韓增鵬　施祥瑋　應(yīng)敏　鄭寧　李梅　張志建　 吳陽　王華東　王杰　胡亮　賈凡　徐富強

摘?要?腦是機體最為復(fù)雜的系統(tǒng)，決定著情感、記憶、學(xué)習(xí)等生理活動。神經(jīng)環(huán)路是腦行使功能的基礎(chǔ)，明確神經(jīng)環(huán)路的構(gòu)成和工作原理，對于認識腦、利用腦和保護腦具有十分重要的意義。神經(jīng)環(huán)路結(jié)構(gòu)和功能解析涉及環(huán)路標記、成像和數(shù)據(jù)分析等。本文以環(huán)路標記為出發(fā)點，重點介紹了以嗜神經(jīng)病毒為基礎(chǔ)的神經(jīng)環(huán)路示蹤工具體系及其應(yīng)用技術(shù)，闡述了常用的嗜神經(jīng)工具病毒類別及其特性、遺傳改造、選用原則及應(yīng)用限制等問題，并對不跨突觸示蹤工具系統(tǒng)、跨單級突觸示蹤工具系統(tǒng)和跨多級突觸示蹤工具系統(tǒng)進行介紹，以期幫助讀者了解當前腦科學(xué)研究中不可替代的環(huán)路標記新方法及其研究新進展。

關(guān)鍵詞?神經(jīng)環(huán)路; 示蹤工具病毒; 逆向跨突觸; 順向跨突觸; 輔助工具病毒; 評述

1?引 言

數(shù)目龐大、形態(tài)各異的神經(jīng)元經(jīng)突觸連接構(gòu)成的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)是大腦行使感覺、運動、情感、認知等復(fù)雜活動的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，認識神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)元之間的連接方式是當前神經(jīng)科學(xué)研究的挑戰(zhàn)之一。經(jīng)典的示蹤劑被廣泛用于確定實驗動物不同腦區(qū)之間神經(jīng)元的連接： 如可被軸突末端吸收并沿軸突逆行示蹤的霍亂毒素b亞基（CTb）、辣根過氧化物酶（HRP）等[1，2];可被神經(jīng)元胞體和和樹突吸收并沿軸突順行示蹤的植物血凝集素（PHA?L）、葡聚糖胺（BDAs）等[3，4]。這些示蹤劑有如下缺點： （1）無法實現(xiàn)細胞類型特異性標記; （2）跨突觸效率不穩(wěn)定; （3）無法實現(xiàn)多級神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的標記，信號衰減嚴重。嗜神經(jīng)病毒示蹤技術(shù)為這些問題的解決提供了新方案，并使遺傳改造后的病毒成為追蹤神經(jīng)突觸連接的有效工具[5]。

重組病毒載體作為示蹤工具，因其載體本身具有不同的特性而適用于不同的標記策略（如是否跨突觸、沿神經(jīng)環(huán)路順向或逆向運輸?shù)龋? 每種載體又可通過攜帶不同報告基因或特定功能元件，實現(xiàn)神經(jīng)元精細形態(tài)標記、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)可視化或特定功能的標記，結(jié)合重組酶（如Cre或Flp）或特異性啟動子，可實現(xiàn)細胞類型特異標記。

2?神經(jīng)環(huán)路研究中常用的病毒載體和可攜載的功能元件

2.1?神經(jīng)環(huán)路研究中常用的病毒載體

目前，應(yīng)用于神經(jīng)環(huán)路標記的病毒工具多由嗜神經(jīng)病毒改造而來，嗜神經(jīng)病毒是一類能感染神經(jīng)細胞，且能夠跨突觸沿神經(jīng)環(huán)路傳播的病毒，如偽狂犬病毒（Pseudorabies virus， PRV）[6]、單純皰疹病毒（Herpes simplex virus type 1， HSV）[7]、狂犬病毒（Rabies virus， RV）[8]、水泡性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus， VSV）[9]等。此外，一些不跨突觸的病毒載體可高效原位標記神經(jīng)元精細形態(tài)，如塞姆利基森林病毒（Semliki Forest virus， SFV）[10]; 或作為輔助病毒表達外源基因，如腺相關(guān)病毒（Adeno?associated virus， AAV）[11]; 也可用于展示局部腦區(qū)的上游投射，如2型犬腺病毒（Canine Adenovirus 2， CAV2）[12，13]。神經(jīng)環(huán)路示蹤常用的重組病毒載體見表1。

因病毒載體對動物種屬或組織細胞類型的感染嗜性存在差異，不同的病毒載體適用于不同的研究對象，而且每種病毒工具又可通過攜載各種元件滿足不同的研究需求。

2.2?常用工具病毒可攜載的功能元件

重組病毒作為一種新興的神經(jīng)示蹤工具，在解析神經(jīng)環(huán)路的研究中具有諸多優(yōu)勢，包括： （1）具有靈活的遺傳可操作性; （2）可攜帶不同的標示物及功能探針等， 可實現(xiàn)對特定類型神經(jīng)元及環(huán)路的結(jié)構(gòu)和功能的研究。

