馬長路，焦夢麗，羅紅霞，逄曉陽，蘆晶，張書文，呂加平，*，妥彥峰

（1.北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學院食品與生物工程系，北京102442；2.中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京100193；3.北京農(nóng)學院食品科學與工程學院，北京102206；4.大連工業(yè)大學食品學院，遼寧大連116034）

半個世紀以來，心腦血管疾病已成為威脅人類健康的首要疾病，其死亡率已超過所有癌癥的總和。流行病學和臨床調(diào)查表明，高膽固醇是引發(fā)該疾病的重要因素之一，降低血清膽固醇水平，特別是低密度脂蛋白水平，能顯著降低該疾病的發(fā)病率和死亡率[1-3]。某些乳酸菌菌株，能夠促進胃腸道吸收，增加腸道有益菌群，改善人體胃腸道功能，抑制腐敗菌的繁殖，提高機體免疫力等重要生理功能[4]。國內(nèi)外有研究表明：部分乳酸菌具有較強的降膽固醇能力，長期食用含乳酸菌的食品或乳酸菌發(fā)酵食品可有效降低人體血液中的膽固醇質(zhì)量分數(shù)，從而大大減少心血管疾病的發(fā)生[5]。酸菜作為我國東北地區(qū)的一種傳統(tǒng)乳酸菌蔬菜發(fā)酵制品，其以營養(yǎng)豐富、酸鮮脆嫩、解膩開胃等特點深受廣大群眾的喜愛，且研究表明酸菜汁液中富含大量乳酸菌[6]。本試驗選用MRS 培養(yǎng)基從東北農(nóng)家自然發(fā)酵的酸菜中分離乳酸菌，通過體外試驗研究其功能特性，篩選出具有耐酸耐膽鹽、降膽固醇能力的菌株，并進行菌種鑒定，豐富降膽固醇乳酸菌菌種資源庫，也為后續(xù)試驗提供材料和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

酸菜汁液：采自黑龍江佳木斯市農(nóng)家發(fā)酵酸菜，采集樣品于離心管內(nèi)，加入無菌甘油使終濃度為25%，于-80 ℃冰箱保存。

MRS 培養(yǎng)基：北京陸橋技術(shù)股份有限公司；MRSCHOL 培養(yǎng)基[7]：膽固醇 1.0 g，加 1 mL 吐溫-80 助溶，加入1 000 mL MRS 液體培養(yǎng)基中，調(diào)pH 值至7.0。

革蘭氏染色試劑盒、乳酸菌生化鑒定試劑盒：北京陸橋技術(shù)股份有限公司；細菌基因組DNA 提取試劑盒、引物、TE 緩沖液、DNA Marker、ddH2O、Mix 液：天根生化科技有限公司；牛膽鹽、膽固醇（99 %）：美國sigma 公司；鄰苯二甲醛、氯化鈉、鹽酸、冰乙酸、正己烷、無水乙醇、氫氧化鉀等試劑均為分析純級：國藥化學試劑集團。

1.2 主要設(shè)備及儀器

DHP-9082 恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學儀器有限公司；HDL 超凈工作臺：北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；GL124-1SCN 萬分之一分析天平：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；LDZX-50KB 立式壓力蒸汽滅火器：上海申安醫(yī)療器械廠；PHS-3C 雷磁pH 計：上海精密科學儀器有限公司；SHB-III 循環(huán)水式多用真空泵：上海振捷實驗設(shè)備有限公司；CX41RF 顯微鏡：日本奧林巴斯公司；TP600 梯度 PCR 儀：日本 TAKARA 公司；Sigma-3K15 離心機：德國SIGMA 科技有限公司；UV-2600 紫外可見分光光度計：島津儀器有限公司；DYY-6C 電泳儀：北六一儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 乳酸菌的初步分離純化

將帶回的酸菜汁液解凍，以備使用。采用梯度平板稀釋法，吸取酸菜汁液于0.85%理鹽水中進行梯度稀釋，然后涂布于含0.5%CaCO3的固體MRS 培養(yǎng)基上，37 ℃靜置培養(yǎng)48 h，挑選平板上有明顯透明圈的菌落，在MRS 平板上多次劃線純化直至菌落形態(tài)單一，挑取單菌落到MRS 液體培養(yǎng)基增菌培養(yǎng)24 h，記錄菌落特征，于4 ℃冰箱存儲備用[8-10]。

1.3.2 生理生化鑒定試驗

對菌株進行革蘭氏染色、過氧化氫酶試驗、采用乳酸菌生化鑒定試劑盒做碳水化合物（蔗糖、甘露醇、山梨醇、水楊苷等）發(fā)酵試驗[5]。

1.3.3 菌種16S rDNA 鑒定試驗[5]

采用細菌基因組DNA 試劑盒提取細菌DNA，利用引 物 27F （5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）、1492R（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'） 進行擴增；聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）反應(yīng)程序為：95 ℃預變性 4 min；95 ℃變性 45 s，50 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 2 min，循環(huán) 30 次；72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳分析后，送交華大基因公司進行16S rDNA 測序，所得序列在NCBI 中進行比對，確定菌種。

