白曉璟 廉小平 王玉奎 張賀翠 劉倩瑩 左同鴻 張以忠 謝琴琴 胡燈科 任雪松 曾 靜 羅紹蘭 蒲 敏 朱利泉,*

甘藍(lán)SI相關(guān)基因的克隆與分析

白曉璟1,**廉小平2,**王玉奎1張賀翠1劉倩瑩1左同鴻1張以忠1謝琴琴1胡燈科1任雪松2曾 靜3羅紹蘭1蒲 敏1朱利泉1,*

1西南大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院, 重慶 400716;2西南大學(xué)園藝園林學(xué)院, 重慶 400716;3長江師范學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生物工程學(xué)院, 重慶 408100

甘藍(lán)自交不親和性(self-incompatibility, SI)是柱頭對相同單倍型的花粉產(chǎn)生的排斥或抑制反應(yīng)。鈣依賴蛋白激酶(calcium-dependent protein kinase, CDPK)是植物面對逆境信號時(shí)參與抗逆反應(yīng)的重要元件。本文通過甘藍(lán)自花授粉0~60 min的柱頭轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析, 成功地篩選到一個(gè)受自花授粉誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)的基因, 該基因與擬南芥中參與植物逆境信號傳導(dǎo)的鈣依賴蛋白激酶基因高度同源。基因開放閱讀框1599 bp, 編碼一種具有533個(gè)氨基酸殘基的親水性蛋白, 可在大腸桿菌胞質(zhì)中被誘導(dǎo)表達(dá), 其相對分子質(zhì)量為60.4 kD, 表明BoCDPK14為活性胞質(zhì)蛋白。該基因起始密碼子上游2000 bp的核苷酸序列中含有脅迫反應(yīng)、激素反應(yīng)、代謝調(diào)節(jié)等應(yīng)答元件。在甘藍(lán)柱頭、花粉、花蕾、花瓣和葉片中表達(dá), 且柱頭中的表達(dá)量低于花粉。熒光定量PCR結(jié)果證實(shí),在0~60 min的表達(dá)變化趨勢與轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果一致。通過酵母雙雜交發(fā)現(xiàn), BoCDPK14蛋白激酶結(jié)構(gòu)域與谷氨酸受體通道蛋白BoGLR2.8d存在相互作用, 表明BoCDPK14可能是參與SI反應(yīng)過程的新蛋白。本研究結(jié)果表明BoCDPK14可能作為Ca2+信號元件參與甘藍(lán)柱頭響應(yīng)花粉刺激的分子過程, 這為甘藍(lán)自交不親和的進(jìn)一步研究和利用提供了新內(nèi)容。

甘藍(lán);基因; 酵母雙雜交; 自花授粉; 自交不親和

自交不親和性(self-incompatibility, SI)是植物限制自交衰退、促進(jìn)雜交優(yōu)勢, 在長期進(jìn)化過程中形成的一種復(fù)雜而完善的重要遺傳機(jī)制。甘藍(lán)屬于典型的孢子體自交不親和植物, 其分子機(jī)制主要集中在SI信號傳導(dǎo)元件協(xié)同作用抑制自花花粉萌發(fā)或花粉管生長。目前研究最多的是由SRK-ARC1- Exo70A1等介導(dǎo)的蛋白質(zhì)泛素化降解途徑。Gu等[1]以SRK胞內(nèi)激酶域?yàn)檎T餌, 通過酵母雙雜交技術(shù)從甘藍(lán)型油菜柱頭cDNA文庫中鑒定出與SRK結(jié)合的靶蛋白——ARC1, 其在自交不親和信號傳遞過程中起正調(diào)控作用。Vanoosthuyse等[2]和Stone等[3]利用RNAi和反義抑制技術(shù)分別抑制琴葉擬南芥()和甘藍(lán)型油菜()的表達(dá), 以及在甘藍(lán)型油菜中過表達(dá)均只能部分打破自交不親和性。在擬南芥中,基因以假性遺傳因子存在, 向自交親和擬南芥中僅僅轉(zhuǎn)入琴葉擬南芥的SCR和SRK也能表現(xiàn)出強(qiáng)自交不親和性[4-6]。由此表明ARC1可能并非SRK唯一下游信號元件。

Elleman等[7]證明油菜柱頭乳突細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的鈣峰與后續(xù)花粉粒的水合相對應(yīng), Iwano等[8]在親和授粉后觀察到擬南芥乳突細(xì)胞胞質(zhì)鈣濃度變化, 在花粉水化后、花粉萌發(fā)前和花粉管穿過柱頭細(xì)胞壁這3個(gè)時(shí)段Ca2+濃度顯著上升, 胞質(zhì)Ca2+的急劇增加, 是由相同單倍型的SCR與SRK相互作用造成的, 表明Ca2+在調(diào)控柱頭應(yīng)答的信號傳導(dǎo)中起重要作用。Dearnaley等[9]測定了自交親和與自交不親和花粉授粉后在柱頭突觸細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞壁中的鈣離子流, 發(fā)現(xiàn)這些鈣離子流與接觸花粉粒細(xì)胞區(qū)域相關(guān), 只在特定的一部分區(qū)域形成。因此Ca2+可能介導(dǎo)授粉和SI信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。

