薛亦飛 肖通方 蔣亞楠 吳菲 于萍 毛蘭群

摘?要?腦科學(xué)已經(jīng)成為多學(xué)科交叉研究的前沿領(lǐng)域之一， 其中腦神經(jīng)化學(xué)的研究由于能夠揭示腦活動(dòng)和腦疾病過(guò)程中的物質(zhì)基礎(chǔ)， 在神經(jīng)科學(xué)和化學(xué)等領(lǐng)域引起了高度關(guān)注。電化學(xué)分析方法具有高靈敏度、高時(shí)空分辨、電極/溶液界面可設(shè)計(jì)等特點(diǎn)， 尤其適用于在活體動(dòng)物層次開(kāi)展腦神經(jīng)化學(xué)的分析研究。本文圍繞活體原位電化學(xué)分析方法的原理和特點(diǎn)， 綜述了近年來(lái)電化學(xué)分析方法在腦神經(jīng)化學(xué)研究中的應(yīng)用， 并對(duì)其未來(lái)的發(fā)展前景進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞?活體電化學(xué)分析; 腦神經(jīng)化學(xué); 原位檢測(cè); 評(píng)述

1?引 言

腦科學(xué)是目前國(guó)際前沿科技的熱點(diǎn)研究領(lǐng)域之一， 對(duì)腦功能的研究有助于理解人類認(rèn)知、情感等復(fù)雜生理過(guò)程的本質(zhì)， 以及神經(jīng)系統(tǒng)疾病的形成和發(fā)展規(guī)律。腦神經(jīng)信號(hào)的傳遞以及代謝過(guò)程都離不開(kāi)化學(xué)物質(zhì)的參與， 因此， 針對(duì)腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)、調(diào)質(zhì)、能量代謝物質(zhì)、自由基、離子等諸多神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)開(kāi)展腦神經(jīng)分析化學(xué)研究， 對(duì)于探索和認(rèn)識(shí)神經(jīng)生理、病理的分子機(jī)制， 都具有極其重要的意義。

腦神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的分析一般分為單囊泡、單細(xì)胞、腦片和活體等不同層次。其中， 在單囊泡、單細(xì)胞及腦片層次上進(jìn)行化學(xué)物質(zhì)檢測(cè)脫離了活體生存的真實(shí)環(huán)境， 較難保持細(xì)胞之間固有的聯(lián)系和相互作用。相比較而言， 活體層次對(duì)腦化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行分析， 能夠更加真實(shí)、直接地反映神經(jīng)系統(tǒng)在各種生理、病理過(guò)程中對(duì)外界刺激的響應(yīng)， 因而能夠?yàn)槟X神經(jīng)生理、病理過(guò)程物質(zhì)基礎(chǔ)的探索提供最為直接的信息。

電化學(xué)分析方法通常具有靈敏度高、選擇性好、時(shí)空分辨率高等優(yōu)點(diǎn)， 且檢測(cè)電極易于微型化， 適用于活體原位分析測(cè)定?；铙w原位電化學(xué)分析方法可望應(yīng)用于腦內(nèi)不同化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)水平及其在一系列生理、病理過(guò)程中濃度變化的監(jiān)測(cè)。腦神經(jīng)活體原位電化學(xué)分析可追溯到20世紀(jì)50年代， Clark等[1]利用玻璃封裝的鉑絲作為研究電極， 首次通過(guò)電化學(xué)伏安法實(shí)現(xiàn)了腦內(nèi)氧氣濃度變化的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。但是， 這一研究并沒(méi)有引起研究者們的廣泛關(guān)注。更為人們熟知的是， 1973年Adams 等[2]首次將微型碳糊電極植入大鼠腦中進(jìn)行活體電化學(xué)研究， 其電極結(jié)構(gòu)如圖1A所示。該研究得到了活體腦內(nèi)的第一張循環(huán)伏安圖（圖1B），進(jìn)一步驗(yàn)證了在腦內(nèi)使用電化學(xué)方法實(shí)現(xiàn)生理活性物質(zhì)檢測(cè)的可行性， 引起了神經(jīng)生理學(xué)家的高度關(guān)注， 標(biāo)志著活體原位腦神經(jīng)電化學(xué)分析的誕生。

近年來(lái)， 隨著分析科學(xué)、化學(xué)、電子科學(xué)、神經(jīng)科學(xué)等多學(xué)科的快速發(fā)展和交叉融合， 腦神經(jīng)活體原位電化學(xué)分析也不斷發(fā)展完善， 為相關(guān)生理、病理過(guò)程研究提供了重要的實(shí)驗(yàn)方法， 進(jìn)一步推動(dòng)了分析化學(xué)與腦神經(jīng)科學(xué)的實(shí)質(zhì)性交叉與融合。本文著重介紹活體原位電分析化學(xué)方法的原理、特點(diǎn)及其在腦神經(jīng)化學(xué)研究中應(yīng)用的進(jìn)展， 并對(duì)其發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行展望。

2?活體原位電化學(xué)分析方法

目前，在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域， 利用電化學(xué)分析方法可實(shí)現(xiàn)多種生理活性物質(zhì)的活體原位實(shí)時(shí)分析。表1列舉了一些重要的生理活性物質(zhì)及其活體原位電化學(xué)分析方法。