1.3.4 降膽固醇乳酸菌的篩選

繪制膽固醇標準曲線：取1 mL 的配制質(zhì)量濃度為0.02、0.05、0.10、0.12、0.15、0.20 mg/mL 的膽固醇系列標準溶液，加入3 mL 95%乙醇、2 mL 50%氫氧化鉀，旋渦振蕩混勻。于60 ℃下恒溫水浴10 min，冷卻后加入5 mL 正己烷，旋渦振蕩萃取1 min～2 min，加入2 mL蒸餾水，振蕩均勻，靜置分層。吸取2 mL 上層正己烷，60 ℃水浴氮氣吹干，加入4 mL 0.5 mg/mL 鄰苯二甲醛溶液和2 mL 濃硫酸，顯色反應(yīng)20 min，測定吸光值（A550）并繪制膽固醇標準曲線[11]；

乳酸菌降解膽固醇能力測定：將培養(yǎng)好的乳酸菌菌液，按5%接種量接種于10 mL 降膽固醇篩選培養(yǎng)基（MRS-CHOL 培養(yǎng)基）中，取1mL 上清液測膽固醇含量作為空白；再于37 ℃靜置培養(yǎng)48 h，搖勻后立即取樣1 mL，12 000×g 離心5 min，用鄰苯二甲醛比色法測定上清中膽固醇含量[12]。平行試驗3 次取平均值。

式中：A 為受試菌株在MRS-CHOL 培養(yǎng)基中37 ℃靜置培養(yǎng) 48 h 后膽固醇殘留量，mg/mL；C 為空白MRS-CHOL 培養(yǎng)基中膽固醇含量，mg/mL。

1.3.5 耐酸耐膽鹽試驗[2，13-15]

將接種于MRS 液體培養(yǎng)基的乳酸菌按2%接種量接種于 pH=3.0、pH=4.0、pH=5.0 液體 MRS 培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng) 24 h，以 pH=6.0 的 MRS 培養(yǎng)基為空白對照，測各組菌液的OD600nm值，重復3 次取平均值。

式中：N 為菌株在不同pH 值培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h后的OD 值；N0為菌株在pH=6.0 培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h后的OD 值。

配制膽鹽濃度為1、2、3 g/L 的液體MRS 培養(yǎng)基，將乳桿菌液按2%接種量接種于不同膽鹽濃度MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，以不加膽鹽的MRS 培養(yǎng)基為空白對照，測各組菌液的OD600nm值；

式中：A 為測試菌株在不同膽鹽濃度培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h 后菌液的OD 值；A0為菌株在不含膽鹽培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h 后菌液的OD 值。

1.3.6 統(tǒng)計分析

采用Excel、SPSS19.0 軟件分析處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果分析

2.1 酸菜中乳酸菌分離及鑒定結(jié)果

對100 個酸菜樣本中乳酸菌進行分離培養(yǎng)，最終成功分離鑒定10 株菌，并對此10 株菌定義編號為M：姓氏馬+H：黑龍江縮寫黑+S：酸菜+年限+編號；即 MHS1701、MHS1702、MHS1703、MHS1704、MHS1705、MHS1706、MHS1707、MHS1708、MHS1709、MHS1710。經(jīng)培養(yǎng)，10 株菌菌落呈中等大小，有凸起，乳白色，濕潤，明顯溶鈣圈，邊緣整齊，菌落呈圓形，且挑取時具有黏性。

10 株菌革蘭氏染色呈陽性，過氧化氫酶反應(yīng)呈陰性，并對其碳水化合物利用特性進行測定，結(jié)果如表1所示。

表1 乳酸菌分離菌株菌落特征Table 1 Colony characteristics of lactic acid bacteria isolates

MHS1704 不發(fā)酵山梨醇，MHS1710 不水解蔗糖。根據(jù)查閱《伯杰氏細菌鑒定手冊》，乳桿菌屬細菌可利用的碳源有葡萄糖、甘露糖、果糖、半乳糖、糊精、七葉苷、纖維二糖、麥芽糖、甘露醇、水楊苷、山梨醇、蔗糖、棉子糖、乳糖等，結(jié)合試驗結(jié)果分析，初步判斷10 株菌均為乳酸桿菌屬。

采用細菌DNA 基因組試劑盒提取10 株菌株基因組DNA，產(chǎn)物通過PCR 擴增，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，最終檢測電泳圖有且只有一個條帶，標準Marker條帶為2 000 bp，各菌株條帶在1 000 bp 左右。菌株DNA 提取產(chǎn)物條帶單一，且與預期目的大小一致，可以滿足后續(xù)測序要求。

利用 BLAST（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST），將所測定的10 株菌株的16S rDNA 序列，與GenBank/EMBL/DDBJ 數(shù)據(jù)庫對比[7]，具體鑒定結(jié)果如表2 所示。