鈣依賴蛋白激酶(calcium-dependent protein kinase, CDPK)已被廣泛證明參與植物的多種抗逆反應(yīng)[10-12]。目前報(bào)道, 植物CDPKs在與Ca2+結(jié)合后被激活, 從而磷酸化下游底物, 底物通過與CDPK的互作將Ca2+信號級聯(lián)放大并向下游傳導(dǎo), 進(jìn)而調(diào)控信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑下游基因的表達(dá), 調(diào)控植物逆境脅迫應(yīng)答等生物學(xué)過程。由于授粉過程中的自花花粉刺激柱頭產(chǎn)生SI信號傳導(dǎo)的過程, 類似于逆境刺激植物細(xì)胞產(chǎn)生Ca2+依賴性CDPKs的過程, 那么CDPKs是否有可能通過某種分子過程與自交不親和相聯(lián)系呢？本研究通過轉(zhuǎn)錄組測序分析甘藍(lán)自花和異花授粉后基因表達(dá)情況, 首次成功地篩選到1個(gè)受自花授粉誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)的基因, 它與擬南芥中參與植物逆境信號傳導(dǎo)的鈣依賴蛋白激酶基因高度同源, 命名為。然后經(jīng)克隆、序列分析、生物信息學(xué)、特異性表達(dá)和原核表達(dá)、亞細(xì)胞定位、啟動(dòng)子活性分析以及通過構(gòu)建酵母雙雜交cDNA文庫, 篩選與其互作的蛋白等深入探索, 證明該基因參與了柱頭響應(yīng)花粉刺激的分子過程, 初步提供一個(gè)聯(lián)系自交不親和性和植物抗逆性的“橋梁”蛋白質(zhì), 為甘藍(lán)SI的深入研究提供了新內(nèi)容。

1 材料與方法

1.1 材料

甘藍(lán)高代自交不親和系‘A4’和‘F1’由西南大學(xué)十字花科蔬菜研究所提供, 于2017年3月底至4月初, 選取長勢相同的‘A4’花蕾, 在開花當(dāng)天人工去雄, 用成熟的‘A4’和‘F1’花粉對‘A4’植株進(jìn)行自花和異花授粉。然后進(jìn)行2種方式取材, 一是分別選取自花、異花授粉0、15、30、60 min的柱頭, 立即取下置液氮中保存; 另一處理是同時(shí)取花蕾、花瓣、葉片、萼片、花藥和柱頭置液氮中保存?zhèn)溆谩Ａ硗膺x取甘藍(lán)‘A4’花蕾, 使用CloneMiner II cDNA文庫構(gòu)建試劑盒(Invitrogen公司, 美國)構(gòu)建cDNA文庫, 酵母質(zhì)粒小提試劑盒、各種引物合成及測序等均由上海生工生物工程有限公司完成。

1.2 SI甘藍(lán)自花、異花授粉后轉(zhuǎn)錄組測序及自花授粉相關(guān)特異序列的篩選

收集未授粉柱頭, 自花授粉15、30、60 min以及異花授粉15、30、60 min的柱頭, 并提取其總RNA,送北京百邁克公司用Illumina HiSeq高通量測序平臺測序分析, 測序類型為PE150, 構(gòu)建轉(zhuǎn)錄組文庫進(jìn)行建庫測序, 獲得轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。采用FPKM (Fragments Per Kilobase of transcript per Million fragments mapped)作為衡量轉(zhuǎn)錄本或基因表達(dá)水平的指標(biāo)。在差異表達(dá)基因檢測過程中, 將差異倍數(shù)Fold Change≥2且錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(False Discovery Rate) FDR<0.01作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)基因在不同授粉處理后的相對表達(dá)量, 篩選在自花授粉后表達(dá)差異明顯、異花授粉后變化趨勢不明顯的基因。

1.3 生物信息學(xué)分析

利用MEGA7軟件和NCBI網(wǎng)站(http://www. ncbi.nlm.nih.gov/)上的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫構(gòu)建BoCDPK14系統(tǒng)進(jìn)化樹; 利用在線工具ProtParam (https://web. expasy.org/protparam/)分析BoCDPK14蛋白質(zhì)的理化性質(zhì); 用ProtScale在線分析軟件預(yù)測蛋白疏水性/親水性; 通過Predict protein (https://www.predictprotein. org/signin)等軟件對CDS的氨基酸編碼序列進(jìn)行在線預(yù)測分析; 利用Bio-soft (http://www.bio-soft.net/ sms/index.html)軟件推導(dǎo)基因編碼的氨基酸序列; 從BRAD數(shù)據(jù)庫(http://brassicadb.org/brad/index. php)獲得基因啟動(dòng)子序列(起始密碼子上游2000 bp), 以F: 5￠-GCTCTAGTCATCGCCGGC-3￠和R: 5￠-TGTACAATTATAATGTTCTTGAAAACGT-3￠為引物擴(kuò)增該序列, 運(yùn)用快速克隆技術(shù)將目的片段連接到T載體上后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α, 經(jīng)菌液PCR篩選陽性克隆后送上海生工生物工程有限公司測序。利用PlantCARE (http:// bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)分析其啟動(dòng)子順式作用元件。