2.1?基于伏安法的活體原位電化學(xué)分析

伏安法是一類重要的電化學(xué)測(cè)量方法， 通過(guò)向電極施加調(diào)制的電壓波形， 測(cè)量電化學(xué)體系的電流響應(yīng)， 從而獲得電極過(guò)程的電位?電流關(guān)系。通過(guò)對(duì)伏安曲線波形和峰高等參數(shù)進(jìn)行分析， 可實(shí)現(xiàn)對(duì)于具有不同電化學(xué)參數(shù)的電化學(xué)活性物質(zhì)進(jìn)行定性與定量分析。伏安法選擇性高， 可實(shí)現(xiàn)單一或多種物質(zhì)同時(shí)的選擇性分析。然而， 伏安法的時(shí)間分辨率通常會(huì)受到掃描速率的限制， 同時(shí)施加的調(diào)制電壓波形也會(huì)對(duì)分析體系產(chǎn)生一定影響。

根據(jù)伏安法檢測(cè)過(guò)程中施加波形的不同又可將其分為脈沖伏安法和電勢(shì)掃描伏安法。其中， 脈沖伏安法的特點(diǎn)是可有效抑制背景充電電流， 并降低擴(kuò)散層變化的影響， 具有靈敏度高、選擇性高、可同時(shí)區(qū)分多種電化學(xué)活性物質(zhì)等優(yōu)勢(shì)， 但時(shí)間分辨率比較低， 無(wú)法記錄快速變化過(guò)程。自20世紀(jì)70年代以來(lái)， 以差分脈沖伏安法（Differential pulse voltammetry， DPV）為代表， 并包括常規(guī)脈沖伏安法（Normalpulse voltammetry， NPV）、 差分常規(guī)脈沖伏安法（Differential normal pulse voltammetry， DNPV）及方波伏安法（Square wave voltammetry， SWV）等在內(nèi)的脈沖伏安法逐漸被應(yīng)用于腦內(nèi)多種神經(jīng)遞質(zhì)的同時(shí)檢測(cè)。為了提高伏安法的時(shí)間分辨率， 實(shí)現(xiàn)短時(shí)間遞質(zhì)快速變化過(guò)程的實(shí)時(shí)分析， 以快速掃描循環(huán)伏安法（Fast scan cyclic voltammetry， FSCV）為主的電勢(shì)掃描伏安法在近幾十年中得到了很好的發(fā)展。FSCV方法可實(shí)現(xiàn)快速分析， 但背景電流大， 難以用于神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)水平的檢測(cè)和長(zhǎng)時(shí)程記錄。目前， 該方法主要應(yīng)用于多巴胺刺激釋放等電化學(xué)活性神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的快速變化過(guò)程研究。

2.1.1?DPV方法?DPV法是一種脈沖伏安測(cè)量技術(shù)。檢測(cè)過(guò)程中， 直流電壓以一定頻率和幅值進(jìn)行步進(jìn)掃描， 并在每次步進(jìn)時(shí)疊加固定幅值（10～100 mV）的方波脈沖， 記錄脈沖結(jié)束前和脈沖開(kāi)始前的電流差值。DPV檢測(cè)過(guò)程中采用的特殊脈沖波形、采樣方法以及電流差減運(yùn)算配合原位電化學(xué)檢測(cè)使用的微電極， 可有效排除雙電層充電電流以及擴(kuò)散層變化的影響， 顯著提高分析方法靈敏度和選擇性。對(duì)于氧化電位差大于100 mV的電活性物質(zhì)， 使用DPV方法可有效排除氧化還原電流的相互干擾， 實(shí)現(xiàn)不同物質(zhì)的區(qū)分及定量分析。

DPV方法在活體原位電化學(xué)分析領(lǐng)域的應(yīng)用可追溯到1976年， Lane等[22]首次使用經(jīng)KI溶液處理過(guò)的鉑微電極作為研究電極， 通過(guò)DPV方法實(shí)現(xiàn)了Sprague?Dawley（SD）大鼠尾狀核維生素C和兒茶酚胺濃度的同時(shí)檢測(cè)， 其電極結(jié)構(gòu)如圖2A所示。隨后， Gonon等[23]使用DPV方法實(shí)現(xiàn)了麻醉大鼠紋狀體腦區(qū)電化學(xué)活性神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的原位分析， 記錄到的DPV曲線如圖2B所示。通過(guò)干預(yù)實(shí)驗(yàn)對(duì)比， 最終將記錄到的兒茶酚電流信號(hào)歸屬為DOPAC。此后， DPV方法逐漸被應(yīng)用于電活性神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的多組分同時(shí)分析[24～26]。

DPV方法不僅可實(shí)現(xiàn)具有電化學(xué)活性神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的直接分析， 也可利用非電化學(xué)活性物質(zhì)與電極修飾材料間的相互作用， 實(shí)現(xiàn)部分電化學(xué)活性較差的神經(jīng)分子的間接檢測(cè)。Chai等[27]使用無(wú)銅衍生的超氧化物歧化酶（E2Zn2SOD）作為生物識(shí)別元件， 利用其與Cu2+的特異性相互作用， 構(gòu)筑了用于Cu2+檢測(cè)的電極界面， 利用DPV法實(shí)現(xiàn)了活體原位Cu2+的檢測(cè)， 方法靈敏、可靠。Zhao等[28]合成了一種二茂鐵吡啶衍生物（N?（6?aminopyridin?2?yl）ferrocene， Fc?Py）， 利用吡啶作為質(zhì)子響應(yīng)單元， 二茂鐵作為電化學(xué)響應(yīng)單元， 通過(guò)DPV方法實(shí)現(xiàn)了pH值的活體原位分析。

