馮濤濤　張帥　張麗　張美寧

摘?要?活體電化學(xué)分析方法是利用微電極植入特定腦區(qū)原位監(jiān)測腦內(nèi)神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)動態(tài)變化的方法之一，具有高時(shí)空分辨率、高靈敏度、對腦組織損傷小等優(yōu)點(diǎn)。然而，微電極的植入會引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生一系列的排異反應(yīng)，這將對微電極的電分析性能產(chǎn)生不利影響。一方面，蛋白質(zhì)的非特異性吸附會導(dǎo)致微電極的靈敏度和選擇性下降;另一方面，蛋白質(zhì)介導(dǎo)的細(xì)胞粘附，其代謝過程會導(dǎo)致電極周圍的微化學(xué)環(huán)境改變，從而影響微電極對神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)檢測的準(zhǔn)確性。最終，電極表面上形成的纖維囊會阻礙電子（電荷）的轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致微電極無法正常工作。本文首先簡要介紹了蛋白質(zhì)非特異性吸附對電極電化學(xué)性能的影響，以及近年來發(fā)展的電極抗蛋白質(zhì)吸附的方法和策略，對活體原位電化學(xué)分析中抗蛋白質(zhì)吸附的研究進(jìn)展做評綜述，并對活體微電極抗蛋白質(zhì)吸附存在的問題及未來的發(fā)展進(jìn)行了總結(jié)和展望。

關(guān)鍵詞?活體分析; 微電極; 蛋白質(zhì)吸附; 抗蛋白質(zhì)吸附; 評述

1?引 言

腦是生命體中精密又復(fù)雜的系統(tǒng)，通常神經(jīng)元的集體行為會產(chǎn)生大腦功能的變化，神經(jīng)元之間信息的傳遞本質(zhì)上是神經(jīng)遞質(zhì)在神經(jīng)元突觸間的傳遞[1，2]。了解神經(jīng)元所處的微化學(xué)環(huán)境以及信息傳遞中的分子機(jī)制對深刻理解大腦功能具有十分重要的意義; 對許多中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）疾病，如多發(fā)性硬化（MS）、阿茲海默癥（AD）和癲癇的治療及預(yù)防具有重要指導(dǎo)意義。神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)主要包括：神經(jīng)元信息傳遞中起著重要作用的遞質(zhì)，如單胺類遞質(zhì)（多巴胺、去甲腎上腺素、腎上腺素等），氨基酸類遞質(zhì)（谷氨酸、氨基丁酸等），神經(jīng)調(diào)質(zhì)（抗壞血酸等），離子（H+、K+、Zn2+、Ca2+、Mg2+等），活性氧自由基（H2O2、O

2等），能量代謝物質(zhì)（葡萄糖、ATP等），氨基酸，脂質(zhì)，多肽，磷脂，蛋白質(zhì)，核酸（DNA和RNA）和參與神經(jīng)活動的其它的化學(xué)物質(zhì)（乙酰膽堿、神經(jīng)肽等）。因此，實(shí)時(shí)監(jiān)測腦內(nèi)神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的動態(tài)變化，對于更好地認(rèn)識與腦相關(guān)的生理及病理學(xué)過程具有重要的意義[3～6]。

活體原位電化學(xué)分析方法是將微電極植入特定腦區(qū)原位監(jiān)測神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)動態(tài)變化的方法[7～9]，該方法因具有高時(shí)空分辨率、高靈敏度和對腦組織損傷小等優(yōu)勢，受到越來越多的關(guān)注[10～16]。但腦環(huán)境較為復(fù)雜， 不僅存在許多小分子物質(zhì)，而且還包含許多生物大分子。當(dāng)微電極植入到腦組織時(shí)，生物大分子（特別是蛋白質(zhì)）會迅速地吸附在微電極表面（此過程被認(rèn)為是生物污染的第一步）。吸附的蛋白質(zhì)會覆蓋電極表面部分活性位點(diǎn)， 阻止物質(zhì)傳輸和電子（電荷）轉(zhuǎn)移，最終導(dǎo)致微電極的靈敏度和選擇性降低[17，18]。此外，微電極將不可避免地導(dǎo)致一系列不良的生物反應(yīng)，如細(xì)胞黏附、血小板活化、血栓形成以及補(bǔ)體激活[19，20]。這些過程將會導(dǎo)致電極周圍化學(xué)環(huán)境的改變，從而影響微電極對神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)檢測的準(zhǔn)確性。此外，形成的纖維囊會完全阻礙電極表面上的電子轉(zhuǎn)移和物質(zhì)傳輸，從而導(dǎo)致微電極無法正常工作（圖1）。因此，抑制蛋白質(zhì)的非特異性吸附在一定程度上可防止電極表面生物污染。本文將簡單地介紹蛋白質(zhì)吸附對電極性能的影響，及電化學(xué)中抗蛋白質(zhì)吸附的方法策略，并詳細(xì)綜述活體原位電化學(xué)分析中抗蛋白質(zhì)吸附研究的進(jìn)展。