1.4 BoCDPK14基因全長及激酶域的克隆

根據(jù)目的基因編碼區(qū)3￠端和5￠端的保守序列, 以甘藍(lán)A4柱頭cDNA和gDNA為模板, 利用Kodaq 2X PCR MasterMix(abm), 以F: 5￠-ATGGGGAATTG CTGTGGAAC-3￠和R: 5￠-CTCTGCATCGCGATTAT TAGAA-3￠為引物擴(kuò)增基因全長。同時(shí)用NCBI網(wǎng)站和SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/)在線分析CDPK14蛋白保守結(jié)構(gòu)域。根據(jù)分析結(jié)果, 結(jié)合酵母表達(dá)載體pGBDT7序列設(shè)計(jì)引物/, 以擴(kuò)增BoCDPK14激酶結(jié)構(gòu)域序列(表1)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1×104mg L-1瓊脂糖凝膠電泳, 回收目的片段, 運(yùn)用快速克隆技術(shù)將目的片段連接到相應(yīng)載體上后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α, 經(jīng)菌液PCR篩選陽性克隆后送上海生工生物工程有限公司測序。

表1 基因克隆及定量PCR中的引物

1.5 原核表達(dá)

根據(jù)目的基因編碼區(qū)3￠端和5￠端的保守序列以及原核表達(dá)載體pGEX-4T-1的序列, 用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)引物/(表1), 以甘藍(lán)A4柱頭cDNA為模板擴(kuò)增全長編碼區(qū)序列, PCR體系含8.5 μL ddH2O、12.5 μL Kodaq 2X PCR MasterMix緩沖液、上下游引物各1 μL和模板2 μL; 反應(yīng)程序?yàn)?4℃ 3 min; 94℃ 30 s, 60℃ 30 s, 72℃ 96 s, 40個(gè)循環(huán); 72℃延伸5 min, 回收目的片段, 運(yùn)用快速克隆技術(shù)將目的片段連接到pGEX- 4T-1載體上后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α, 經(jīng)菌液PCR篩選陽性克隆后送生工生物工程(上海)有限公司測序。將測序正確的原核表達(dá)菌株擴(kuò)大培養(yǎng)后抽提重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株Transetta (DE3), 用引物/進(jìn)行PCR檢測, 將陽性轉(zhuǎn)化子單克隆按1∶100擴(kuò)大培養(yǎng), 取500 μL菌液接種于50 mL含100 μg mL-1氨芐抗性LB培養(yǎng)基中, 搖床37℃, 250 r min-1振蕩培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.6~0.8,加入IPTG至終濃度為1 mmol L-1, 16℃過夜誘導(dǎo), 誘導(dǎo)結(jié)束后, 收集誘導(dǎo)的菌體, 將所有的樣品保存于-80℃, 用于表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE電泳檢測。

1.6 亞細(xì)胞定位表達(dá)分析

根據(jù)目的基因全長編碼區(qū)序列和Pro Ligation-Free Cloning Kit (abm)快速克隆技術(shù)原理以及GFP融合表達(dá)載體PAN580序列設(shè)計(jì)引物和(表1), 利用PCR技術(shù)擴(kuò)增得到目的基因的片段。將擴(kuò)增產(chǎn)物與PAN580載體連接, 構(gòu)建GFP融合蛋白的瞬時(shí)表達(dá)載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α, 篩選陽性克隆后送測序, 測序正確后, 提取質(zhì)粒, 將重組質(zhì)粒以及空載質(zhì)粒用PEG法轉(zhuǎn)入擬南芥原生質(zhì)體, 培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)16 h后, 在激光共聚焦顯微鏡下觀察GFP綠色熒光以研究目的基因的亞細(xì)胞定位情況。

1.7 組織特異性表達(dá)分析

參照RNA提取試劑盒RNAprep Pure Plant Kit說明書提取甘藍(lán)柱頭、葉片、花藥等組織的RNA, 參照TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA, 于–20oC保存?zhèn)溆?。以作為?nèi)參(表1), 根據(jù)獲得的基因全長序列設(shè)計(jì)熒光定量PCR特異性引物:、(表1), 以葉片、花蕾、萼片、花瓣、花粉和柱頭組織的cDNA為模板, 參照SYBR Premix Ex說明書, 用7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀擴(kuò)增。同時(shí)以未授粉柱頭, 自花授粉15、30和60 min和異花授粉15、30和60 min的柱頭cDNA為模板,為內(nèi)參, 在熒光定量PCR儀上對目的基因進(jìn)行熒光定量PCR。反應(yīng)體系為20 μL, 含2×SYBR Premix Ex10 μL、引物各1 μL、cDNA模板1 μL、超純水至7 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?5oC預(yù)變性1 min; 95oC 15 s, 58oC 15 s, 72oC 30 s共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)試驗(yàn)設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù), 采用2–ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)水平。

1.8 甘藍(lán)酵母雙雜交篩選

1.8.1 誘餌蛋白毒性及自激活活性檢測 將BoCDPK14基因激酶結(jié)構(gòu)域克隆到pGBDT7載體上作為誘餌, 所用引物為/(表1), 將誘餌載體重組質(zhì)粒pGBDT7- CDPK14D和pGBDT7空質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化酵母Y2HGold感受態(tài)細(xì)胞, 涂布于SD-Trp平板上, 30℃倒置培養(yǎng)3~5 d, 以轉(zhuǎn)化pGBDT7空質(zhì)粒的平板作為對照, 觀察菌落生長狀況。若轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒的菌落明顯比空質(zhì)粒小, 說明重組質(zhì)粒有毒性。

將重組質(zhì)粒pGBDT7-CDPK14D與pGADT7空載共轉(zhuǎn)化酵母Y2HGold感受態(tài)細(xì)胞, 轉(zhuǎn)化后的菌液涂布在SD/?Leu/?Trp/?His平板上, 30℃倒置培養(yǎng)3~5 d, 以共轉(zhuǎn)陰性對照pGBDT7-Lam×pGADT7-T和陽性對照pGBDT7-p53×pGADT7-T平板作為對照,觀察菌落顯色情況。