2.1.2?FSCV?FSCV是一種具有高時(shí)間分辨率的電勢(shì)掃描伏安法。以碳纖維微電極作為研究電極， 并以一定頻率施加大于100 V/s 掃速的三角波進(jìn)行循環(huán)伏安分析， 可達(dá)到毫秒級(jí)的時(shí)間分辨率[29]。在FSCV分析中， 隨著電位掃描速度的增加， 電化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)較慢的物質(zhì)將表現(xiàn)得更不可逆， 其氧化還原峰偏移程度大于電化學(xué)反應(yīng)速度較快的電活性物質(zhì)， 從而實(shí)現(xiàn)對(duì)不同電極過(guò)程動(dòng)力學(xué)的物質(zhì)進(jìn)行區(qū)分。FSCV與常規(guī)掃速（1～500 mV/s）下的循環(huán)伏安法不同， 電位掃描過(guò)程中， 由于雙電層充放電電流與掃速成正比， 而法拉第電流與掃速的平方根成正比。因此，高掃速下，循環(huán)伏安曲線中雙電層充放電所貢獻(xiàn)的非法拉第電流會(huì)明顯增大， 并成為能記錄到的總電流的主要組成部分， 影響對(duì)目標(biāo)分析物氧化還原過(guò)程法拉第電流的提取。通常，F(xiàn)SCV的結(jié)果會(huì)以變化前某一特定周期的FSCV數(shù)據(jù)作為背景進(jìn)行扣除， 以便降低背景電流的影響[30]?？鄢尘昂蟮腇SCV結(jié)果可進(jìn)行定性和定量分析。但是，由于背景扣除過(guò)程所扣除的一般是固定的循環(huán)伏安數(shù)據(jù)， 這將導(dǎo)致在長(zhǎng)時(shí)間電化學(xué)分析中雙電層結(jié)構(gòu)變化所造成的背景電流漂移不斷積累， 對(duì)分析結(jié)果產(chǎn)生較大影響。因此， 該方法持續(xù)分析時(shí)間通常約1 min， 不宜進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的連續(xù)分析。此外， 背景扣除導(dǎo)致了FSCV法很難實(shí)現(xiàn)腦內(nèi)神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的基礎(chǔ)水平測(cè)定[31]。

目前， FSCV方法應(yīng)用較為成熟的測(cè)定體系是對(duì)腦內(nèi)兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)（尤其是多巴胺）快速變化過(guò)程的原位實(shí)時(shí)分析[32]?；铙w分析過(guò)程中， 在每個(gè)施加的三角波之間通常會(huì)將研究電極維持在負(fù)電位（如Symbolm@@

0.4 V）下， 利于兒茶酚胺類物質(zhì)在電極表面的富集， 從而提高檢測(cè)的靈敏度[33]。同時(shí)， 帶負(fù)電的物質(zhì)不會(huì)得到富集，在一定程度上也提高了FSCV對(duì)兒茶酚胺類物質(zhì)檢測(cè)的選擇性。在高掃速下， 多巴胺等具有較快電子轉(zhuǎn)移速率的電化學(xué)活性物質(zhì)的氧化還原電流得到大幅提高; 另一方面也使得抗壞血酸等電子轉(zhuǎn)移速度相對(duì)較慢的干擾物質(zhì)在電極上表現(xiàn)得更不可逆， 其氧化峰正移， 進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)多巴胺等物質(zhì)的選擇性檢測(cè)[34，35]。

FSCV方法雖然具有良好的選擇性和靈敏度， 并能夠?qū)崿F(xiàn)高時(shí)間分辨， 但由于腦神經(jīng)系統(tǒng)中多種電化學(xué)活性生理物質(zhì)具有相近的氧化電位， 導(dǎo)致產(chǎn)生的氧化還原電流相互交疊， 不容易區(qū)分與精準(zhǔn)定量。因此， 早期的FSCV方法主要用作神經(jīng)化學(xué)過(guò)程中電化學(xué)活性物質(zhì)的定性和半定量研究。Wightman 等[36]利用不同顏色代表不同電流值， 將一組FSCV數(shù)據(jù)拼合繪制成“電位?時(shí)間?電流”二維圖， 即可通過(guò)二維圖中不同的圖案直觀地看出不同時(shí)間不同電化學(xué)活性物質(zhì)濃度的變化過(guò)程， 為人們研究復(fù)雜生理病理過(guò)程中物質(zhì)的變化提供了可能。

采用FSCV方法進(jìn)行定量分析時(shí)， 通常在目標(biāo)分析物FSCV結(jié)果中選取氧化還原電流較大， 且無(wú)其它物質(zhì)干擾電位下的電流值， 以此繪制出電流隨時(shí)間變化的曲線， 或根據(jù)線性關(guān)系換算為濃度?時(shí)間曲線。然而， 這種方法在多種物質(zhì)變化的復(fù)雜體系中存在很大的局限性。為了解決FSCV方法在復(fù)雜體系中的定量問(wèn)題， Heien等[37]將主成分回歸（Principal component regression， PCR）應(yīng)用于多種物質(zhì)變化的復(fù)雜體系下FSCV結(jié)果的定量分析。他們發(fā)現(xiàn)， 多巴胺的FSCV波形與不同pH值造成的FSCV波形變化有明顯差異， 如圖3A和3B所示。采用主成分回歸方法可將FSCV波形中多巴胺的氧化還原波形和pH值造成的波形變化進(jìn)行有效地區(qū)分， 并逐漸發(fā)展出多巴胺和pH值雙組分同時(shí)測(cè)定的方法[4， 38]。隨后， Heien等[39]利用該方法研究了可卡因?qū)ξ矤詈四X區(qū)多巴胺釋放的調(diào)控， 以及該過(guò)程中的pH值變化（圖3C）。

