張克賢，孫勇民，黃艷玲，張軼斌

（天津現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學(xué)院，天津300300）

市場(chǎng)在售含果汁產(chǎn)品是果汁與其它原料和水的調(diào)和物。果汁一般用成熟的水果為原料經(jīng)過(guò)物理方法如壓榨、離心等得到的汁液狀產(chǎn)品，稱(chēng)其為純果汁或100%果汁[1]。如橙汁飲料是由純橙汁加入了糖、甜味劑、酸味料、香料、水等成分。純橙汁加入的量值決定了該產(chǎn)品的質(zhì)量[2-5]，因此需要建立方便準(zhǔn)確的檢測(cè)方法，對(duì)果汁類(lèi)產(chǎn)品進(jìn)行產(chǎn)品質(zhì)量控制[6-8]。

GB/T 16771-1997《橙、柑、橘汁及其飲料中果汁含量的測(cè)定》國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，采用的果汁含量的測(cè)定方法較復(fù)雜并且花費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)，它通過(guò)測(cè)定純果汁或者含果汁飲料中可溶性固形物、鉀、總磷、氨基酸態(tài)氮、L-脯氨酸、總D-檸檬酸、總黃酮共7 種組分的實(shí)測(cè)值計(jì)算果汁含量[9-12]。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外資料發(fā)表了對(duì)柑橘等果實(shí)和果汁中類(lèi)黃酮的成分進(jìn)行了較詳細(xì)的分析研究[13-15]。特別是光電二極管陣列檢測(cè)器高效液相色譜儀和高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用儀等儀器測(cè)定柑橘果實(shí)中類(lèi)黃酮的成分同時(shí)能夠?qū)崿F(xiàn)定性和定量[16-19]，例如高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定柑橘果實(shí)中柚皮素-7-β 蕓香糖苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、香風(fēng)草苷、柚皮素、橙皮素、甜橙黃酮、川皮苷和桔黃酮10 種類(lèi)黃酮并且分別對(duì)各個(gè)組分定性和定量。類(lèi)黃酮成分是柑橘果實(shí)及其壓榨液中固有的成分，其具有量值穩(wěn)定性[20-22]。在調(diào)和果汁產(chǎn)品時(shí)其與純果汁加入量相關(guān)，其他成分如糖、甜味劑、酸味料、香料、水等成分可以調(diào)和不具有量值穩(wěn)定性。由于類(lèi)黃酮成分可以進(jìn)行分離、定性和定量，因此通過(guò)光電二極管陣列檢測(cè)器高效液相色譜儀測(cè)定果汁飲料中橙汁含量成為可能。

本試驗(yàn)用光電二極管陣列檢測(cè)器高效液相色譜儀測(cè)定純橙汁中類(lèi)黃酮成分之一新橙皮苷，外標(biāo)法定量。配制不同含量純橙汁的果汁飲料，測(cè)定新橙皮苷含量，建立橙汁含量計(jì)算公式。

1 材料與方法

1.1 試劑和材料

純橙汁：天津山海關(guān)飲料有限公司提供。

新橙皮苷（純度98%）：北京百靈威科技有限公司；乙腈、冰乙酸、甲醇（均為色譜純）：天津星馬克科技發(fā)展有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20AD 型島津高效液相色譜儀（帶有Essentia SIL-16 型二極管陣列檢測(cè)器，SPD-M20A 型自動(dòng)進(jìn)樣器，二元泵，島津Shim-Pak GIST C18（250 mm×4.6 mm，5 um）反相色譜柱和LabSolutions Essentia 工作站）：日本島津株式會(huì)社；QP-01 型流動(dòng)相過(guò)濾裝置：天津津騰科技有限公司；0.45 μm 水型和溶劑型濾膜：北京海成世潔過(guò)濾器材有限公司；KQ-100VDV 型雙頻數(shù)控超聲波清洗器：江蘇省昆山市超生儀器有限公司；[0.45μm（水系）和0.45 μm（有機(jī)系）]針筒式濾膜過(guò)濾器：天津市精拓儀器科技有限公司；注射器：鄭州康佳醫(yī)療器械有限公司；5804r 型高速離心機(jī)：德國(guó)艾本德公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

用精度0.1 mg 的電子天平稱(chēng)取新橙皮苷0.025 5 g于50.00 mL 容量瓶中加入甲醇溶解并定容。該定容物為500 mg/L 的新橙皮苷儲(chǔ)備液，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)需要逐級(jí)稀釋成 5、10、15、20 mg/L 不同濃度的使用液。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

將新橙皮苷儲(chǔ)備液進(jìn)行不同濃度梯度稀釋成使用液并進(jìn)行過(guò)濾，在相同條件下進(jìn)行色譜分析，以新橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，以濃度對(duì)應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到回歸方程。未知樣經(jīng)過(guò)色譜分析，通過(guò)峰面積利用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)求出濃度。