1.8.2 文庫陽性克隆的初步鑒定、測序和生物信息學(xué)分析 根據(jù)制造商酵母方案手冊(Invitrogen), 使用Clontech雙雜交系統(tǒng)進(jìn)行酵母雙雜交篩選, 將共轉(zhuǎn)化后的酵母感受態(tài)細(xì)胞涂布于TDO (SD/?Leu/ ?Trp/?His)固體培養(yǎng)基上, 30℃倒置培養(yǎng)3~5 d, 觀察菌落在TDO平板的生長情況, 參考酵母質(zhì)粒提取試劑盒說明書提取質(zhì)粒pGADT7載體, 然后以提取的酵母質(zhì)粒為模板, 以T75￠-TAATACGACTCACTA TAGGG-3￠和3￠AD 5￠-AGATGGTGCACGATGCACA G-3￠為引物進(jìn)行RCR擴(kuò)增, 將膠回收產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司測序。將測得的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對, 找到同源序列, 統(tǒng)計(jì)序列長度、基因登錄號、基因注釋等信息。

1.8.3 點(diǎn)對點(diǎn)回轉(zhuǎn)陽性驗(yàn)證 從陽性克隆中選擇基因作為候選獵物, 將去除信號肽(1~31 aa)和跨膜結(jié)構(gòu)域(580~960 aa)的基因序列BoGLR2.8連接到pGADT7載體上, 所用引物為:GLR2.8-AD- F/GLR2.8-AD-R (表1), 將其與pGBDT7-CDPK14D質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化Y2HGold感受態(tài)細(xì)胞, 設(shè)立陰性對照(pGBDT7-Lam×pGADT7-T)和陽性對照(pGBDT7- p53×pGADT7-T), 將共轉(zhuǎn)化后的酵母Y2HGold細(xì)胞涂布于DDO (SD/?Leu/?Trp)和TDO(SD/?Leu/? Trp/?His)平板上, 30℃倒置培養(yǎng)3~5 d, 挑取DDO平板上的單菌落進(jìn)行PCR檢測后, 將DDO平板上的陽性克隆菌斑接種至四缺培養(yǎng)基QDO (SD/?Leu/? Trp/?His/?Ade/X/A)上, 30℃倒置培養(yǎng)3~5 d, 觀察其生長情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 BoCDPK14轉(zhuǎn)錄水平分析

根據(jù)甘藍(lán)自花和異花授粉0~60 min的柱頭轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析, 成功地篩選到1個(gè)受自花授粉誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)的基因, 它與擬南芥中參與植物逆境信號傳導(dǎo)的鈣依賴蛋白激酶基因高度同源[13], 命名為。基因在未授粉時(shí)相對表達(dá)量為0.03, 自花授粉60 min后達(dá)到最高, 為3.82, 顯著上調(diào)表達(dá); 而在異花授粉15、30、60 min后其表達(dá)量分別約為0.62、0.76、0.72, 其表達(dá)量趨于穩(wěn)定(圖1)。上述結(jié)果表明參與植物逆境反應(yīng)的CDPK也可能參與了SI反應(yīng)。

2.2 BoCDPK14的克隆

gDNA PCR產(chǎn)物大小約2200 bp, 柱頭cDNA PCR產(chǎn)物約1600 bp (圖2)。PCR擴(kuò)增所獲得的gDNA序列長度為2214 bp, cDNA 序列長度為1599 bp, 包含了完整的編碼框。

由于使用同一對引物同源克隆得到cDNA和gDNA序列相差615 bp, 所以本研究進(jìn)一步對兩者進(jìn)行了Clustal軟件比對分析, 發(fā)現(xiàn)該基因由8個(gè)外顯子(分別為504、124、144、153、116、168、231和159 bp)和7個(gè)內(nèi)含子(分別為91、68、97、89、86、97和87 bp)組成?；虻拈_放閱讀框(ORF)全長為1599 bp, 編碼532個(gè)氨基酸殘基, 相對分子質(zhì)量為60.4 kD, 理論等電點(diǎn)(pI)為6.73, 不穩(wěn)定系數(shù)為34.02, 屬于穩(wěn)定蛋白。平均親水性系數(shù)為-0.396, 推測為親水性蛋白。由圖3可以看出, 在氨基酸組成中, 亮氨酸、賴氨酸和谷氨酸出現(xiàn)頻率最高, 分別占氨基酸總數(shù)的8.8%、8.6%和8.6%。帶負(fù)電荷的氨基酸殘基(Asp+Glu)總數(shù)為83個(gè), 帶正電荷的氨基酸殘基(Arg+Lys)為81個(gè)。這種偏酸的親水蛋白, 正是SI反應(yīng)和抗逆反應(yīng)所需要的。

圖1 甘藍(lán)柱頭內(nèi)響應(yīng)自花和異花授粉后BoCDPK14表達(dá)模式

SP: 自花授粉; CP: 異花授粉。

SP: self-pollination; CP: cross-pollination.