可視化標記是神經(jīng)元及環(huán)路結(jié)構(gòu)研究的基礎(chǔ)。重組工具病毒可攜帶多種報告基因（如： 可通過免疫熒光顯色的蛋白標簽、可與底物反應(yīng)顯色的半乳糖苷酶、可直接顯示顏色的GFP、RFP、YFP等熒光蛋白）， 實現(xiàn)對神經(jīng)元形態(tài)或神經(jīng)環(huán)路結(jié)構(gòu)的可視化標記。在此基礎(chǔ)上，攜載腦虹元件，工具病毒可用于抽提更復(fù)雜的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)信息; 攜載胞核、胞體、樹突以及軸突定位元件，可實現(xiàn)對不同亞細胞結(jié)構(gòu)的選擇性或富集標記; 通過將熒光蛋白拆分之后分別表達于突觸前和突觸后，可實現(xiàn)對突觸結(jié)構(gòu)的精細標記[14]。近年來，通過病毒載體攜載磁共振成像報告蛋白（如鐵蛋白），使得基于磁共振成像的更精細的神經(jīng)環(huán)路的活體解析成為可能[15，16]。通過與嗜神經(jīng)病毒載體的結(jié)合，磁共振成像報告基因已被用于細胞遷移、基因治療、神經(jīng)可塑性及胚胎發(fā)育等過程的活體示蹤與監(jiān)測。

神經(jīng)環(huán)路功能的研究手段可分為神經(jīng)活動的監(jiān)測和操控兩方面。基于Ca2+濃度變化的熒光成像技術(shù)已被廣泛用于神經(jīng)活動的實時監(jiān)測。由鈣調(diào)蛋白CaM、環(huán)狀序列改變的增強型綠色熒光蛋白cpEGFP和M13多肽序列融合而成的GCaMP是目前最常用的鈣離子濃度探針[17～20]。但以往的GCaMP探針在長時程、高表達的情況下容易在細胞核中積累，導(dǎo)致細胞毒性和反應(yīng)變慢等副作用，近期，Yang等[21]在此基礎(chǔ)上引入可特異結(jié)合apoCaM的保護元件構(gòu)建的GCaMP?X，成功克服了這些缺陷，優(yōu)化了鈣離子探針的性能。上述鈣離子探針可監(jiān)測神經(jīng)環(huán)路的瞬時活動狀況，但無法永久標記特定時刻被激活的神經(jīng)元，因而無法對其形態(tài)結(jié)構(gòu)、細胞類型等進行后續(xù)研究。通過將GCaMP中的cpEGFP替換為光轉(zhuǎn)換熒光蛋白mEos2，獲得的CaMPARI可實現(xiàn)對瞬時活動的神經(jīng)元的永久標記[22～24]： 在正常狀態(tài)，在高濃度Ca2+存在的情況下，表現(xiàn)為GFP綠色熒光蛋白構(gòu)象的CaMPARI給予紫外光照射處理，就會不可逆、永久地轉(zhuǎn)變成紅色熒光（Red）的構(gòu)象。除了依賴Ca2+濃度變化之外，近年來，研究者也開發(fā)了多種基因編碼的神經(jīng)遞質(zhì)探針，如檢測多巴胺的dLight1[25]、GRABDA（DA1m、DA1h）[26]，以及檢測乙酰膽堿的GACh2.0[27]等。這些神經(jīng)遞質(zhì)探針都是基于相似的原理，即利用天然的神經(jīng)遞質(zhì)的G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR），用對結(jié)構(gòu)變化敏感的熒光蛋白cpGFP/cpEGFP代替相應(yīng)的人源神經(jīng)遞質(zhì)受體C端的ICL3。當神經(jīng)遞質(zhì)與經(jīng)過改造的受體結(jié)合時，受體構(gòu)象變化，引起cpGFP/cpEGFP構(gòu)象改變，使綠色熒光信號增加，當神經(jīng)遞質(zhì)濃度降低時，此過程逆向進行，熒光迅速減弱[25～27]。通過記錄綠色熒光信號強度變化，可實時檢測神經(jīng)遞質(zhì)的濃度水平。此外，還有其它神經(jīng)活動監(jiān)測的探針，如細胞膜電位變化敏感的探針、pH值變化敏感的探針等。