2?蛋白質(zhì)吸附對電化學(xué)性能的影響

在電化學(xué)傳感器的研究中，不僅需要研究蛋白質(zhì)在電極表面的非特異性吸附，最重要的是研究蛋白質(zhì)吸附對電極電化學(xué)性能的影響。一般認(rèn)為吸附在電極表面的蛋白質(zhì)層是一個惰性的、非電化學(xué)活性的阻礙層， 會影響電極的電化學(xué)性能，如法拉第電流、雙電層電容（Cd1）、電極阻抗，從而影響電極對待測物的電化學(xué)檢測結(jié)果，而且，這種影響隨著電極表面蛋白質(zhì)的覆蓋率增大而加劇[21～23]，影響最大的是電極的法拉第電流。因在任何情況下，電極表面發(fā)生蛋白質(zhì)的非特異性吸附時(shí)，電極表面和電解質(zhì)之間的電子（電荷）轉(zhuǎn)移速率都會受到嚴(yán)重阻礙，探針（或待測物）擴(kuò)散到電極表面發(fā)生氧化還原反應(yīng)也會被阻礙或完全阻止。

蛋白質(zhì)吸附會影響電極/電解質(zhì)界面處靠近電極表面緊密層的結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致電極雙電層結(jié)構(gòu)（雙電層電容）的改變。研究表明：將電極暴露于蛋白質(zhì)溶液中， 會導(dǎo)致電極/電解質(zhì)界面處的電子（電荷）轉(zhuǎn)移電阻（Rct）增加以及電極的Cd1減小。Rct的增加將會導(dǎo)致探針（或待測物）的氧化/還原電位分別正移或者負(fù)移（ΔEp增加）。此外，Cd1的改變受到各種檢測條件的影響[24，25]，例如， 當(dāng)吸附發(fā)生在電極開路電位或更高電位時(shí)，電極的最大電容更大程度的減小; 在相同條件下，與吸附的血清白蛋白相比，免疫球蛋白G（Ig.G）的吸附會導(dǎo)致Cd1減小的更多（圖2）。也有研究表明，吸附的蛋白質(zhì)導(dǎo)致電極Cd1的變化通常約為裸電極的10%，一般電化學(xué)檢測技術(shù)（如計(jì)時(shí)電流法或微分脈沖伏安法）可不考慮，因已經(jīng)扣除了背景充電電流，或者充電電流相對于法拉第電流衰減的較快[25]。

3?電極抗蛋白質(zhì)吸附的策略

蛋白質(zhì)的非特異性吸附過程非常復(fù)雜，一般認(rèn)為是由于蛋白質(zhì)和電極表面強(qiáng)的相互作用引起的。這種相互作用主要包括靜電吸引/排斥相互作用、疏水/親水相互作用、氫鍵和偶極相互作用。研究表明：吸附過程一般不是由單一的某種相互作用決定的，而是由這些相互作用協(xié)同完成的。由于在水體系中，蛋白質(zhì)吸附時(shí)其疏水相互作用的強(qiáng)度更大[26～28]，所以許多減少表面蛋白質(zhì)非特異性吸附的主要策略是增加電極表面的親水性。近年來，研究人員使用一系列抗蛋白質(zhì)吸附的方法和策略，如調(diào)控特殊的電極表面形貌和使用涂層修飾電極表面等方法[29～31]，旨在減少蛋白質(zhì)在電極表面的非特異性吸附，從而提高電極對待檢測物檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