圖2 甘藍(lán)BoCDPK14基因cDNA和gDNA序列擴(kuò)增

2.3 BoCDPK14的結(jié)構(gòu)分析

通過Predict protein等軟件對CDS的氨基酸編碼序列進(jìn)行在線預(yù)測分析, 該蛋白含有4個(gè)N-糖基化位點(diǎn)、3個(gè)cAMP或cGMP依賴性蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)、8個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)、15個(gè)酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)、4個(gè)N-肉豆蔻?；稽c(diǎn)、1個(gè)蛋白激酶ATP結(jié)合區(qū)、1個(gè)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性位點(diǎn)、4個(gè)EF-hand鈣結(jié)合結(jié)構(gòu)域(圖3), 而已報(bào)道的自交不親和信號傳導(dǎo)元件中, SRK屬于蛋白激酶類, 其C端具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性位點(diǎn), 是研究SI信號傳導(dǎo)的關(guān)鍵位點(diǎn)。

Ca2+結(jié)合的核心區(qū)域分別位于第369~381、第404~416、第440~452、第476~488位氨基酸殘基, 其特點(diǎn)是由12個(gè)氨基酸殘基組成的α-螺旋環(huán)結(jié)構(gòu), 其中的第1、第3、第6和第12位氨基酸較為保守(圖4-A)。在這12個(gè)殘基的前一位氨基酸(第0位氨基酸)為疏水性氨基酸殘基, 由第1、第3、第5、第7、第9和第12位氨基酸殘基分別按照X、Y、Z、-Y、-X和-Z空間排列形成五邊形雙錐結(jié)構(gòu), 而第12位保守的Asp或Glu的2個(gè)氧原子與Ca2+以雙齒配體的方式結(jié)合, 使EF-hand結(jié)構(gòu)域構(gòu)象改變, 最終導(dǎo)致靶蛋白的激活或者失活[14-16], 說明BoCDPK14可能參與Ca2+信號調(diào)控。

利用Swiss-modle在線軟件對BoCDPK14蛋白的三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測, 得到該蛋白的三維結(jié)構(gòu)(圖4-B)。利用MEGA7軟件構(gòu)建BoCDPK14遺傳進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)BoCDPK14與BrCDPK14親緣關(guān)系最近(圖5)。

2.4 BoCDPK14基因的響應(yīng)元件

利用 BRAD數(shù)據(jù)庫及PlantCARE啟動(dòng)子分析軟件在位于基因起始密碼子上游2000 bp的核苷酸序列中預(yù)測到脅迫反應(yīng)、激素反應(yīng)、代謝調(diào)節(jié)等多種順式作用元件(表2), 表明基因除了響應(yīng)授粉刺激, 還可能響應(yīng)包括逆境在內(nèi)的其他多種信號。

圖3 甘藍(lán)BoCDPK14 CDNA結(jié)構(gòu)圖及其推導(dǎo)的氨基酸序列

下劃直線為酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn), 虛線框?yàn)榈鞍准っ窩磷酸化位點(diǎn), 橢圓為N-糖基化位點(diǎn), 實(shí)線框?yàn)閏AMP或cGMP依賴性蛋白激酶磷酸化位點(diǎn), 雙線框表示N-肉豆蔻酰化位點(diǎn), 圓點(diǎn)為EF-hand鈣結(jié)合結(jié)構(gòu)域, 雙線表示蛋白激酶ATP結(jié)合區(qū), 星星表示絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性位點(diǎn)。

The underline show protein kinase II phosphorylation site; the dashed box show protein kinase C phosphorylation site; the oval show N-glycosylation site; the box show cAMP or cGMP-dependent protein kinase phosphorylation site; the double box show N-myristoylation site; the dot show the EF-hand calcium binding domain; double line show protein kinase ATP binding domain; stars show serine/threonine protein kinase active site.

圖4 BoCDPK14 蛋白Ca2+結(jié)合核心區(qū)域(A)和BoCDPK14蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(B)

A圖下排數(shù)字表示對這12個(gè)氨基酸殘基的編號。

The figures at lower part in Fig. A are the serial number of the 12 amino acid residues of the core area of calcium ion binding.

圖5 BoCDPK14與其他物種CDPK14氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.5 甘藍(lán)BoCDPK14的原核表達(dá)和亞細(xì)胞定位

將GST-BoCDPK14重組菌株擴(kuò)大培養(yǎng), 并在16℃過夜誘導(dǎo)表達(dá), 誘導(dǎo)結(jié)果電泳檢測如圖6。與未誘導(dǎo)的GST-BoCDPK14 (泳道1)相比, 在80 kD左右, 誘導(dǎo)表達(dá)后的泳道2多出1條帶, 其蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量與GST-BoCDPK14估計(jì)值相符。其中pGEX-4T-1空載體表達(dá)約26 kD的蛋白, BoCDPK14預(yù)測分子大小約為60.4 kD, 二者融合約為86 kD的蛋白, 表明GST-BoCDPK14融合蛋白在原核細(xì)胞中誘導(dǎo)表達(dá)成功。通過構(gòu)建GFP-BoCDPK14融合表達(dá)載體, 并轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)體細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)GFP蛋白分布在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中, 而GFP-BoCDPK14融合蛋白綠色熒光明顯定位在細(xì)胞質(zhì)(圖7), 表明該親水性蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)。以上研究結(jié)果表明BoCDPK14可能是細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的活性蛋白, 而該蛋白質(zhì)的胞質(zhì)親水特性正是參與SI和抗逆反應(yīng)所需要的。

表2 BoCDPK14基因上游調(diào)控區(qū)順式作用元件

圖6 BoCDPK14蛋白的原核表達(dá)

M: 蛋白相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1: BoCDPK14-GST未誘導(dǎo)蛋白; 2: BoCDPK14-GST誘導(dǎo)蛋白; 3: BoCDPK14-GST純化蛋白; 4: GST蛋白。

M: marker; 1: uninduced control; 2: BoCDPK14-GST fusion protein; 3: BoCDPK14-GST purified protein; 4: GST protein.