目前，工具病毒可攜載的神經(jīng)功能操控元件主要包括光遺傳和化學(xué)遺傳等元件。光遺傳學(xué)允許利用不同波長的光激活或抑制神經(jīng)元，Channelrhodopsin?2（ChR2）[28]是最早在神經(jīng)元中實現(xiàn)高效光遺傳學(xué)操控研究的光敏感離子通道蛋白，在470 nm左右藍光作用下，ChR2可開放細胞膜上的非選擇性陽離子通道，激活神經(jīng)元。目前已開發(fā)出了多種具有不同特性的可用于激活神經(jīng)元的光敏感離子通道蛋白突變體，如ChR2（H134R）通過將第134位氨基酸由組胺酸突變?yōu)榫匪?，可產(chǎn)生2倍于野生型ChR2的光電流; ChETA在高頻率激光刺激下可使神經(jīng)元產(chǎn)生200 Hz的動作電位發(fā)放; C1V1和ReachR可被“紅移”激光激活等?；诼入x子通道以及氫離子泵，構(gòu)建了多種可抑制神經(jīng)元活動的光遺傳元件，其中Halorhodopsin（NpHR）[29]是第一個可有效抑制神經(jīng)元的光敏感離子通道蛋白，改良的eNpHR3.0可在細胞膜上高度富集，降低了光功率需求同時也增強了抑制效率，其在593 nm左右黃綠激光照射下可將Cl轉(zhuǎn)入細胞內(nèi)，使細胞發(fā)生超極化，可抑制神經(jīng)元; Archaerhodopsin（Arch）[30]在黃光作用下可將H+泵出細胞，沉默神經(jīng)元; Leptosphaeria maculans fungal opsins（Mac）可通過藍光刺激抑制神經(jīng)元[31]; 而Anion channelrhodopsins （ACR）[32]在藍光作用下每分鐘可轉(zhuǎn)導(dǎo)104～105個Cl，效率比傳統(tǒng)的NpHR和Arch高102～104倍。這些具有不同特性的光遺傳功能蛋白的開發(fā)極大地豐富了光遺傳學(xué)的研究手段?；瘜W(xué)遺傳學(xué)通過設(shè)計特定惰性小分子激活的受體（Designer receptors exclusively activated by designer drugs， DREADDs）蛋白[33，34]，并使其分別偶聯(lián)Gq、Gi、Gs、Golf和β?arrestin等介導(dǎo)細胞內(nèi)不同信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的G蛋白偶聯(lián)受體，利用該惰性藥物激活相應(yīng)的GPCR信號通路，進而影響細胞生理活動?，F(xiàn)有的DREADDs系統(tǒng)多采用N?氧化氯氮平（Clozapine?N?oxide，CNO）作為激活配體，并且已開發(fā)出多種DREADDs系統(tǒng)，包括神經(jīng)科學(xué)研究中應(yīng)用最廣泛的可興奮神經(jīng)元的Gq?DREADD（hM3Dq[35]）和可抑制神經(jīng)元的Gi?DREADD（hM4Di[36]等），此外，Vardy等[37]基于k?阿片受體開發(fā)的KORD化學(xué)遺傳蛋白可與SALB（Salvinorin B）特異性結(jié)合，激活Gq通路、抑制神經(jīng)活動，豐富了化學(xué)遺傳元件的多樣性，并且允許利用不同的小分子配體同時激活和抑制不同神經(jīng)元。

3?適用于不同研究需求的標記系統(tǒng)

目前，適于不同研究需求的神經(jīng)環(huán)路標記系統(tǒng)主要分為不跨突觸的標記系統(tǒng)、跨多級突觸的標記系統(tǒng)和跨單級突觸的標記系統(tǒng)（圖1）。

3.1?不跨突觸的標記系統(tǒng)

3.1.1?高效原位轉(zhuǎn)導(dǎo)的標記系統(tǒng)?重組腺相關(guān)病毒載體（rAAV）是一種在非致病的野生型AAV基礎(chǔ)上改造成的新型基因載體。因受到AAV自身基因包裝容量的限制，rAAV攜帶的外源基因片段長度一般不超過5 kb[38]。rAAV具有安全性高、免疫原性低、宿主范圍廣、病毒血清型種類多、可感染分裂和非分裂細胞、能介導(dǎo)基因在動物體內(nèi)長期穩(wěn)定表達等特點，被廣泛用于外源基因在特定類型神經(jīng)細胞中的表達，以及通過使用不同類型神經(jīng)細胞的特異啟動子控制外源基因的表達; 另外，rAAV也被廣泛用于攜載各種分子遺傳元件實現(xiàn)神經(jīng)環(huán)路的范圍、連接方向、神經(jīng)元類型等的可控性標記及神經(jīng)環(huán)路的監(jiān)控和操縱[11]。Wu等[39]優(yōu)化了基于桿狀病毒系統(tǒng)大規(guī)模生產(chǎn)rAAV的方法，大大提高了rAAV載體制備方法的通用性和靈活性。