在FSCV分析時(shí)， 主成分回歸方法雖然可用于解決多種神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的區(qū)分和定量問(wèn)題， 但由于雙電層變化導(dǎo)致的背景電流漂移卻無(wú)法通過(guò)主成分回歸消除。為了使主成分回歸算法計(jì)算結(jié)果真實(shí)有效， FSCV方法應(yīng)用于活體分析的持續(xù)時(shí)間通常短于90 s[4]。很多研究組也通過(guò)優(yōu)化FSCV分析中所使用的電極和數(shù)據(jù)處理方法， 使其能夠進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的活體分析。如Clark等[40]將直徑7 μm的碳纖維封裝在直徑90 μm的熔融玻璃毛細(xì)管中， 發(fā)現(xiàn)電極尺寸的減小可明顯降低其對(duì)腦組織的損傷， 并減少免疫反應(yīng)， 從而使電極具有良好的生物兼容性。利用此電極， 實(shí)現(xiàn)了對(duì)腦內(nèi)多巴胺長(zhǎng)達(dá)10～16 周的活體分析。Schwerdt等[41]進(jìn)一步優(yōu)化了長(zhǎng)時(shí)間記錄時(shí)FSCV的數(shù)據(jù)處理方法， 通過(guò)將持續(xù)記錄的FSCV數(shù)據(jù)分割成多個(gè)50 s時(shí)長(zhǎng)， 分別進(jìn)行主成分回歸分析， 再將分析結(jié)果拼合即可得到較長(zhǎng)時(shí)間的檢測(cè)結(jié)果， 最終實(shí)現(xiàn)了使用長(zhǎng)期植入陣列電極進(jìn)行非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物腦內(nèi)多巴胺變化的長(zhǎng)時(shí)程監(jiān)測(cè)。

2.2?基于安培法的活體原位電化學(xué)分析

安培法（Amperometry）是一種通過(guò)向研究電極施加恒定電位， 從而實(shí)現(xiàn)對(duì)電化學(xué)活性物質(zhì)定量分析的電化學(xué)方法。其特點(diǎn)在于， 測(cè)量過(guò)程中研究電極維持恒定電位， 從而降低雙電層充電電流的影響。因此， 相對(duì)于FSCV方法， 安培法可進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的持續(xù)分析檢測(cè)。但是， 安培法只能提供某一固定電位下的電流信息， 因此， 分析方法的選擇性完全取決于電極界面的反應(yīng)和設(shè)定的電位。近年來(lái)， 安培法逐漸成為活體原位電化學(xué)分析中的主要方法之一。通過(guò)合理構(gòu)筑電極/溶液界面， 調(diào)控物種的電極反應(yīng)動(dòng)力學(xué)， 一些神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)（如維生素C、O2、H2O2、NO、H2S）都可通過(guò)安培法實(shí)現(xiàn)活體原位分析。

2.2.1?維生素C的活體原位電化學(xué)分析?維生素C（Vitamin C or ascorbic acid， AA）是神經(jīng)系統(tǒng)中的一種重要神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)， 具有較強(qiáng)的還原性， 在許多生理病理過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。在多數(shù)碳電極表面， 維生素C的電化學(xué)過(guò)程表現(xiàn)為內(nèi)殼層反應(yīng)， 極易受到電極表面物理化學(xué)性質(zhì)的影響。同時(shí)， 維生素C的電化學(xué)氧化會(huì)產(chǎn)生具有非電化學(xué)活性、易吸附于電極表面的水解產(chǎn)物， 導(dǎo)致電極靈敏度下降。因此， 維生素C在常規(guī)的碳纖維電極上表現(xiàn)出較慢的電子轉(zhuǎn)移速率、高的過(guò)電位和較差的穩(wěn)定性[42， 43]。Zhang 等[10， 44]首先發(fā)現(xiàn)在碳納米管修飾電極上維生素C具有較低的氧化過(guò)電位， 可用于維生素C的原位檢測(cè)（圖4A）。他們使用多壁碳納米管修飾碳纖維電極在維生素C溶液中進(jìn)行循環(huán)伏安分析， 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， 維生素C的氧化電流在0.0 V（相比于標(biāo)準(zhǔn)Ag/AgCl電極）就達(dá)到了穩(wěn)態(tài)（圖4B）。該電位下不會(huì)發(fā)生多巴胺、5?羥色胺、DOPAC等其它腦內(nèi)常見(jiàn)神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的氧化， 說(shuō)明多壁碳納米管修飾碳纖維電極可實(shí)現(xiàn)維生素C的高選擇性分析（圖4C）。此外， 他們發(fā)現(xiàn)碳納米管電極還可提高維生素C連續(xù)測(cè)定的穩(wěn)定性?；谶@些性能， 成功建立了鼠腦內(nèi)維生素C的活體原位電化學(xué)分析新方法。

