余光書　林焱斌　許宏濱　李杰輝　張壽雄

【摘 要】目的：通過定量觀察補(bǔ)骨顆粒對大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)的影響，探討補(bǔ)腎活血中藥對軟骨細(xì)胞的作用機(jī)制。方法：將軟骨細(xì)胞經(jīng)補(bǔ)骨顆粒含藥血清傳代培養(yǎng)后通過定量蛋白質(zhì)組學(xué)串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行檢測，使用Maxquant（v1.5.2.8）進(jìn)行檢索。選擇UniProt-GOA數(shù)據(jù)庫注釋工具對差異蛋白進(jìn)行基因功能聚類GO分析;采用KEGG在線服務(wù)工具KAAS對提交的蛋白進(jìn)行注釋，之后通過KEGG mapper將注釋過的蛋白匹配入數(shù)據(jù)庫相應(yīng)的通路中進(jìn)行檢索分析;使用預(yù)測亞細(xì)胞定位的軟件wolfpsort對所提交的蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位注釋。結(jié)果：通過數(shù)據(jù)庫檢索，補(bǔ)骨顆粒含藥血清及空白血清干預(yù)軟骨細(xì)胞后共鑒定到5028個蛋白質(zhì)，包含25 423個肽段，其中4297個蛋白質(zhì)包含定量信息。以1.3倍為變化閾值，t檢驗(yàn)中P < 0.05為標(biāo)準(zhǔn)，空白血清組中163個蛋白表達(dá)發(fā)生上調(diào)，188個蛋白表達(dá)發(fā)生下調(diào);補(bǔ)骨顆粒含藥血清干預(yù)后有164個蛋白表達(dá)發(fā)生上調(diào)，58個蛋白表達(dá)發(fā)生下調(diào)。其中，具有生物學(xué)信息的目標(biāo)差異蛋白有腺苷酸轉(zhuǎn)位酶1、熱休克蛋白27、肌漿/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣ATP酶1、鈉/鉀轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶、果糖二磷酸醛縮酶A、3-磷酸甘油醛脫氫酶、磷酸甘油酸變位酶1、β-烯醇化酶、L-乳酸脫氫酶、糖原合成酶、肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1。結(jié)論：補(bǔ)骨顆粒能夠影響軟骨細(xì)胞的腺苷酸轉(zhuǎn)位酶1、熱休克蛋白27、醛縮酶A、β-烯醇化酶及肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1等表達(dá)，對于揭示軟骨細(xì)胞的凋亡機(jī)制具有重要意義。

【關(guān)鍵詞】 補(bǔ)骨顆粒;蛋白質(zhì)組學(xué);含藥血清;軟骨細(xì)胞;細(xì)胞凋亡;大鼠

【ABSTRACT】Objective：By quantitatively observing the effects of Bugu Keli（補(bǔ)骨顆粒）on the?expression of protein in knee joint chondrocyte of rats，to explore the mechanism of medicinals of nourishing kidney and activating the circulation of blood.Methods：Chondrocytes were subcultured in medicated serum with Bugu Keli and detected by quantitative proteomics tandem mass spectrometry tagging technology.Maxquant（v1.5.2.8）was used to retrieve.UniProt-GOA database annotation tool was selected to perform gene function clustering GO analysis of differentially expressed proteins;KEGG online service tool KAAS was used to annotate the submitted proteins，and then KEGG mapper was used to match the annotated proteins into the corresponding pathways in the database for retrieval and analysis.Wolfps was used to predict subcellular localization.Results：A total of 5028 proteins，including 25 423 peptide segments were identified after the intervention of medicated serum and blank serum on chondrocyte.Among them，4297 proteins contained quantitative information.With 1.3 times as the change threshold and P < 0.05 as the standard in the t test，163 protein expressions were up-regulated and 188 protein expressions were down-regulated in the blank serum group.One hundred and sixty-four protein expressions were up-regulated and 58 protein expressions were down-regulated after the intervention of the drug-containing serum.Among them，the target differential proteins with biological information are adenylate translocatase 1，heat shock protein 27，Sarcoplasmic/endoplasmic reticulum calcium ATPase 1，sodium/potassium transporter ATPase，fructose diphosphate aldolase A，3-phosphate glyceraldehyde dehydrogenase，phosphoglycerol mutase 1，β-enolase，L-lactate dehydrogenase，glycogen synthase，and carnitine palmitoyltransferase 1.Conclusion：Bugu Keli can affect the expression of adenylate transposase 1，heat shock protein 27，aldolase A，β-enolase and carnitine palmitoyltransferase 1?in chondrocyte，which is of great significance in revealing the apoptotic mechanism of chondrocyte.