VSV病毒載體： VSV囊膜糖蛋白G為其跨突觸必需蛋白。G蛋白敲除的VSV病毒不能跨突觸傳播，但仍具有可在感染后短時間內(nèi)高豐度地表達外源蛋白、宿主范圍廣等優(yōu)勢，因此具有對不同物種神經(jīng)元實現(xiàn)快速、高亮標記的潛在應(yīng)用價值，進一步借助EnvA/TVA系統(tǒng)可控制所標記的神經(jīng)元的特異性[9]。但由于VSV對標記的神經(jīng)元細胞有相對較大的細胞毒性，需對其進行進一步減毒改造。

SFV病毒載體： SFV也可在感染后短時間內(nèi)高豐度地表達外源蛋白，使用VSV?G或RVG包裝的假型SFV可將EGFP遞送到神經(jīng)元中，實現(xiàn)局部神經(jīng)元的非特異性快速標記[10]。

3.1.2?經(jīng)軸突末端感染逆行標記的載體系統(tǒng)

狂犬病毒載體： RV的囊膜糖蛋白受體大量分布在神經(jīng)元軸突末端，因此RV病毒可沿軸突逆行感染進入神經(jīng)元并開啟病毒復(fù)制。Wickersham 等[40]利用反向遺傳學(xué)手段對狂犬病毒疫苗株SAD?B19進行改造，將RV基因組中病毒跨膜必須的G蛋白基因敲除換成熒光蛋白基因（如mcherry或eGFP），并用細胞系補償表達病毒包裝所需的G蛋白，最后獲得可感染神經(jīng)細胞的缺陷型重組RV。RV?ΔG?eGFP病毒只能進行單次感染，能夠標記感染的單個神經(jīng)元的形態(tài)和亞細胞結(jié)構(gòu)[40]。RV?ΔG是“逆行示蹤劑”，可在體內(nèi)用于直接鑒定投射型神經(jīng)元。這種逆行標記示蹤病毒與經(jīng)典的非病毒性逆行示蹤劑（如霍亂毒素亞單位（CTb）等）的作用相似，然而有其獨特的優(yōu)點，RV?ΔG病毒載體復(fù)制轉(zhuǎn)錄不受影響，仍可高豐度持續(xù)表達外源基因，高亮標記所感染的神經(jīng)元[40，41]。

犬腺病毒載體： CAV?2可高效感染神經(jīng)元軸突末梢，逆行標記神經(jīng)元[12，13]，然而CAV?2僅允許中等強度的轉(zhuǎn)基因表達，并且顯示出一定的毒性[42]，病毒生產(chǎn)系統(tǒng)的穩(wěn)定性、通用性也有待提高[43]。

Retro?AAV載體： Tervo等運用定向進化策略，通過建立AAV衣殼突變體文庫，篩選到一種新的AAV突變體（rAAV2?retro）， 可通過軸突末端感染有效地對投射類神經(jīng)元逆行標記[44]。

HSV?1擴增子載體： Amplicon是基于HSV制備的一種假型病毒載體，擴增子質(zhì)粒由細菌復(fù)制起始的細菌質(zhì)粒骨架載體、HSV?1 的順式作用元件復(fù)制起始點ori、切割包裝信號pac和外源基因表達盒構(gòu)成。該載體不表達HSV的結(jié)構(gòu)基因，為完全的復(fù)制缺陷性載體，可用于神經(jīng)元軸突末端起始逆行標記[45～47]。

3.1.3?稀疏高亮標記系統(tǒng)?繪制不同腦區(qū)之間神經(jīng)元連接圖譜是神經(jīng)科學(xué)研究的基礎(chǔ)工作之一。鑒于特定腦區(qū)中神經(jīng)元往往呈現(xiàn)功能和形態(tài)的特異性，許多研究致力于精細標記特定區(qū)域特定神經(jīng)元的完整形態(tài)[48]。由于不同神經(jīng)元的軸突和樹突緊密地纏繞而難以區(qū)分，因此“稀疏”且“高亮”地描繪單個神經(jīng)元完整的形態(tài)成為實現(xiàn)單細胞標記的兩大挑戰(zhàn)[49，50]。