2.6 甘藍(lán)BoCDPK14基因的表達(dá)分析

在甘藍(lán)柱頭、花粉、花蕾、花瓣和葉片中表達(dá), 且柱頭中的表達(dá)量低于花粉(圖8-B)。對不同授粉處理后柱頭中的qRT-PCR分析(圖8-A)表明,在自花授粉0~60 min持續(xù)上調(diào)表達(dá), 在異花授粉過程中變化不大。自花授粉60 min后的相對表達(dá)量約為16.09, 約為授粉0 min的13.5倍, 而異花授粉60 min后的相對表達(dá)量約為5.36, 前者明顯高于后者且相差3倍, 說明自花授粉能顯著誘導(dǎo)該基因的表達(dá)。該結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果一致, 說明這個(gè)參與植物逆境信號傳導(dǎo)的基因也可能參與甘藍(lán)SI反應(yīng)過程。

圖7 BoCDPK14-GFP融合蛋白的亞細(xì)胞定位

綠色表示GFP 蛋白在激光共聚焦顯微鏡下所發(fā)的綠色熒光。

GFP protein showed the green fluorescence under confocal laser scanning microscope.

圖8 甘藍(lán)柱頭內(nèi)BoCDPK14響應(yīng)自花和異花授粉后表達(dá)模式(A)和BoCDPK14基因在甘藍(lán)不同組織中的表達(dá)分析(B)

SP: 自花授粉; CP: 異花授粉。SP: self-pollination; CP: cross-pollination.

2.7 甘藍(lán)BoCDPK14功能域分析與截短體構(gòu)建

NCBI保守域預(yù)測表明, BoCDPK14分為4個(gè)典型的結(jié)構(gòu)域, 從N端到C端依次為N-末端可變域、催化域(激酶域)、連接域(自抑制域)和C-末端類鈣調(diào)結(jié)構(gòu)域(圖9)?？勺冇虬被衢L度一般在20~200個(gè)不等, 氨基酸水平同源性不高, 保守性差, 多數(shù)CDPK的N端含有豆蔻酰化位點(diǎn), 可被豆蔻?；蜃貦磅；４呋蚓哂械湫偷腟er/Thr蛋白激酶保守序列, 同源性較高, 該區(qū)域突變會喪失催化活性。CDPK連接域由20~30個(gè)氨基酸殘基組成, 當(dāng)無Ca2+或Ca2+低于某一濃度時(shí), 該區(qū)域結(jié)合催化區(qū)的激酶結(jié)構(gòu)域從而抑制其活性。Ca2+結(jié)合區(qū)即類鈣調(diào)結(jié)構(gòu)域, 包含4個(gè)可與Ca2+結(jié)合的EF手型結(jié)構(gòu), 能夠與Ca2+結(jié)合, 引起蛋白結(jié)構(gòu)變化, 解除連接域?qū)っ竻^(qū)的抑制作用從而激活CDPK的活性[17-18]。為了確定與CDPK14激酶域相互作用的蛋白, 擴(kuò)增CDPK14截短體的編碼序列D, 利用分子克隆技術(shù)將D序列克隆到pGBDT7載體中。

圖9 典型鈣依賴蛋白激酶(CDPK)結(jié)構(gòu)

V: 可變域; J: 連接域; EF: EF-hand 結(jié)構(gòu)域。

V: variable domain; J: junction domain; EF: EF-hand domain.

2.8 重組誘餌載體毒性及自激活檢測

將pGBDT7-CDPK14D和pGBDT7空質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化Y2Hgold酵母感受態(tài)細(xì)胞, 涂布于SD?Trp平板上, 30℃倒置培養(yǎng)3~5 d。結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒在平板上均可以長出菌落, 且大小和轉(zhuǎn)化pGBDT7空質(zhì)粒的酵母菌落大小一致, 表明重組質(zhì)粒沒有毒性。將pGBDT7-CDPK14D與pGADT7空載共轉(zhuǎn)化酵母Y2HGold感受態(tài)細(xì)胞, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有陽性對照轉(zhuǎn)化的菌落在SD/?Leu/?Trp/?His平板上生長, 其余無斑生長, 說明表達(dá)的重組蛋白沒有自激活能力。

2.9 甘藍(lán)CDPK14激酶結(jié)構(gòu)域與GLR2.8d蛋白相互作用

將酵母文庫篩選出的BoGLR2.8基因連接到pGADT7載體上, 與CDPK14D-BD重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化酵母Y2Hgold感受態(tài)細(xì)胞, 分別涂在DDO和TDO固體培養(yǎng)基上, 30℃倒置培養(yǎng)3~5 d, 固體平板有菌落生成(圖10)。通過PCR檢測, 在同一個(gè)單克隆中可以同時(shí)擴(kuò)增出2個(gè)目的片段, 說明重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞。為進(jìn)一步檢測蛋白質(zhì)之間的相互作用, 將SD/?Leu/?Trp平板上的單菌落轉(zhuǎn)移至SD/?Leu/?Trp/?His/?Ade/X-α-gal/AbA平板上, 30℃倒置培養(yǎng)3~5 d, 發(fā)現(xiàn)pGBDT7-CDPK14D× pGADT7-GLR2.8d和陽性對照能生長且呈藍(lán)色, 而陰性對照菌落不能生長。研究已發(fā)現(xiàn)GLR參與了自交不親和反應(yīng)[19], 而BoCDPK14激酶結(jié)構(gòu)域在酵母中與BoGLR2.8d(XP_013635321.1)之間存在相互作用(圖10), 進(jìn)一步表明CDPK14也參與了甘藍(lán)SI反應(yīng)。