【Keywords】 Bugu Keli（補(bǔ)骨顆粒）;proteomics;medicated serum;chondrocyte;apoptosis;rats

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是一種以膝關(guān)節(jié)軟骨退行性變?yōu)橹饕±硖卣鞯穆怨顷P(guān)節(jié)疾病。目前有研究認(rèn)為，軟骨細(xì)胞的代謝紊亂、衰老及凋亡是KOA的主要發(fā)病機(jī)制，阻止或延緩軟骨細(xì)胞凋亡是防治骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）的有效途徑;但是具體作用機(jī)制仍不明確，也缺乏特效治療藥物[1-2]。近年來，隨著細(xì)胞衰老及凋亡機(jī)制研究的不斷深入，以及蛋白質(zhì)組學(xué)的不斷發(fā)展，應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究疾病機(jī)制越來越受到重視。其中串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽（TMT）是目前主流的定量蛋白標(biāo)記技術(shù)，不僅定量結(jié)果重復(fù)性高，而且可以定位線粒體蛋白、膜蛋白和核蛋白等，是目前研究疾病發(fā)生機(jī)制的重要手段。筆者基于既往臨床觀察發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)骨顆粒能夠有效預(yù)防KOA發(fā)展進(jìn)程，因此擬應(yīng)用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)分析補(bǔ)骨顆粒對軟骨細(xì)胞的作用機(jī)制，以期為進(jìn)一步研究OA的防治機(jī)制提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 成年清潔型SD大鼠40只，體質(zhì)量（180±20）g，雌雄各半，動物許可證號SCXK 2016-0002，由福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及藥物 膠原酶Ⅱ（編號C8150）（北京市普京康利科技有限公司）;DMEM培養(yǎng)基（編號180-500）、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%的胰蛋白酶（編號TE2004Y）、胎牛血清（編號TBD11HT）（北京孚博生物科技有限公司）;軟骨細(xì)胞（武漢普諾賽生命科技有限公司）;補(bǔ)骨顆粒（廈門大學(xué)附屬福州第二醫(yī)院藥劑科）。

2 方 法

2.1 藥物制備 補(bǔ)骨顆粒藥物組成：骨碎補(bǔ)20 g、鹿銜草12 g、淫羊藿12 g、潞黨參15 g、茯苓20 g、三七3 g、川牛膝9 g、當(dāng)歸9 g、川芎6 g、女貞子15 g、枸杞子9 g、生地黃15 g、甘草3 g。原藥材由四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展有限公司提供，廈門大學(xué)附屬福州第二醫(yī)院藥劑科負(fù)責(zé)加工制備，每克顆粒藥含原生藥9.8 g，生理鹽水加熱溶解使用。

2.2 含藥血清的制備 將40只成年SD大鼠隨機(jī)分為空白血清組和含藥血清組，每組20只。按成人與大鼠體表面積折算的等效劑量比值（系數(shù)為6.25）換算用量，空白血清組予生理鹽水

2 mL·kg-1灌胃，含藥血清組予補(bǔ)骨顆粒3.08 g·kg-1灌胃，在灌胃時(shí)將補(bǔ)骨顆粒用生理鹽水加熱溶解成1 g·mL-1的水溶液，每日1次，連續(xù)14 d。末次給藥2 h后處死大鼠，并在無菌條件下腹主動脈采血5 mL，靜置2 h，低溫2000 r·min-1離心15 min后分離血清，于56 ℃恒溫水浴滅活30 min，-80 ℃冰箱保存。

2.3 軟骨細(xì)胞的培養(yǎng) 取第3代SD大鼠軟骨細(xì)胞，消化后接種于培養(yǎng)皿，置于37 ℃，體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)至貼壁，更換含血清培養(yǎng)基，設(shè)空白血清組及質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的含藥血清組[3]，于37 ℃，體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育，直至鋪滿培養(yǎng)皿。