利用病毒工具標記局部神經(jīng)元的單細胞完整形態(tài)主要可借助以下3種途徑實現(xiàn)： （1）依賴高效轉(zhuǎn)導(dǎo)的標記系統(tǒng)，因載體病毒（VSV、SFV等）少量初始感染即可高豐度表達熒光蛋白，通過降低病毒滴度控制稀疏度， 即可實現(xiàn)對局部神經(jīng)元完整形態(tài)的快速、稀疏、高亮標記[51]; （2）混合表達某種“觸發(fā)因子”（如Cre重組酶）和依賴此“觸發(fā)因子”表達熒光蛋白（如Cre依賴的DIO元件）的兩種病毒，通過稀釋前者的滴度控制被標記神經(jīng)元的稀疏程度，利用后者特異性高亮標記神經(jīng)元的精細形態(tài)。Economon等[52]將低滴度的表達Cre重組酶與高滴度的攜帶DIO元件的兩種AAV病毒混合，實現(xiàn)局部神經(jīng)元的稀疏高亮標記，在小鼠大腦運動皮層中穩(wěn)定、高亮度地標記了10～50個神經(jīng)元，并描繪了其全腦范圍精細的軸突投射情況; （3）借助TRE啟動子的泄漏表達實現(xiàn)“稀疏”標記、同時借助tTA/TRE的正反饋機制實現(xiàn)熒光蛋白“高亮”表達的“Supernova”系統(tǒng)[53，54]。Zhou等[55]通過在原始“Supernova”系統(tǒng)中引入一對新的正交重組酶組合，修改稀疏標記系統(tǒng)為由兩種rAAV組成，實現(xiàn)了細胞數(shù)目可控的、特定細胞類型神經(jīng)元的稀疏高亮標記; 并借助DreO和vCre位點特異性重組酶，實現(xiàn)多色標記，同時擴展了標記系統(tǒng)的通用性。

大規(guī)模神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的協(xié)同作用依賴于長程投射神經(jīng)元將局部環(huán)路模塊連接在一起[56]，因此，選擇靶向標記具有特定投射特征的神經(jīng)元有助于理解神經(jīng)元的功能實現(xiàn)方式[44]。為了對有特定投射的神經(jīng)元進行單細胞形態(tài)標記，需要軸突末端感染進入并沿軸突逆行標記神經(jīng)元的示蹤工具病毒。實現(xiàn)這一標記目標的方法有兩種： （1）使用RV等可由軸突末端吸收并可憑借自身基因組復(fù)制轉(zhuǎn)錄，高豐度表達目的基因的病毒。Wickersham等[8]基于RV疫苗株SAD B?19進行遺傳改造，將熒光蛋白基因置于RV基因組靠近起始端，提高了外源基因表達水平，實現(xiàn)了單細胞逆向清晰標記或多色標記。受限于RV病毒復(fù)制及表達特性，目前尚無法實現(xiàn)神經(jīng)元特異性標記; （2）使用rAAV2?retro、CAV?2等載體，這些病毒載體自身基因組雖無法復(fù)制，但可沿軸突逆行運輸并表達一定量的Cre重組酶，啟動上游攜帶DIO元件的標記病毒的熒光蛋白高亮表達，實現(xiàn)對具有特定投射類型的神經(jīng)元逆向清晰標記。Zhou等[55]基于“Supernova”系統(tǒng)，結(jié)合rAAV2?retro攜帶Cre重組酶逆向標記策略，實現(xiàn)特定類型、投射特異性神經(jīng)元的稀疏高亮標記。

哺乳動物的單個神經(jīng)元接受多達數(shù)千個突觸輸入，為了實現(xiàn)特定類型神經(jīng)元起始的單細胞跨突觸逆行環(huán)路示蹤，Wickersham[57]及Marshel [58]等基于雙光子引導(dǎo)的單細胞電穿孔技術(shù)，利用RV?EnvA系統(tǒng)，實現(xiàn)了由單個神經(jīng)元起始，跨突觸追蹤投射到該神經(jīng)元的上游神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。Wertz等[59]結(jié)合鈣成像技術(shù)，將這一標記系統(tǒng)由單純的結(jié)構(gòu)標記擴展到功能性網(wǎng)絡(luò)分析。用于稀疏高亮標記的不同種類病毒的特點見表2。

3.2?跨多級突觸的標記系統(tǒng)

嗜神經(jīng)病毒本身的感染嗜性決定其可沿神經(jīng)環(huán)路跨突觸傳播。HSV1 H129株和VSV具有順向跨突觸傳播的能力，而RV和PRV?Bartha具有逆向跨突觸傳播的能力。這些病毒可用于研究大腦特定區(qū)域的全腦范圍多級輸入和輸出網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，認識神經(jīng)發(fā)育過程中的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)變化，以及追蹤外周器官與中樞神經(jīng)系統(tǒng)間的聯(lián)系通路等。