圖10 酵母雙雜交驗(yàn)證CDPK14D和GLR2.8d之間的相互作用

第1排表示pGADT7-BoGLR2.8d×pGBDT7-BoCDPK14D; 第2排表示陽性對照(pGADT7-T×pGBDT7-p53); 第3排表示陰性對照(pGADT7-T×pGBDT7-Lam)。

The first row indicates pGADT7-BoGLR2.8d×pGBDT7-BoCDPK14D; the second row indicates positive control (pGADT7-T×pGBDT7-p53); the third row indicates negative control (pGADT7-T×pGBDT7-Lam). DDO: SD/?Leu/?Trp; TDO: SD/?Leu/?Trp/-His; QDO/X/A: SD/?Leu/?Trp/?His/?Ade/X-α-gal/AbA.

3 討論

本研究基于以自交不親和甘藍(lán)經(jīng)不同授粉處理后的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù), 成功地篩選到1個(gè)受自花授粉誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)的基因, 它與擬南芥中參與植物逆境信號傳導(dǎo)的鈣依賴蛋白激酶基因高度同源, 命名為。BoCDPK14-GFP融合蛋白綠色熒光主要出現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)區(qū)域?；虻膯?dòng)子區(qū)域含有脅迫反應(yīng)、激素反應(yīng)、代謝調(diào)節(jié)等多種順式作用元件, 表明基因可能參與調(diào)控復(fù)雜的生物反應(yīng)過程。Vanoosthuyse等[2]發(fā)現(xiàn)鈣調(diào)素CaM1和CaM2與iSRK (SRK胞內(nèi)激酶域)能發(fā)生相互作用。許俊強(qiáng)等[20]研究發(fā)現(xiàn)甘藍(lán)花粉管鈣調(diào)蛋白CaM12與iSRK相互作用, 而缺失EF-hand模體的鈣調(diào)蛋白均不能與iSRK相互作用。本文通過蛋白結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn), BoCDPK14含有4個(gè)能與Ca2+結(jié)合的EF-hand模體,推測BoCDPK14可能通過調(diào)控柱頭中Ca2+濃度參與SI過程。

Sheen等[21]研究發(fā)現(xiàn)CDPK可激活脅迫誘導(dǎo)的啟動(dòng)子, 以促進(jìn)逆境蛋白的表達(dá), 說明CDPKs可能在逆境脅迫信號中起正調(diào)節(jié)因子的作用, 以調(diào)控植物中脅迫信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)。Botella等[22]發(fā)現(xiàn)在機(jī)械刺激等環(huán)境脅迫的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中, CDPKs發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。同時(shí)鈣依賴蛋白激酶屬于蛋白激酶類, 已報(bào)道的自交不親和信號傳導(dǎo)元件中SRK屬于蛋白激酶類, SRK在自交不親和反應(yīng)過程中作為雌性決定因子, 在花粉與柱頭的反應(yīng)中具有重要作用[23]。自交不親和反應(yīng)的本質(zhì)是花粉與柱頭識別及信號傳導(dǎo)的過程, 而Ca2+作為第二信使, 在植物細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮重要作用[24]。已有研究表明, 植物體內(nèi)鈣信號的傳遞主要是通過鈣依賴蛋白激酶(CDPK)來完成[25]。Kunz等[26]發(fā)現(xiàn)來自花粉管中的鈣依賴蛋白激酶可激活花柱傳導(dǎo)組織中的S-核糖核酸酶, 該酶通過催化RNA的降解來抑制花粉萌發(fā)。Iwano等[19]通過觀察自交不親和擬南芥發(fā)現(xiàn)在用相同單倍型的SCR/SP11花粉授粉后, 柱頭乳突細(xì)胞中Ca2+濃度顯著上升, 花粉不能正常萌發(fā)生長, 表現(xiàn)自交不親和性, 用不同單倍型的SCR/SP11花粉授粉后, 柱頭乳突細(xì)胞中Ca2+濃度上升不明顯。當(dāng)用谷氨酸通道抑制劑AP-5處理柱頭表面時(shí), 胞內(nèi)Ca2+濃度無明顯上升, 說明谷氨酸通道調(diào)控的鈣離子流是自交不親和反應(yīng)所必需的。以上結(jié)果表明可能存在Ca2+信號途徑參與調(diào)控自交不親和性。