1.3.3 樣品制備

將純橙汁用超純水配成10%～80%樣品分別移取25 mL 于50 mL 容量瓶中用乙腈定容成50 mL，同樣配制原液。經(jīng)超聲脫氣后移取5 mL～7 mL 于10 mL 離心試管中，離心5 min，取上層清液經(jīng)0.45 μm 針筒式濾膜過(guò)濾器過(guò)濾后，備用。

1.3.4 儀器條件確定

優(yōu)化后的色譜條件為：以島津Shim-Pak GIST C18（250 mm×4.6 mm，5 μm） 反相色譜柱為分析柱，0.2%乙酸水溶液和乙腈作為流動(dòng)相，流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣30 μL，梯度洗脫，梯度洗脫程序見(jiàn)表1，柱溫40 ℃，DAD 檢測(cè)器在190 nm～800 nm 檢測(cè)新橙皮苷化合物，色譜圖見(jiàn)圖1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedure for mobile phase

圖1 標(biāo)樣新橙皮苷HPLC 色譜圖Fig.1 Chromatogram of standard new hesperidin HPLC

1.3.5 標(biāo)樣新橙皮苷的光譜圖

將制備的標(biāo)樣儲(chǔ)備液按照儀器條件進(jìn)行掃描和檢測(cè)，利用二極管檢測(cè)器在190 nm～800 nm 范圍的檢測(cè)功能，得到紫外-可見(jiàn)光光譜圖，顯示各個(gè)波長(zhǎng)吸收峰。

1.4 橙汁含量計(jì)算

原果汁純品進(jìn)樣30 μL，得到原果汁純品的新橙皮苷HPLC 峰面積，記為S純，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出原果汁中的新橙皮苷含量C純。利用同一批次原果汁純品配置的濃度為 10%、20%、30%、40%、50 %、60 %的橙汁樣品，依次進(jìn)樣30 μL，分別得到各個(gè)配制不同濃度樣品的 HPLC 峰面積 S10、S20、S30、S40、S50、S60，同樣計(jì)算新橙皮苷濃度 C10、C20、C30、C40、C50、C60。以稀釋樣新橙皮苷濃度除以純樣新橙皮苷濃度得到配制橙汁含量公式。

圖2 標(biāo)樣新橙皮苷的光譜圖Fig.2 Spectrogram of standard new hesperidin

式中：Xi 表示橙汁含量，%；Pi表示稀釋樣新橙皮苷含量，mg/L；P純表示純樣新橙皮苷含量，mg/L；Si表示稀釋樣新橙皮苷HPLC 峰面積；S純表示純樣新橙皮苷HPLC 峰面積。

當(dāng)測(cè)定中使用同一新橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)時(shí)可以簡(jiǎn)化算式用新橙皮苷HPLC 峰面積直接計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 新橙皮苷紫外最大吸收波長(zhǎng)

標(biāo)樣新橙皮苷的光譜圖見(jiàn)圖2，標(biāo)樣新橙皮苷190 nm～400 nm 紫外吸收波長(zhǎng)圖見(jiàn)圖3，標(biāo)樣新橙皮苷260、272、280 nm 和 290 nm 的 HPLC 色譜圖見(jiàn)圖4。

圖3 標(biāo)樣新橙皮苷190 nm～400 nm 紫外吸收波長(zhǎng)圖Fig.3 UV absorption wavelength of standard hesperidin 190 nm-400 nm

圖4 標(biāo)樣新橙皮苷HPLC 色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of standard new hesperidin

測(cè)定新橙皮苷紫外最大吸收波長(zhǎng)的方法是使用二級(jí)管陣列檢測(cè)器同時(shí)檢測(cè)成分的色譜和紫外光譜。測(cè)定標(biāo)樣新橙皮苷，光譜顯示出紫外最大吸收波長(zhǎng)280 nm；截取190 nm～400 nm 波長(zhǎng)的紫外吸收光譜圖，同樣選擇 260、272、280 nm 和 290 nm 的 HPLC 色譜圖，列出 260、272、280 nm 和 290 nm 波長(zhǎng)檢測(cè)出 HPLC色譜圖對(duì)應(yīng)的強(qiáng)度值如圖4 和表2。兩種方法顯示新橙皮苷紫外最大吸收波長(zhǎng)為280 nm。

表2 不同波長(zhǎng)檢測(cè)出色譜圖對(duì)應(yīng)的強(qiáng)度值Table 2 Different wavelengths to detect the corresponding intensity values of excellent spectra

2.2 高效液相色譜儀的儀器精密度

高效液相色譜儀的儀器精密度即整機(jī)性能用定性和定量的重復(fù)性確定。為使分析結(jié)果準(zhǔn)確，確保分析數(shù)據(jù)的可靠性，對(duì)高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)量重復(fù)性驗(yàn)證，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。JJG705-2014《液相色譜儀檢定規(guī)程》計(jì)量標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)定了定性重復(fù)性測(cè)量結(jié)果的RSD≤1.0%；定量測(cè)量重復(fù)性測(cè)量結(jié)果的RSD≤3.0%。保留時(shí)間和峰面積重復(fù)性測(cè)定結(jié)果符合標(biāo)準(zhǔn)，滿(mǎn)足本試驗(yàn)方法的要求見(jiàn)表3。