3.2.1?順行跨多級標記?特異性順行跨突觸應(yīng)用最多的病毒是單純皰疹病毒1型 H129株[60，61]。在神經(jīng)環(huán)路示蹤研究中發(fā)現(xiàn)， H129具有順向跨突觸傳播特性，和神經(jīng)沖動傳遞的方向一致，適合于神經(jīng)輸出環(huán)路的示蹤研究[62，63]。HSV病毒載體還具有以下優(yōu)點： （1）基因組序列結(jié)構(gòu)、遺傳背景清楚，便于分子遺傳改造; （2）近一半基因為非必需基因，外源基因容載量高達40 kb，可攜帶復(fù)雜調(diào)控元件和多樣外源基因; （3）宿主范圍廣，能有效感染斑馬魚、嚙齒類和非人靈長類等多種生物，普適性好[64～66]。HSV?H129株作為神經(jīng)示蹤工具已近三十年，在嚙齒類動物、非人靈長類動物神經(jīng)示蹤中證實了H129的順行跨突觸標記特性[60，67，68]。 如Dum等[69]利用不表達熒光的野生型H129，用抗HSV的多克隆抗體做免疫組化顯色成像，在卷尾猴模型示蹤脊髓?丘腦系統(tǒng)（參與疼痛和熱感信息傳遞）靶向投射到大腦皮層的特異運動和感覺區(qū)，這些靶標腦區(qū)和人類受到疼痛刺激時大腦皮層被激活的腦區(qū)具有很好的一致性。 也有研究采用攜帶熒光蛋白基因的重組H129實現(xiàn)神經(jīng)環(huán)路示蹤[70]，如McGovern[71，72]和Vaughan [73]等構(gòu)建了表達EGFP的重組病毒H129?EGFP，通過感染動物上呼吸道示蹤上行感覺神經(jīng)通路。為實現(xiàn)細胞類型特異性標記，Lo等[7]利用同源重組的方法敲除HSV復(fù)制必需基因（TK），構(gòu)建了Cre重組酶控制熒光蛋白表達及HSV跨突觸的重組病毒H129ΔTK?TT，在Cre轉(zhuǎn)基因小鼠中實現(xiàn)細胞類型特異性的順行跨多突觸全腦追蹤。該重組病毒在Cre小鼠的小腦浦肯野細胞、視覺等神經(jīng)環(huán)路進行了示蹤研究。McGovern等[74]開發(fā)并驗證了一種基于H129株的新型條件性表達的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)順向病毒示蹤系統(tǒng)，利用其對呼吸道傳入神經(jīng)通路的中央投射進行了示蹤研究。Wojaczynski等[63]構(gòu)建了3種表達不同熒光的重組H129病毒，通過對基底神經(jīng)環(huán)路和視覺神經(jīng)系統(tǒng)的示蹤標記，進一步證實了H129及其重組株具有較好的順行跨突觸傳播特性，但同時存在延遲的逆向跨突觸傳播。Su等[75]發(fā)現(xiàn)H129工具病毒存在一定的注射部位軸突末梢感染導(dǎo)致的非特異逆標，所以利用H129在長感染時間（>3天）的輸出環(huán)路追蹤時對結(jié)果需謹慎翻譯。除了HSV，Beier等[76]測試了VSV在嚙齒類動物大腦中的順行跨突觸能力和神經(jīng)元感染的特異性，之后又進行了一系列設(shè)計和改造工作，實現(xiàn)了VSV對特定神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)跨多級的順向標記示蹤。

3.2.2?逆行跨多級標記?PRV Bartha株能嚴格逆行跨突觸在神經(jīng)元之間傳播[6]。PRV Bartha最初被用于通過注射外周組織研究傳出神經(jīng)通路，以及通過抗體免疫組化研究外周神經(jīng)通路。在PRV Bartha株的基礎(chǔ)上，通過加入β?半乳糖苷酶、熒光蛋白基因等元件，構(gòu)建重組病毒，使被病毒感染的細胞可視化，實現(xiàn)對神經(jīng)環(huán)路的可視化研究[77～80]。在倉鼠玻璃體腔注射可表達綠色熒光蛋白的PRV Bartha衍生物PRV?152后，病毒僅通過自主神經(jīng)回路逆向跨突觸傳播，感染視交叉上核[81]。腎功能的神經(jīng)控制由中樞神經(jīng)系統(tǒng)通過腎的交感神經(jīng)支配實現(xiàn)。Cano等[82]為了確定大腦控制兩個腎臟的共有神經(jīng)支配模式，使用雙標記系統(tǒng)追蹤了在個體大鼠中同時參與兩個腎臟神經(jīng)支配的神經(jīng)元。Banfield等[78]構(gòu)建表達紅色熒光蛋白的PRV Bartha重組病毒PRV?614，建立雙病毒跨神經(jīng)元標記技術(shù)，研究單個神經(jīng)元與大腦中的多個神經(jīng)回路之間的連接，盡管如此，PRV?152和PRV?614存在表達效率低的問題，需要通過免疫組化放大信號才能獲得完整的標記結(jié)果，因此給研究帶來了不便?；谠搯栴}，Jia等[83]優(yōu)化了報告基因的表達水平，構(gòu)建了兩個新的逆行跨多突觸示蹤病毒PRV531和PRV724。PRV條件性表達神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)逆向病毒示蹤系統(tǒng)是基于Cre?LoxP系統(tǒng)。在特異性表達Cre重組酶的細胞中感染PRV?Bartha 衍生物Ba2001，在Cre存在的條件下，該病毒衍生物才允許表達GFP及胸苷激酶， 逆向跨突觸傳播。DeFalco等[84]使用Ba2001和在神經(jīng)肽Y或瘦素（ObRb）啟動子下表達Cre的小鼠，研究進食行為下的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。PRV示蹤還可用于量化神經(jīng)元連接的動態(tài)，觀察發(fā)育過程中大腦突觸的形成，評估發(fā)育、 神經(jīng)變性和修復(fù)中的突觸可塑性[85，86]。野生型RV病毒也具有逆行跨多級的特性，囊膜糖蛋白G為跨突觸必須蛋白，受體大量分布在軸突末端。基于野生型RV構(gòu)建的標記工具可用于外周神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)向中樞神經(jīng)系統(tǒng)的輸入網(wǎng)絡(luò)示蹤。利用RV衍生物RV?b2c?egfp （EGFP插入在RV?b2c品系的G和L序列之間）注射在小鼠腘窩淋巴結(jié)，逆向追蹤在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的上游多突觸回路[87]。