隨后， Xiang等[45]制備了陣列碳納米管包覆的碳纖維電極， 將電極植入鼠腦紋狀體， 并施加+0.05 V（vs. Ag/AgCl）的極化電壓， 利用安培法實(shí)現(xiàn)了腦內(nèi)維生素C的活體原位分析。基于該方法高的時(shí)空分辨率， 通過(guò)在微電極附近灌注谷氨酸溶液， 他們?cè)诨铙w層次觀察到了腦神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)抗壞血酸?谷氨酸的“異相交換”過(guò)程。

Xiao等[11，46]利用電泳的方法將單壁碳納米管沉積于碳纖維電極的表面， 并通過(guò)高溫和電化學(xué)處理， 得到了對(duì)維生素C具有高選擇性和高穩(wěn)定性的碳納米管電極。該方法制備的電極具有高度的一致性， 解決了碳納米管在碳纖維電極表面制備重現(xiàn)性差的問(wèn)題。他們將制備的電極植入鼠腦皮層， 在+0.05 V極化電位下， 首次在活體動(dòng)物層次觀測(cè)到了癲癇模型和擴(kuò)散性抑制過(guò)程中腦內(nèi)維生素C濃度升高的現(xiàn)象（圖5A和5B）， 為進(jìn)一步研究這些病理過(guò)程中的分子機(jī)制提供了直接的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

2.2.2?氧氣的原位電化學(xué)檢測(cè)?氧氣在生命體中發(fā)揮著重要的作用。氧氣供給不足會(huì)造成神經(jīng)系統(tǒng)能量代謝困難， 增加氧化應(yīng)激壓力， 甚至造成細(xì)胞損傷。因此， 對(duì)腦內(nèi)氧氣濃度的原位檢測(cè)將直接反映神經(jīng)系統(tǒng)的活動(dòng)功能。利用安培法進(jìn)行氧氣活體原位分析的關(guān)鍵問(wèn)題在于， 在以金和碳等材料為基底的電極表面， 氧氣電化學(xué)還原過(guò)程通常以兩步兩電子還原為主， 生成過(guò)氧化氫中間產(chǎn)物[47]。而在鉑基電極材料表面， 氧氣電化學(xué)還原過(guò)程以四電子還原為主， 最終生成水[48]。在活體原位分析中， 考慮到氧氣兩電子電化學(xué)還原過(guò)程生成的過(guò)氧化氫中間產(chǎn)物可能會(huì)對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)造成損傷[49]， 所以鉑基電極能夠較好適用于腦內(nèi)氧氣的活體電化學(xué)分析[50， 51]。Xiang 等[52]使用電沉積的方法， 在垂直生長(zhǎng)碳納米管的碳纖維電極（圖6A）上通過(guò)循環(huán)伏安法電化學(xué)沉積鉑， 最終得到表面均勻覆蓋鉑納米顆粒的修飾電極（圖6B）。在Symbolm@@

0.5 V的電位下， 該電極對(duì)氧氣檢測(cè)表現(xiàn)出較高的靈敏度和選擇性， 其它腦內(nèi)常見(jiàn)的生理活性物質(zhì)均不會(huì)對(duì)氧氣檢測(cè)產(chǎn)生干擾（圖6C）。為了進(jìn)一步降低電極表面蛋白污染， 提高電極對(duì)氧氣檢測(cè)的穩(wěn)定性， 他們用Nafion膜修飾電極， 最終實(shí)現(xiàn)了氧氣的四電子電化學(xué)還原和選擇性測(cè)定， 以及大鼠海馬腦區(qū)在全腦缺血?再灌注時(shí)氧氣濃度變化的活體原位分析（圖6D）。

2.2.3?基于離子傳輸?shù)脑浑娀瘜W(xué)分析?神經(jīng)生理物質(zhì)中的非電化學(xué)活性分子， 一般可采用生物傳感器進(jìn)行檢測(cè)。然而酶等生物識(shí)別元件有限， 限制了該方法在活體原位電化學(xué)分析中的發(fā)展。近年來(lái)， 基于離子傳輸構(gòu)建的電化學(xué)分析方法逐漸成為活體分析新的發(fā)展方向[53]。He等[54]首次報(bào)道了聚電解質(zhì)刷修飾后玻璃微米管的整流行為。在此基礎(chǔ)上， Zhang 等[55]通過(guò)在玻璃微米管內(nèi)壁共修飾聚電解質(zhì)刷以及Aptamer實(shí)現(xiàn)了ATP的選擇性檢測(cè)。 Colombo等[56， 57]通過(guò)在玻璃納米孔中構(gòu)建液?液界面， 基于離子傳輸原理實(shí)現(xiàn)了對(duì)多巴胺、乙酰膽堿、5?羥色胺的檢測(cè)。由于這一電化學(xué)分析新方法的原理是對(duì)微/納孔道內(nèi)離子流進(jìn)行檢測(cè)， 不需要待測(cè)物在電極表面發(fā)生電化學(xué)氧化還原反應(yīng)， 預(yù)期該方法在電化學(xué)惰性物質(zhì)的活體電化學(xué)分析中具有很高的應(yīng)用潛力。

2.3?基于電位法的活體原位電化學(xué)分析

電位法（Potentiometry）是一種在開(kāi)路狀態(tài)下， 直接記錄研究電極相對(duì)于參比電極的電位來(lái)分析電極表面目標(biāo)物濃度的分析方法。相對(duì)于伏安法和安培法， 電位法的優(yōu)勢(shì)在于， 測(cè)量回路中電流幾乎為零， 排除了因測(cè)量而產(chǎn)生的電流對(duì)腦神經(jīng)的影響。根據(jù)能斯特方程， 在平衡狀態(tài)下， 電極開(kāi)路電位（Open?circuit potential， OCP）的變化是由電極溶液界面各種化學(xué)物質(zhì)的活度決定的。通過(guò)設(shè)計(jì)選擇性識(shí)別單元， 可顯著提高開(kāi)路電位對(duì)特定物質(zhì)濃度變化響應(yīng)的靈敏度， 并降低其它物質(zhì)的干擾， 從而實(shí)現(xiàn)定量分析。