有研究表明, 擬南芥AtGLRs具有介導(dǎo)Ca2+跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)和調(diào)節(jié)胞內(nèi)Ca2+動(dòng)態(tài)平衡, 調(diào)控花粉管的生長, 以及感應(yīng)和傳遞外源與內(nèi)源信號的多重功能, 在煙草和擬南芥中發(fā)現(xiàn)GLRs利用D-絲氨酸(D-serine)作為配體介導(dǎo)Ca2+梯度, 最終影響花粉管生長及其形態(tài)建成, 在敲除絲氨酸消旋酶基因的擬南芥突變體雌蕊中野生型植物花粉管伸長生長發(fā)生缺陷并伴以GLR1.2和GLR3.7的Ca2+通道活性降低[27-34]。說明高等植物GLR家族成員需要特定的配體物質(zhì)以開啟其Ca2+通道功能。本研究通過酵母雙雜交試驗(yàn)證明BoCDPK14激酶結(jié)構(gòu)域能與BoGLR2.8d蛋白相互作用。BoCDPK14蛋白可能通過Ca2+結(jié)合區(qū)結(jié)合Ca2+, 激活CDPK激酶活性, 使其與谷氨酸受體通道蛋白BoGLR2.8d相結(jié)合, 促使柱頭內(nèi)Ca2+濃度經(jīng)谷氨酸受體通道(GLR)內(nèi)流而顯著上升, 使花粉不能正常萌發(fā)生長, 最終導(dǎo)致自交不親和反應(yīng)的發(fā)生。

基因在自花授粉過程中0~60 min持續(xù)上調(diào)表達(dá), 在異花授粉過程中變化不大。而甘藍(lán)自交不親和反應(yīng)主要在開花后30~60 min之內(nèi)完成[35], 進(jìn)一步表明該基因可能參與自花授粉后花粉與柱頭相互作用的復(fù)雜反應(yīng)過程, 可能跟自花授粉后相同單倍型的SRK與SCR/SP11特異識別后的Ca2+濃度的顯著上升有關(guān), 推測該基因可能作為Ca2+信號元件參與甘藍(lán)自花授粉后的反應(yīng)過程。由于該基因是已知的參與抗逆反應(yīng)的基因, 所以本文初步提供一個(gè)聯(lián)系自交不親和性和植物抗逆性的“橋梁”蛋白質(zhì), 為SI的深入研究提供了新內(nèi)容。

4 結(jié)論

從甘藍(lán)轉(zhuǎn)錄組文庫篩選并克隆1個(gè)受自花授粉誘導(dǎo)顯著上調(diào)表達(dá)的基因, 其開放閱讀框?yàn)?599 bp, 編碼533個(gè)氨基酸, 編碼蛋白大小約為60.4 kD。BoCDPK14蛋白分布于細(xì)胞質(zhì), 在柱頭中的表達(dá)量低于花粉中。該基因在自花授粉0~60 min持續(xù)上調(diào)表達(dá), 在異花授粉過程中表達(dá)量變化并不明顯。BoCDPK14蛋白可能通過結(jié)合Ca2+激活CDPK激酶, 使其與谷氨酸受體通道蛋白BoGLR2.8d結(jié)合, 促使柱頭內(nèi)Ca2+濃度顯著上升, 花粉不能正常萌發(fā)生長, 推測該蛋白是參與SI相關(guān)過程的新蛋白。

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Cloning and analysis ofin self-incompatibility

BAI Xiao-Jing1,**, LIAN Xiao-Ping2,**, WANG Yu-Kui1, ZHANG He-Cui1, LIU Qian-Ying1, ZUO Tong- Hong1, ZHANG Yi-Zhong1, XIE Qin-Qin1, HU Deng-Ke1, REN Xue-Song2, ZENG Jing3, LUO Shao-Lan1, PU Min1, and ZHU Li-Quan1,*

1College of Agronomy and Biotechnology, Southwest University, Chongqing 400716, China;2College of Horticulture and Landscape Architecture, Southwest University, Chongqing 400716, China;3School of Life Advanced Agriculture Bioengineering, Yangtze Normal University, Chongqing 408100, China

self-incompatibility (SI) is the reaction of rejection or inhibition of stigma to pollens from the same haplotype. Calcium-dependent protein kinase (CDPK) is an important component of plants involved in resistance to stress signals. In this study, we identified an up-regulated gene namedbased on the stigma transcriptome data in 0–60 min self-pollination. The gene was highly homologous to the calcium dependent protein kinase gene involved in stress signaling in.gene contained an open reading frame (ORF) with the length of 1599 bp, encoding a protein with the length of 533 amino acid residues. It was a hydrophilic protein expressed in cytoplasm, and could be induced to express a 60.4 kD protein in the cytoplasm ofTransetta (DE3). It was suggested that BoCDPK14 is an active cytoplasmic protein. The 2000 bp upstream oftranslation initial codon contained elements for responses to stress, hormone, and metabolic regulation.was expressed in stigma, pollen, flower bud, petal, and leaf, with lower expression level in stigma than in pollen. The results of qRT-PCR revealed thatmRNA expression level after self- and cross-pollinations for 0 min to 60 min was consistent with that of RNA-seq data. The interaction between BoCDPK14 protein kinase domain and glutamate receptor channel protein BoGLR2.8dwas identified by yeast two-hybrid, suggesting thatmight be a novel protein involved in SI reaction. These results suggest that BoCDPK14 may act as a Ca2+signal element to participate the process of response to pollen stimulation in the stigma of, which provides a new insight into the further research and utilization of self-incompatibility of.

;gene; yeast two-hybrid; self-pollination; self-incompatibility

本研究由國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31572127)和西南大學(xué)基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(XDJK2017D073)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31572127) and the Fundamental Research Fund of Southwest University (XDJK2017D073).

朱利泉, E-mail: zhuliquan@swu.edu.cn, Tel: 023-68250794

**同等貢獻(xiàn)(Contributed equally to this work)

E-mail: xiamoyanyu33@163.com

2019-03-15;

2019-06-12;

2019-07-09.

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.s.20190705.1347.012.html

10.3724/SP.J.1006.2019.94040