3.3?跨單級突觸的標記系統(tǒng)

跨多級突觸的標記方式難以區(qū)分軸突連接層次的上下游關(guān)系，因此在神經(jīng)環(huán)路標記中需要開發(fā)跨單級突觸的標記系統(tǒng)?？鐔渭壨挥|標記系統(tǒng)的標記工具構(gòu)建原理一般是將病毒跨突觸所必須的蛋白缺失，在感染細胞后，通過輔助病毒（如rAAV等）反式補償該蛋白，使感染的病毒粒子完成跨突觸事件，病毒進入二級神經(jīng)元后，由于缺少跨突觸必須的蛋白，因此不能繼續(xù)沿突觸向下一級傳播。

3.3.1?順行跨單級標記?Zeng等[88]基于HSV1 H129細菌人工染色體，通過刪除HSV復(fù)制必需基因TK并引入tdTomato熒光基因表達框構(gòu)建， 獲得H129ΔTK?tdT，該病毒感染神經(jīng)細胞不能復(fù)制跨突觸，當用AAV輔助病毒補償表達TK蛋白可實現(xiàn)HSV順行跨單級突觸示蹤標記。rAAV是一種復(fù)制缺陷型的假病毒載體。Castle等[89，90]的研究表明，AAV1可沿著軸突順行運輸，然而其潛在的跨突觸傳播機制仍不清楚，且存在爭議[91～94]。近來，Zingg等[95]為1型和9型AAV表現(xiàn)出的順行跨單級突觸傳播提供了證據(jù)，實現(xiàn)了突觸前神經(jīng)元感染高滴度的AAV1?Cre能有效跨一次突觸且特異性地驅(qū)動Cre依賴的外源基因在突觸后神經(jīng)元中表達， 實現(xiàn)AAV1型順行跨單級突觸傳播和標記神經(jīng)元的功能操控。AAV1病毒顆粒順行跨單級突觸的機制目前并不清楚，而且存在AAV1感染所需滴度高、跨突觸效率低，只能攜載Cre重組酶再誘導(dǎo)突觸后神經(jīng)元基因表達等限制因素。

3.3.2?逆行跨單級標記?G蛋白缺失的RV感染神經(jīng)元后不能復(fù)制子代病毒傳播到起始細胞之外，除非在起始細胞內(nèi)通過輔助病毒反式補償足夠的RV G蛋白，以便病毒完成包裝后跨突觸到突觸前神經(jīng)元。這可通過不同方式實現(xiàn)，例如利用輔助病毒或轉(zhuǎn)基因動物在特定細胞中表達相應(yīng)的組分，結(jié)合EnvA/TVA系統(tǒng)可實現(xiàn)細胞特異性起始感染（圖2）[96]。Reardon等[97]

構(gòu)建了缺失G蛋白的RV的CVS?N2C株，CVS?N2C毒株比SAD?B19株系的逆行跨突觸傳播效率更高。

缺失G蛋白的RV的細胞毒性并未完全消除，Ciabatti等[98]利用基因工程手段，將一段煙草蝕刻病毒蛋白酶體靶向結(jié)構(gòu)域的切割序列PEST和N蛋白連接， 能將RV病毒在感染的神經(jīng)元中持續(xù)表達2周后被蛋白酶體清除掉，大大降低對細胞的毒性[98]。與HSV順行跨單突觸原理類似，皰疹病毒科病毒PRV也可通過刪除復(fù)制必需基因TK，并引入熒光基因表達框，構(gòu)建可逆行跨單級的病毒載體。