電位法通常用于離子等非電化學(xué)活性物質(zhì)測(cè)定， 例如， 在微電極表面修飾離子選擇性膜作為識(shí)別單元， 構(gòu)建全固態(tài)離子選擇性電極， 可實(shí)現(xiàn)腦內(nèi)H+、K+、Ca2+等活體原位分析。Hao等[58]將質(zhì)子選擇性膜修飾于碳纖維電極上， 制備了對(duì)H+具有選擇性好和抗污染性能強(qiáng)的全固態(tài)pH選擇性電極， 電極靈敏度達(dá)到58.4 mV/pH， 接近Nernst方程的理論值。利用該電極， 他們?cè)粰z測(cè)了大鼠吸入CO2后恐慌過(guò)程中腦內(nèi)pH值變化。

除了對(duì)離子進(jìn)行檢測(cè)， 近年出現(xiàn)了一種基于原電池原理的電位測(cè)定方法（Galvanic redox potentiometry， GRP）， 利用陽(yáng)極作為指示電極測(cè)定分析物電化學(xué)氧化電位， 陰極作為參比電極， 通常設(shè)計(jì)為氧還原過(guò)程。使用具有高電阻的電位計(jì)將陰極、陽(yáng)極連成回路（圖7A）。由于回路具有高阻抗， 因此回路中電流很小， 電極過(guò)程近似處于熱力學(xué)平衡態(tài)。當(dāng)陰極還原電位高于陽(yáng)極氧化電位時(shí)， 整個(gè)回路中的電化學(xué)過(guò)程可自發(fā)進(jìn)行， 其輸出的電壓值可作為定量物質(zhì)濃度的指標(biāo)[59]， 最終實(shí)現(xiàn)電化學(xué)活性物質(zhì)的檢測(cè)分析。Wu等[60]利用漆酶修飾的碳纖維電極插入到毛細(xì)管內(nèi)指示溶液中氧氣還原電位， 提高了該GRP體系中作為參比的陰極氧氣的還原電位。檢測(cè)過(guò)程中毛細(xì)管內(nèi)溶液氧氣濃度保持恒定， 提高了體系的靈敏度和穩(wěn)定性。蛋白吸附污染并不會(huì)影響GRP體系的靈敏度（圖7B）， 說(shuō)明該方法具有較高的抗污染干擾能力。他們將碳納米管修飾的碳纖維電極陽(yáng)極與漆酶修飾的碳纖維電極陰極植入大鼠的大腦皮層， 實(shí)現(xiàn)了大鼠全腦缺血/再灌注過(guò)程中腦內(nèi)抗壞血酸的活體原位測(cè)定（圖7C）。

3?總結(jié)與展望

腦神經(jīng)活體原位電化學(xué)分析是活體分析研究的重要手段之一， 不同電化學(xué)方法根據(jù)其特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)可用于不同的活體原位分析。目前， 通過(guò)選擇合適的電化學(xué)方法， 設(shè)計(jì)合理的電極界面， 可實(shí)現(xiàn)多種神經(jīng)生理物質(zhì)的原位分析， 對(duì)于腦科學(xué)的研究起到了較好的推動(dòng)作用。然而， 目前仍然還有很多重要神經(jīng)生理物質(zhì)， 尤其是非電化學(xué)活性物質(zhì)， 仍然難以通過(guò)現(xiàn)有的電化學(xué)分析方法進(jìn)行活體原位檢測(cè)。而許多已有的活體原位電化學(xué)分析方法， 仍然面臨著問(wèn)題和挑戰(zhàn)。例如， 利用微電極進(jìn)行活體原位分析檢測(cè)時(shí)， 普遍存在電極在活體環(huán)境中的穩(wěn)定性和抗污染問(wèn)題， 活體檢測(cè)環(huán)境與體外校正環(huán)境存在差異等。對(duì)于活體原位電化學(xué)分析研究而言， 其最終目標(biāo)是， 在最大程度減少對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物損傷影響的條件下， 精準(zhǔn)地記錄生理和病理過(guò)程中神經(jīng)分子的變化。因此， 電極/腦界面的設(shè)計(jì)和調(diào)控[61，62]、電極表面抗污染[63， 64]， 電極進(jìn)一步微型化[65，66]、柔性化[67]、記錄設(shè)備小型化、無(wú)線化[68～70]等， 都應(yīng)為未來(lái)的重點(diǎn)研究?jī)?nèi)容。此外， 利用所發(fā)展的活體原位電化學(xué)分析方法， 實(shí)現(xiàn)與腦神經(jīng)科學(xué)家的實(shí)質(zhì)性合作， ?在活體層次發(fā)現(xiàn)并描述腦神經(jīng)生理和病理過(guò)程的分子事件， 也將是活體電化學(xué)分析領(lǐng)域的研究核心之一。