2.4 蛋白質(zhì)提取、消化和TMT肽段標(biāo)記 收集空白血清組軟骨細(xì)胞及質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的含藥血清組軟骨細(xì)胞，分別加入4倍體積裂解緩沖液，經(jīng)超聲裂解后于4 ℃環(huán)境下的離心機(jī)中以12 000 r·min-1離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中。往上清液中加入二硫蘇糖醇至其濃度改變?yōu)? mmol·L-1，并于56 ℃熱水浴中還原30 min，然后加入碘代乙酰胺調(diào)整濃度為11 mmol·L-1。在室溫避光條件下孵育15 min，并將溶液中的尿素濃度稀釋至低于2 mol·L-1。以1∶50（胰酶∶蛋白）的質(zhì)量比例加入胰酶，于37 ℃環(huán)境下酶解過夜;然后以1∶100的質(zhì)量比例加入胰酶，繼續(xù)于37 ℃環(huán)境下酶解4 h。待試劑解凍后用乙腈溶解，并與肽段混合后置于條件下室溫孵育2 h，經(jīng)除鹽后將標(biāo)記的肽段真空冷凍干燥保存。

2.5 HPLC分級與液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析 應(yīng)用高pH反向HPLC法分級肽段，將分級梯度設(shè)置為8%～32%乙腈，pH調(diào)整為9，在60 min內(nèi)分離為60個組分，然后將其合并為18個組分，經(jīng)真空冷凍干燥后用液相色譜流動相A溶解后使用EASY-nLC 1000超高效液相系統(tǒng)進(jìn)行分離。流動相A為含體積分?jǐn)?shù)為0.1%的甲酸和體積分?jǐn)?shù)為2%的乙腈水溶液;流動相B為含體積分?jǐn)?shù)為0.1%的甲酸和90%的乙腈水溶液。液相梯度設(shè)置：0～26 min，9%～25% B;26～34 min，25%～36% B;34～37 min，36%～80% B;37～40 min，80% B，流速維持在700 nL·min-1。將分離后的肽段注入NSI離子源中進(jìn)行電離，然后進(jìn)行Q Exactive TM質(zhì)譜分析。

2.6 數(shù)據(jù)庫搜索及生物信息學(xué)分析 應(yīng)用Maxquant （v1.5.2.8）軟件檢索Proteome Rat數(shù)據(jù)庫中的二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)，其中酶切方式設(shè)置為Trypsin/P，漏切位點(diǎn)數(shù)設(shè)為2，肽段最小長度設(shè)置為7個氨基酸殘基，肽段最大修飾數(shù)設(shè)為5。選擇UniProt-GOA數(shù)據(jù)庫注釋工具對差異蛋白進(jìn)行基因功能聚類GO分析。采用KEGG在線服務(wù)工具KAAS對提交的蛋白進(jìn)行注釋，然后通過KEGG mapper將注釋過的蛋白匹配入數(shù)據(jù)庫相應(yīng)的通路中;使用預(yù)測亞細(xì)胞定位的軟件wolfpsort對所提交的蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位注釋。

3 結(jié) 果

3.1 蛋白質(zhì)組鑒定結(jié)果 通過數(shù)據(jù)庫檢索，補(bǔ)骨顆粒含藥血清及空白血清干預(yù)軟骨細(xì)胞后共鑒定到5028個蛋白質(zhì)，包含25 423個肽段，其中4297個蛋白質(zhì)包含定量信息。以1.3倍為變化閾值，t檢驗(yàn)以P < 0.05為標(biāo)準(zhǔn)，空白血清組中163個蛋白表達(dá)發(fā)生上調(diào)，188個蛋白表達(dá)發(fā)生下調(diào);補(bǔ)骨顆粒含藥血清干預(yù)后有164個蛋白表達(dá)發(fā)生上調(diào)，58個蛋白表達(dá)發(fā)生下調(diào)。

3.2 生物信息學(xué)分析 基因本論（Gene Ontology，GO）是對生物過程（biological process）、細(xì)胞位置（cellular component）和分子功能（molecular function）進(jìn)行分類。在發(fā)生變化的222個蛋白中主要參與生物過程的有13種，其主要為單生物過程（15%）、細(xì)胞過程（15%）、生物調(diào)節(jié)（12%）、代謝過程（10%）及應(yīng)激反應(yīng)（9%）;細(xì)胞位置9個，所占比例較高的前5個是細(xì)胞質(zhì)（27%）、細(xì)胞器（23%）、細(xì)胞溶質(zhì)（14%）、細(xì)胞膜（13%）及蛋白質(zhì)復(fù)合體（9%）;分子功能有8個，其中占比例較高的有離子結(jié)合（54%）、激酶活性（25%）、分子活性（6%）、轉(zhuǎn)運(yùn)活性（5%）與分子功能調(diào)節(jié)劑（3%）。