3.4?基于腔室系統(tǒng)的定向神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)用于病毒體外評估與機制研究

三腔系統(tǒng)或微流體芯片通過在培養(yǎng)基底上設(shè)立隔斷的細胞小室，操控神經(jīng)軸突定向生長，并實現(xiàn)其與胞體的隔離，進而模擬離體神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，用于病毒感染和傳播特性的快速評估與機制研究。該方法允許病毒特異感染極化的胞體或軸突末端，同時滿足對感染過程實時監(jiān)測的需求。

研究者探討了RV在末梢生長錐的內(nèi)化進入及在軸突中雙向運輸?shù)臋C制，并評估了藥物如干擾素和土根堿對其逆向運輸?shù)挠绊慬99～102]; 從離體神經(jīng)元水平再現(xiàn)了皰疹病毒如HSV和PRV的潛伏感染，并以此討論潛伏與重激活可能存在的機理[103～110]; 通過病毒顆粒與蛋白的熒光可視化，研究了AAV軸突轉(zhuǎn)運的相關(guān)機制[89]。另一方面，借助腔室實現(xiàn)與非神經(jīng)細胞的共培養(yǎng)，可用于病毒傳播的機制研究，由此論證了gD、gB與Us9蛋白在PRV和HSV正向傳播中的關(guān)鍵作用[111，112]。此外，近年興起的類器官技術(shù)，幫助研究者在體外水平成功模擬肝炎病毒HBV的臨床感染特性[113]。在未來，以微流體及三維組織培養(yǎng)相結(jié)合的方案，有望實現(xiàn)更接近活體水平的、投射模式可控的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，加速工具病毒的研究進展。

4?展 望

現(xiàn)有的跨突觸示蹤工具病毒可用于包括果蠅[114]、線蟲[115]、斑馬魚[116]、大小鼠[117，118]、樹鼩[119]、非人靈長類動物[120～122]等在內(nèi)的模式動物。不同嗜神經(jīng)病毒的天然感染宿主范圍有所不同，RV、HSV、VSV感染宿主范圍廣，能應(yīng)用于果蠅、斑馬魚、大小鼠、非人靈長類猴等動物的神經(jīng)環(huán)路示蹤[69，114]。PRV可應(yīng)用于除非人靈長類動物之外的其它動物神經(jīng)環(huán)路示蹤[6，123]。除跨突觸示蹤工具病毒外，環(huán)路研究常用的輔助病毒（如rAAV等）能感染從果蠅、斑馬魚到嚙齒類、非人靈長類動物等的大多數(shù)模式動物，已有很廣泛的應(yīng)用[124，125]。

盡管如此，現(xiàn)有的工具系統(tǒng)仍然存在一些限制或問題： （1）針對不同模式動物的示蹤工具尚不健全，缺乏高效的靈長類神經(jīng)環(huán)路示蹤工具; （2）現(xiàn)有的工具存在毒性，限制了其應(yīng)用范圍，如長時程的功能環(huán)路的解析; （3）病毒表達外源蛋白效率較低，給實驗過程帶來不便; （4）工具病毒制備工藝也亟待升級，以便高效率地生產(chǎn)高質(zhì)量的病毒載體等。

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Tools for Neural Circuit Tracing Based on Neurotropic Viruses

HAN Zeng?Peng1，2， SHI Xiang?Wei1，2， YING Min1，2， ZHENG Ning1，2， LI Mei1，

ZHANG Zhi?Jian1， WU Yang1， WANG Hua?Dong1，2， WANG Jie1，2， HU Liang1， JIA Fan1，2， XU Fu?Qiang1，2

1（Brain Research Center， Wuhan Institute of Physics and Mathematics，

Chinese Academy of Sciences， Wuhan 430071， China）

2（University of Chinese Academy of Sciences， Beijing 100049， China）

Abstract?The brain is probably the most complex system. Neurocircuits， formed by various types of neurons through synaptic connections， are the basis of brain functions， from the basic homeostasis， senses and perception， for learning， memory， decision?making， and consciousness. Therefore， it is of great significance to understand the component and working principle of neurocircuits， so as to recognize， utilize and protect the brain. Techniques for exploring the structure and function of neurocircuits include circuit?tracing， manipulating， imaging and data?analyzing. In this paper， we focus on the neurocircuit tracers based on neurotropic viruses and its application technology. The categories and characteristics， genetic modification， selection principles and application limitations of commonly used neurotropic viral tools will be discussed. The non?transsynaptic tracer system， the trans?monosynaptic tracer system and the trans?multisynaptic tracer system are also introduced to help readers understand the commonly used circuit tracing methods and research progress.

Keywords?Neural circuit; ?Tools based on neurotropic virus; ?Retrograde; ?Anterograde; ?Helper virus; Review