References

1?Clark L C， Misrahy G， Fox R P. J. Appl. Physiol.， 1958， 13（1）： 85-91

2?Kissinger P T， Hart J B， Adams R N. Brain Res.， ?1973， ?55（1）： 209-213

3?Johnson J A， Hobbs C N， Wightman R M. Anal. Chem.， ?2017， ?89（11）： 6166-6174

4?Keithley R B， Wightman R M. ACS Chem. Neurosci.， ?2011， ?2（9）： 514-525

5?Crespi F， Martin K， Marsden C. Neuroscience， ?1988， ?27（3）： 885-896

6?Travis E R， Wang Y M， Michael D J， Caron M G， Wightman R M. Proc. Natl. Acad. Sci. USA， ?2000， ?97（1）： 162-167

7?Burmeister J J， Gerhardt G A. Anal. Chem.， ?2001， ?73（5）： 1037-1042

8?ZHAO Fan， SHI Guo?Yue， TIAN Yang. Chinese J. Anal. Chem.， ?2019， ?47（3）： 347-354

趙 凡， 施國(guó)躍， 田 陽(yáng). 分析化學(xué)， 2019， ?47（3）： 347-354

9?Garguilo M G， Michael A C. J. Am. Chem. Soc.， ?1993， ?115（25）： 12218-12219

10?Zhang M， Liu K， Xiang L， Lin Y， Su L， Mao L. Anal. Chem.， ?2007， ?79（17）： 6559-6565

11?Xiao T， Jiang Y， Ji W， Mao L. Anal. Chem.， ?2018， ?90（7）： 4840-4846

12?Csoeregi E， Quinn C P， Schmidtke D W， Lindquist S?E， Pishko M V， Ye L， Katakis I， Hubbell J A， Heller A. Anal. Chem.， ?1994， ?66（19）： 3131-3138

13?Burmeister J J， Palmer M， Gerhardt G A. Biosens. Bioelectron.， ?2005， ?20（9）： 1772-1779

36?Michael D， Travis E R， Wightman R M. Anal. Chem.， ?1998， ?70（17）： 586A-592A

37?Heien M， Johnson M A， Wightman R M. Anal. Chem.， ?2004， ?76（19）： 5697-5704

38?Keithley R B， Heien M L， Wightman R M. TrAC?Trends Anal. Chem.， ?2009， ?28（9）： 1127-1136

39?Heien M， Khan A S， Ariansen J L， Cheer J F， Phillips P E M， Wassum K M， Wightman R M. Proc. Natl. Acad. Sci. USA， ?2005， ?102（29）： 10023-10028

40?Clark J J， Sandberg S G， Wanat M J， Gan J O， Horne E A， Hart A S， Akers C A， Parker J G， Willuhn I， Martinez V， Evans S B， Stella N， Phillips P E M. Nat. Methods， ?2010， ?7（2）： 126-132

41?Schwerdt H N， Shimazu H， Amemori K I， Amemori S， Tierney P L， Gibson D J， Hong S， Yoshida T， Langer R， Cima M J， Graybiel A M. Proc. Natl. Acad. Sci. USA， ?2017， ?114（50）： 13260-13265

42?Pisoschi A M， Pop A， Serban A I， Fafaneata C. Electrochim. Acta， ?2014， ?121： 443-460

43?Cheng H， Li L， Zhang M， Jiang Y， Yu P， Ma F， Mao L. TrAC?Trends Anal. Chem.， ?2018， ?109： 247-259

44?Zhang M， Liu K， Gong K， Su L， Chen Y， Mao L. Anal. Chem.， ?2005， ?77（19）： 6234-6242

45?Xiang L， Yu P， Hao J， Zhang M， Zhu L， Dai L， Mao L. Anal. Chem.， ?2014， ?86（8）： 3909-3914

46?Xiao T， Wang Y， Wei H， Yu P， Jiang Y， Mao L. Angew. Chem. Int. Edit.， ?2019， ?58（20）： 6616-6619

47?Kruusenberg I， Alexeyeva N， Tammeveski K. Carbon， ?2009， ?47（3）： 651-658

48?Chen Z， Waje M， Li W， Yan Y. Angew. Chem. Int. Edit.， ?2007， ?46（22）： 4060-4063

49?Ledo A， Lourenco C F， Laranjinha J， Brett C M， Gerhardt G A， Barbosa R M. Anal. Chem.， ?2017， ?89（3）： 1674-1683

50?Jung S K， Gorski W， Aspinwall C A， Kauri L M， Kennedy R T. Anal. Chem.， ?1999， ?71（17）： 3642-3649

51?You T， Niwa O， Tomita M， Hirono S. Anal. Chem.， ?2003， ?75（9）： 2080-2085

52?Xiang L， Yu P， Zhang M， Hao J， Wang Y， Zhu L， Dai L， Mao L. Anal. Chem.， ?2014， ?86（10）： 5017-5023

53?JIANG Xiao?Jing， LIANG Rong?Ning， QIN Wei. Chinese J. Anal. Chem.， ?2018， ?46（9）： 1350-1356

姜曉晶， 梁榮寧， 秦 偉. ?分析化學(xué)， 2018， ?46（9）： 1350-1356

54?He X， Zhang K， Li T， Jiang Y， Yu P， Mao L. J. Am. Chem. Soc.， ?2017， ?139（4）： 1396-1399

55?Zhang K， He X， Liu Y， Yu P， Fei J， Mao L. Anal. Chem.， ?2017， ?89（12）： 6794-6799

56?Colombo M L， McNeil S， Iwai N， Chang A， Shen M. J. Electrochem. Soc.， ?2016， ?163（4）： H3072-H3076