使用wolfpsort軟件對差異表達(dá)蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的預(yù)測和分類發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞質(zhì)中占34%，胞外基質(zhì)中占23%，細(xì)胞核中占19%，線粒體中占10%，胞膜中占9%。通過KEGG代謝通路分析表明，差異蛋白共參與198個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其中排名前5位的代謝通路為糖酵解通路（5.73%）、碳代謝通路（5.18%）、氨基酸的生物合成通路（4.94%）、淀粉和蔗糖代謝通路（3.96%）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工通路（3.46%）。

根據(jù)差異蛋白的表達(dá)量、分子功能、代謝通路和網(wǎng)絡(luò)通路，篩選出41個差異蛋白，主要分為氧化還原酶、水解酶、裂解酶、轉(zhuǎn)移酶、異構(gòu)酶、大亞基結(jié)合蛋白、熱休克蛋白等類別，其中篩選出的目標(biāo)差異蛋白有腺苷酸轉(zhuǎn)位酶1（ANT1）、熱休克蛋白27（HSP27）、肌漿/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣ATP酶1、鈉/鉀轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶、果糖二磷酸醛縮酶A、3-磷酸甘油醛脫氫酶、磷酸甘油酸變位酶1、β-烯醇化酶、L-乳酸脫氫酶、糖原合成酶、肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1，可能參與其中的蛋白有肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈2、碳酸酐酶1、碳酸酐酶2、肌酸激酶S型、肌酸激酶M型、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶、超氧化物歧化酶、蘋果酸脫氫酶、細(xì)胞色素b-c1復(fù)合物及琥珀酸脫氫酶復(fù)合物等。見表1。

4 討 論

OA屬中醫(yī)學(xué)“痹證”范疇，外因多歸于風(fēng)、寒、濕三邪侵襲，內(nèi)因多為肝腎虧損。中老年以后多有肝腎虧損，肝虛則血不養(yǎng)筋，筋不能維持骨節(jié)之張弛而關(guān)節(jié)失滑利;腎虛則髓減，致使筋骨均失所養(yǎng)，骨贅形成，關(guān)節(jié)囊纖維變性和增厚，限制關(guān)節(jié)的活動;在外邪的作用下，關(guān)節(jié)周圍的肌肉因疼痛而產(chǎn)生保護(hù)性痙攣，使關(guān)節(jié)活動進(jìn)一步受到限制，增加了退行性變的進(jìn)程，關(guān)節(jié)發(fā)生纖維性強(qiáng)直。所以治療上以補(bǔ)益肝腎、強(qiáng)筋壯骨為主，同時(shí)結(jié)合老年患者多瘀的特點(diǎn)而輔以活血化瘀中藥?；诖耍P者既往選用補(bǔ)骨顆粒治療腎虛血瘀型老年性O(shè)A，取得了較好療效[4]。但是，目前仍缺乏補(bǔ)骨顆粒治療OA的具體作用機(jī)制，筆者擬通過蛋白質(zhì)組學(xué)方法從整體蛋白質(zhì)表達(dá)的水平上闡明OA腎虛血瘀發(fā)生的本質(zhì)，從而尋找補(bǔ)腎活血方藥的作用靶點(diǎn)。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，補(bǔ)骨顆粒中骨碎補(bǔ)、淫羊藿、鹿銜草、三七、當(dāng)歸、川芎等補(bǔ)腎活血中藥含有的異補(bǔ)骨脂素、淫羊藿苷Ⅱ、蛇床子素等可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖、抑制破骨細(xì)胞的吸收及炎癥因子的表達(dá)，對防治OA疼痛及退行性變具有重要作用[5-7]。筆者在此基礎(chǔ)上應(yīng)用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)分析補(bǔ)骨顆粒復(fù)方對軟骨細(xì)胞的整體蛋白質(zhì)表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)骨顆粒能夠促進(jìn)軟骨細(xì)胞中ANT1、HSP27及糖酵解過程相關(guān)酶等的表達(dá)，這對進(jìn)一步研究KOA發(fā)病機(jī)制提供了重要線索。