表2 16S rDNA 序列對比結(jié)果Table 2 Comparison of 16s rDNA sequences

酸菜中微生物多樣性大多采用傳統(tǒng)培養(yǎng)的方法進行篩選分離、鑒定。目前，李欣等[4]采自大慶地區(qū)的傳統(tǒng)酸菜發(fā)酵液中分離得到14 株菌株，其中4 株彎曲乳桿菌、3 株清酒乳桿菌、5 株植物乳桿菌、1 株短乳桿菌和1 株腸膜明串珠菌。栗永樂等[6]從內(nèi)蒙古東部地區(qū)采集的14 份農(nóng)家酸菜汁中分離出84 株乳酸菌，分別鑒定為植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、短乳桿菌和耐酸乳桿菌、唾液鏈球菌、嗜熱鏈球菌、糞腸球菌、植物乳球菌、腸膜明串株菌。奎夢漪等[16]從云南自然發(fā)酵酸菜液中的優(yōu)勢乳酸菌分離出12 株乳酸菌，分別為植物乳桿菌、腸膜明串珠菌、短乳桿菌。本研究從傳統(tǒng)東北農(nóng)家酸菜中分離得到10 株菌，經(jīng)16S r DNA 序列分析鑒定為植物乳桿菌、棒狀乳桿菌、干酪乳桿菌和短乳桿菌。傳統(tǒng)發(fā)酵酸菜是一個豐富的乳酸菌資源庫，并且酸菜具有悠久的安全食用史，因此可以從中篩選具有潛在益生功能的乳酸菌菌株。

2.2 乳酸菌降膽固醇結(jié)果

采用鄰苯二甲醛法獲得膽固醇標準曲及回歸方程為y=2.487 5x-0.024 7，R2=0.997 8，呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

通過鄰苯二甲醛法測定10 株乳桿菌的膽固醇去除情況，結(jié)果如表3 所示。

10 株乳桿菌都具有一定的降解膽固醇的能力，膽固醇脫除率從9%～60%不等，不同菌株間膽固醇脫除率差異較大，與黃燕燕等[2]研究結(jié)果類似。其中菌株MHS1701、MHS1703、MHS1706 的膽固醇脫除率超過40%以上，分別為40.71%、52.84%、41.41%，菌株MHS1701、MHS1706 較汪曉輝等[12]的研究結(jié)果偏低，可能與酸菜樣本、乳酸菌個體差異、培養(yǎng)條件等因素有關(guān)。初篩結(jié)果選取 MHS1701、MHS1703、MHS1706 3 株脫除率高的菌株。

表3 乳酸菌去除膽固醇試驗結(jié)果（n=3）Table 3 Results of cholesterol removal test by lactic acid bacteria（n=3）

2.3 乳酸菌在低pH值及高膽鹽條件下的存活性

10 株不同乳桿菌在不同pH 值培養(yǎng)液及含不同膽鹽培養(yǎng)液中的生長狀況如表4、表5 所示。

表4 MHS1701～MHS1710 的耐酸性（n=3）Table 4 Acid tolerance of MHS1701-MHS1710（n=3） %

為保證乳酸菌在胃腸道內(nèi)具有良好的存活能力，必須有耐胃酸耐膽鹽的特性。結(jié)合表4、表5 耐酸耐膽鹽結(jié)果可知，10 株乳酸菌MHS1701～MHS1710 在不同pH 值和不同膽鹽濃度下的耐受能力相差不大。10 株乳酸菌耐酸性隨著pH 值降低而降低，在pH=3 下各菌株的耐酸能力較?。浑S著膽鹽濃度上升，各菌株的耐膽鹽能力有小幅度下降，此結(jié)果與林龍鎮(zhèn)等[15]經(jīng)不同培養(yǎng)條件下平板計活菌數(shù)的結(jié)果一致。其中篩選得到的降膽固醇能力較好的3 株目標菌株MHS1701、MHS1703、MHS1706 中 MHS1701 在 pH=3 下的耐酸性最強，為2.03 %；目標菌株中MHS1701 耐膽鹽效果最好，達11.95 %。因此，菌株MHS1701 具有優(yōu)良功能特性。

表5 MHS1701～MHS1710 的膽鹽耐受性（n=3）Table 5 Gallbladder salt tolerance of MHS1701-MHS1710（n=3）%

3 結(jié)論

本試驗從傳統(tǒng)東北發(fā)酵酸菜中分離獲得植物乳桿菌、棒狀乳桿菌、干酪乳桿菌及短乳桿菌共10 株菌；要求篩選出的乳酸菌除了具備特定的降膽固醇功能以外，還必須具有益生菌所共有的優(yōu)良特性，試驗表明各菌株在pH 值為3.0 的環(huán)境以及3 g/L 的膽鹽濃度下具有一定的耐受性；各菌株膽固醇脫除率在9%～60%之間，MHS1701、MHS1703、MHS1706 菌株的膽固醇清除能力分別達41%、53%、41%，且MHS1701 的耐酸耐膽鹽能力最強。因此傳統(tǒng)東北酸菜可以作為降解膽固醇乳酸菌的來源庫，通過體外培養(yǎng)篩選得到的植物乳桿菌MHS1701 的功能特性最明顯，有實際應(yīng)用價值。