模型的方差分析結果見表3。

表3 二次模型的方差分析Table 3 Analysis of variance（ANOVA）for the quadratic model

該模型的P＜0.01，表明試驗所采取的二次模型極顯著。失擬項的P=0.087 8＞0.05，模型失擬項不顯著，決定系數(shù)=0.999 5，表明模型與實際情況擬合較好，可應用該模型對試驗結果預測和分析。模型中A、B、C、D、AB、CD、A2、B2、C2、D2、E2的 P＜0.01，表明對納豆激酶合成量的影響極顯著。DE 的P＜0.05，表明對納豆激酶合成量的影響顯著。交互項 AC、AD、AE、BC、BD、BE、CE 的P＞0.05，說明這些交互作用對納豆激酶合成量無顯著性影響。

2.6.2 響應面分析

優(yōu)化條件下的3D 響應面圖見圖6。

圖6 優(yōu)化發(fā)酵條件下的3D 響應面圖Fig.6 3D response surface curve under optimal fermentation conditions

各因素的變化范圍分別為溫度（32 ℃～42 ℃），初始pH 值（6～8），接種量（2%～4%），裝液量（25 mL～75 mL），搖床轉(zhuǎn)速（160 r/min～180 r/min）。在分析兩因素之間的交互作用時，其中一個因素固定，隨著另一個因素的增加，納豆激酶的合成量均呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。優(yōu)化發(fā)酵條件為溫度36.69 ℃、初始pH 6.94、接種量3.03%、裝液量48.77 mL、搖床轉(zhuǎn)速170.05 r/min。預測的溶圈直徑為20.62 mm。

2.6.3 回歸模型的驗證試驗

為檢驗預測結果的可靠性，采用優(yōu)化發(fā)酵條件（溫度36.69 ℃、初始pH 6.94、接種量3.03 %、裝液量48.77 mL、搖床轉(zhuǎn)速170.05 r/min）進行驗證試驗。實際溶圈直徑為（20.71±0.18）mm，與預測的溶圈直徑20.62 mm 相比較差異不顯著（P＞0.05），表明該模型可靠性好。與優(yōu)化前的溶圈直徑（15.28±0.13）mm 相比，溶圈直徑提高了35.54%，可見該模型能較好地預測納豆激酶的合成情況。

3 結論

納豆激酶具有成本低、活性高、安全無毒等優(yōu)點，已成為當今研究的熱點[10-11]。增加納豆激酶合成量的主要方法包括：篩選納豆激酶高產(chǎn)菌株；優(yōu)化發(fā)酵條件或培養(yǎng)基；誘變育種。由于枯草芽孢桿菌在非適宜條件下極易形成休眠體-芽孢，導致納豆激酶的合成終止，優(yōu)化發(fā)酵條件是顯著提高納豆激酶合成量的有效方法之一[3，12]。本研究應用響應面法綜合分析發(fā)酵條件對枯草芽孢桿菌MX-6 合成納豆激酶的影響，優(yōu)化的最佳發(fā)酵條件為：溫度36.69 ℃、初始pH 6.94、接種量3.03%、裝液量48.77 mL、搖床轉(zhuǎn)速170.05 r/min。優(yōu)化發(fā)酵條件下溶圈直徑可高達20.71 mm，與響應面預測值相比差異不顯著，表明構建模型的可行性和可靠性，通過響應面法優(yōu)化納豆激酶最佳發(fā)酵條件具有科學性和準確性，有利于納豆激酶作為新型溶栓藥物和功能性食品添加劑的應用奠定基礎。