ANT1是線粒體內(nèi)膜的重要腺苷酸載體，是構(gòu)成線粒體通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔道的主要成分，在調(diào)控線粒體內(nèi)ATP協(xié)調(diào)變化及細(xì)胞凋亡方面有著重要意

義[8-9]。有文獻(xiàn)報(bào)道，當(dāng)機(jī)體處于缺氧環(huán)境時(shí)，可以通過ANT1表達(dá)減少活性氧的產(chǎn)生起到保護(hù)作用[10-11]，并且ANT1可以降低胰島素抵抗現(xiàn)象，對代謝性疾病具有重要的防護(hù)作用[12]。通過蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)骨顆粒干預(yù)后軟骨細(xì)胞內(nèi)的ANT1表達(dá)將明顯增多，這或許與黨參、茯苓、三七及當(dāng)歸等藥物有關(guān)[13-15];但是補(bǔ)骨顆粒的成分復(fù)雜，需要今后進(jìn)一步的藥理學(xué)研究。

HSP27屬于低分子量熱休克蛋白家族之一，具有阻止應(yīng)激因素引起損傷細(xì)胞的作用。在缺血、缺氧等條件下HSP27表達(dá)量將增加，并發(fā)生磷酸化與其他蛋白相互作用，在細(xì)胞的抗凋亡過程中起促進(jìn)作用[16-17]。線粒體是細(xì)胞內(nèi)發(fā)生氧化磷酸化的細(xì)胞器，也是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡通路的重要場所，有文獻(xiàn)報(bào)道HSP27將會抑制線粒體內(nèi)氧化酶活性而降低細(xì)胞中活性氧水平，從而抑制線粒體凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，在抑制細(xì)胞凋亡方面具有重要意義[18]。補(bǔ)骨顆粒中的骨碎補(bǔ)、淫羊藿、鹿銜草等補(bǔ)益肝腎中藥可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖、抑制破骨細(xì)胞的吸收[6-7]，三七、當(dāng)歸等活血藥物可以通過調(diào)控線粒體信號通路控制細(xì)胞的凋亡[14-15]，這些藥物合用起到抑制軟骨細(xì)胞凋亡的作用;同時(shí)筆者研究也發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)骨顆粒能夠促進(jìn)HSP27的表達(dá)，因此補(bǔ)骨顆?？赡芡ㄟ^HSP27表達(dá)以對抗氧化應(yīng)激的保護(hù)作用而抑制軟骨細(xì)胞凋亡[19]。

糖酵解過程是細(xì)胞獲取能量的最重要過程，其中醛縮酶A、3-磷酸甘油醛脫氫酶、磷酸甘油酸變位酶1、β-烯醇化酶、L-乳酸脫氫酶、肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1等是糖酵解過程的重要催化酶類。筆者通過補(bǔ)骨顆粒含藥血清干預(yù)軟骨細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，這些酶類的表達(dá)較前明顯增加，這或許與黨參、茯苓等補(bǔ)氣健脾中藥可以提高抗氧化酶的活性、抑制脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生及增強(qiáng)運(yùn)動能力等有關(guān)[13]。另外，糖酵解酶除了影響能量生成，還對細(xì)胞的乏氧環(huán)境具有一定的調(diào)控作用[20]，可以通過增強(qiáng)糖酵解過程觸發(fā)血管內(nèi)皮生長因子生成及促進(jìn)肌動蛋白絲束形成等而促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化及遷移[21]，這或許與三七、當(dāng)歸等活血藥物調(diào)控細(xì)胞的相關(guān)信號通路有關(guān)[14-15]，但仍需今后進(jìn)一步的研究。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析補(bǔ)骨顆粒對軟骨細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)的影響，對于揭示軟骨細(xì)胞的凋亡機(jī)制具有重要意義。另外，研究還發(fā)現(xiàn)了可能與軟骨細(xì)胞凋亡相關(guān)的蛋白質(zhì)有ANT1、HSP27、醛縮酶A、β-烯醇化酶及肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1等，為KOA發(fā)病機(jī)制的研究提供了重要線索。

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收稿日期：2019-02-09;修回日期：2019-05-11