表3 保留時(shí)間和峰面積重復(fù)性結(jié)果Table 3 Retention time and peak area reproducibility results

2.3 新橙皮苷定性

將純橙汁和乙腈1 ∶1（體積比）混合，經(jīng)過(guò)離心、超聲脫氣和過(guò)濾后，轉(zhuǎn)移到自動(dòng)進(jìn)樣器樣品瓶中，用相同條件處理新橙皮苷儲(chǔ)備液并轉(zhuǎn)移到自動(dòng)進(jìn)樣器樣品瓶中進(jìn)行HPLC 色譜分析。純橙汁中新橙皮苷定性采用保留時(shí)間和樣品中加入新橙皮苷基準(zhǔn)物，峰增高的方法完成定性見(jiàn)圖5、圖6 和圖7。

圖5 標(biāo)樣新橙皮苷的HPLC 色譜圖Fig.5 HPLC chromatogram of standard new hesperidin

圖6 樣品橙汁的HPLC 色譜圖Fig.6 HPLC chromatogram of sample orange juice

圖7 樣品橙汁加入標(biāo)樣新橙皮苷的HPLC 色譜圖Fig.7 HPLC chromatogram of sample orange juice added with standard new hesperidin

保留時(shí)間18.6 min 的色譜峰是新橙皮苷，純橙汁加入新橙皮苷內(nèi)標(biāo)物該峰明顯增高，由此定性該峰為樣品中新橙皮苷色譜峰。

2.4 新橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

用1.3.1 配制的500 mg/L 的新橙皮苷儲(chǔ)備液，采用逐級(jí)稀釋法分別稀釋配制5、10、15、20 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)液，線(xiàn)性回歸法做新橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)見(jiàn)圖8。

圖8 新橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.8 Standard curve of new hesperidin

由圖8 可知，在濃度5 mg/L～20 mg/L 范圍內(nèi)，以橙皮苷濃度及峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，y=4 857.5x-7 601.5，回歸系數(shù)為0.997 1。

2.5 配制不同濃度樣品的回收率試驗(yàn)

將配制不同濃度的橙汁樣品分別處理出6 個(gè)樣品，分別測(cè)定并獲取新橙皮苷HPLC 峰面積，計(jì)算空白加標(biāo)回收率，標(biāo)準(zhǔn)偏差和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。不同濃度的橙汁樣品測(cè)定回收率試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 不同濃度的橙汁樣品測(cè)定回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Test results of recovery rate of orange juice with different concentrations

續(xù)表4 不同濃度的橙汁樣品測(cè)定回收率試驗(yàn)結(jié)果Continue table 4 Test results of recovery rate of orange juice with different concentrations

由表4 可知，測(cè)定橙汁樣品結(jié)果的回收率為98.52%～102.04%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.69%～3.08%，該方法的分析結(jié)果精密度較好，用該方法測(cè)定橙汁含量由較高可靠性。

2.6 國(guó)標(biāo)方法與本方法檢測(cè)橙汁含量結(jié)果

根據(jù)國(guó)標(biāo)GB/T 16771-1997《橙、柑、橘汁及其飲料中果汁含量的測(cè)定》，對(duì)配制的不同濃度的橙汁樣品，檢測(cè)了可溶性固形物、鉀、總磷、氨基酸態(tài)氮、L-脯氨酸、總D-異檸檬酸和總黃酮7 個(gè)指標(biāo)的實(shí)測(cè)值計(jì)算橙汁含量的測(cè)試結(jié)果。同時(shí)對(duì)以上橙汁樣品進(jìn)行本方法測(cè)定并獲取新橙皮苷HPLC 峰面積計(jì)算出橙汁含量，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定5 次取平均值，同配制含量進(jìn)行比較，并計(jì)算相對(duì)誤差見(jiàn)表5。兩種測(cè)試方法結(jié)果相對(duì)誤差在0.67%～3.66%之間，準(zhǔn)確度較高。

表5 國(guó)標(biāo)方法與本方法檢測(cè)果汁含量Table 5 National standard method and this method for detecting fruit juice content

3 結(jié)論

本試驗(yàn)利用高效液相色譜法測(cè)定橙汁含量，通過(guò)確定檢測(cè)器波長(zhǎng)280 nm，選擇橙汁中類(lèi)黃酮成分之一新橙皮苷做定量基準(zhǔn)峰，測(cè)定結(jié)果精密度較好回收率為98.52%～102.04%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.69%～3.08%，準(zhǔn)確度較高相對(duì)誤差在0.67%～3.66%之間。

高效液相色譜法測(cè)定橙汁含量方法與國(guó)標(biāo)方法相比較，前處理簡(jiǎn)單，樣品只需經(jīng)離心、過(guò)濾即可檢測(cè)，高效快速，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程僅需約2.5 h。采用高效液相色譜方法分析橙汁含量簡(jiǎn)便快速，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。