57?Colombo M L， Sweedler J V， Shen M. Anal. Chem.， ?2015， ?87（10）： 5095-5100

58?Hao J， Xiao T， Wu F， Yu P， Mao L. Anal. Chem.， ?2016， ?88（22）： 11238-11243

59?Wu F， Yu P， Mao L. Chem. Soc. Rev.， ?2017， ?46（10）： 2692-2704

60?Wu F， Cheng H， Wei H， Xiong T， Yu P， Mao L. Anal. Chem.， ?2018， ?90（21）： 13021-13029

61?CHENG Han， LAN Jia?Feng， WEI Guang?Han， HUANG Wei?Hua， CHENG Jie?Ke. Chinese J. Anal. Chem.， ?2013， ?41（4）： 540-545

程 寒， 蘭嘉峰， 韋光漢， 黃衛(wèi)華， 程介克. ?分析化學(xué)， 2013， ?41（4）： 540-545

62?HE Quan?Guo， LIANG Jing， LI Guang?Li， DENG Pei?Hong， LIU Jun， LIU Xiao?Peng. Chinese J. Anal. Chem.， ?2018， ?46（3）： 438-445

賀全國(guó)， 梁 靜， 李廣利， 鄧培紅， 劉 軍， 劉曉鵬. ?分析化學(xué)， 2018， ?46（3）： 438-445

63?Liu X， Zhang M， Xiao T， Hao J， Li R， Mao L. Anal. Chem.， ?2016， ?88（14）： 7238-7244

64?Liu X， Xiao T， Wu F， Shen M， Zhang M， Yu H， Mao L. Angew. Chem.Int. Edit.， ?2017， ?56（39）： 11802-11806

65?YANG Li?Li， SONG Yi?Lin， XU Sheng?Wei， ZHANG Yu， XIAO Gui?Hua， ZHANG Song， GAO Fei， LI Zi?Yue， CAI Xin?Xia. Chinese J. Anal. Chem.， ?2017， ?45（7）： 1088-1095

楊麗麗， 宋軼琳， 徐聲偉， 張 禹， 肖桂花， 張 松， 高 飛， 李子岳， 蔡新霞. ?分析化學(xué)， 2017， ?45（7）： 1088-1095

66?Kozai T D Y， Langhals N B， Patel P R， Deng X， Zhang H， Smith K L， Lahann J， Kotov N A， Kipke D R. Nat. Mater.， ?2012， ?11（12）： 1065-1073

67?Guan S， Wang J， Gu X， Zhao Y， Hou R， Fan H， Zou L， Gao L， Du M， Li C， Fang Y. Sci. Adv.， ?2019， ?5（3）： eaav2842

68?QIN Tai?Chun， LI Xiao?Gang， HAO Jie， YU Ping， MAO Lan?Qun. Chinese J. Anal. Chem.， ?2015， ?43（3）： 457-462

秦泰春， 李曉鋼， 郝 潔， 于 萍， 毛蘭群. ?分析化學(xué)， 2015， ?43（3）： 457-462

69?LI Xiao?Gang， GUO Bin?Qian， QIN Tai?Chun， HAO Jie， YU Ping， MAO Lan?Qun. Chinese J. Anal. Chem.， ?2016， ?44（9）： 1465-1470

李曉鋼， 郭彬乾， 秦泰春， 郝 潔， 于 萍， 毛蘭群. ?分析化學(xué)， 2016， ?44（9）： 1465-1470

70?SUN Jian?Hui， CAI Xin?Xia， LIU Jun?Tao， WANG Chun?Xing， LI Deng?Wang， CHEN Ze?Yuan， CHENG Chuan?Fu， WANG Jin?Hui， HU Dong?Mei. Chinese J. Anal. Chem.， ?2017， ?45（4）： 611-619

孫建輝， 蔡新霞， 劉軍濤， 王春興， 李登旺， 陳澤源， 程傳福， 汪金輝， 胡冬梅. ?分析化學(xué)， 2017， ?45（4）： 611-619

Progress of in Vivo Electrochemical Analysis

of Brain Neurochemistry

XUE Yi?Fei1，2， XIAO Tong?Fang1， JIANG Ya?Nan1，2，

WU Fei1，2， YU Ping1，2， MAO Lan?Qun*1，2

1（Beijing National Laboratory for Molecular Sciences， Key Laboratory of Analytical Chemistry

for Living Biosystems， Institute of Chemistry， Chinese Academy of Sciences， Beijing 100190， China）

2（University of Chinese Academy of Sciences， Beijing 100049， China）

Abstract?Brain science has become one of the most advanced interdisciplinary research topics. Analysis of brain neurochemistry has attracted great attention in both neuroscience and chemistry， because it provides a powerful tool to understand the physiological and pathological progresses of the brain at a molecular level. For neurochemical monitoring， electrochemical methods come to prominence with high selectivity， sensitivity， spatiotemporal resolution and designable electrode/solution interface to match the pursuit for in vivo analysis of brain neurochemistry. This review summarizes the development of electrochemical approaches toward brain neurochemistry research from both principal and practical perspectives. In addition， future trends of in vivo electrochemical analysis are prospected.

Keywords?In vivo electrochemistry; Brain neurochemistry; In vivo measurement; Review

（Received 30 July 2019; accepted 16 August 2019）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （Nos. 21790390， 21790391， 21621062， 21874139） and the National Key Research and Develop Program of China （No.2018YFE0200800）.