3.1?構(gòu)筑特殊結(jié)構(gòu)的電極表面

目前，特殊表面形貌的構(gòu)筑主要集中在多孔電極的制備，因多孔結(jié)構(gòu)能夠增加電極的孔隙率和表面積、暴露更多的電化學(xué)活性位點(diǎn)、以及阻止蛋白質(zhì)到達(dá)孔電極內(nèi)表面，從而降低蛋白質(zhì)吸附對電極靈敏度造成的不利影響[32～34]。Collinson研究組[35]制備了不同大小孔徑的金電極，分別使用鐵氰化鉀、六氨合釕、二茂鐵甲醇作為電化學(xué)探針， 研究了不同孔徑對蛋白質(zhì)非特異性吸附的影響。他們發(fā)現(xiàn)具有納米孔的金電極在2 mg/mL牛血清白蛋白（BSA）溶液中浸泡1 h后，電極的靈敏度未發(fā)生明顯變化。相比之下，金盤電極、大孔和分級孔的金電極的電流響應(yīng)大幅度降低（圖3A）。納米孔電極提高抗蛋白質(zhì)吸附性能主要是因蛋白質(zhì)能夠吸附到納米孔金電極表面，但無法擴(kuò)散到孔結(jié)構(gòu)的內(nèi)表面，但分子量較小的探針可擴(kuò)散到納米孔結(jié)構(gòu)的內(nèi)表面而發(fā)生氧化還原反應(yīng)，從而在宏觀上減少蛋白質(zhì)吸附對納米多孔金電極電化學(xué)性能的不利影響。該研究組[36]通過脫合金方法制備了抗蛋白質(zhì)吸附的納米多孔金電極，在BSA存在的情況下，實(shí)現(xiàn)了對抗壞血酸（AA）和尿酸（UA）的同時(shí)檢測。 Daggumati等[37]用DNA探針修飾納米多孔金電極，在胎牛血清（FBS）和BSA存在的情況下檢測了DNA分子，他們發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的吸附導(dǎo)致檢測信號僅降低了5%，表明納米孔電極能有效提高抗蛋白質(zhì)吸附的性能。

4?活體電化學(xué)抗蛋白質(zhì)吸附

腦是一個復(fù)雜的系統(tǒng)，不僅有神經(jīng)細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、小分子，還有生物大分子等，如蛋白質(zhì)。在活體伏安法分析中，當(dāng)微電極被植入到活體腦組織中時(shí)，電極會引發(fā)一系列的排異反應(yīng)，從而影響電極的電化學(xué)分析性能[67]。首先，在電極植入到活體的短時(shí)間內(nèi)，蛋白質(zhì)會非特異性吸附到電極表面，從而使電極的靈敏度迅速下降， 響應(yīng)時(shí)間變長。其次，在蛋白質(zhì)吸附之后的幾天內(nèi)，中性粒細(xì)胞的吸附占據(jù)主導(dǎo)地位，在24～48 h 后，中性粒細(xì)胞逐漸消失，并被單核細(xì)胞及巨噬細(xì)胞取代，最終在電極周圍形成由巨噬細(xì)胞和膠原蛋白組成的無血管纖維囊（50～200 μm），以致使物質(zhì)的傳輸和電子轉(zhuǎn)移受阻，最終導(dǎo)致電極靈敏度下降，甚至使電極失去響應(yīng)[68，69]。因此，避免蛋白質(zhì)在電極表面的非特異性吸附（即抗生物污染），同時(shí)提高微電極的電化學(xué)性能對活體電化學(xué)的研究至關(guān)重要。

蛋白質(zhì)吸附導(dǎo)致的一個結(jié)果是微電極必須在植入活體后進(jìn)行校正， 通常認(rèn)為電極在植入到腦內(nèi)一段時(shí)間后蛋白質(zhì)吸附會達(dá)到穩(wěn)定，所以選擇在活體實(shí)驗(yàn)后進(jìn)行電極校正，進(jìn)而分析活體檢測信號[70，71]。但，活體后校正方法仍存在一些問題。首先，活體分析中使用的碳纖維電極比較脆，從腦中取出時(shí)很容易折斷而無法進(jìn)行后校正實(shí)驗(yàn)。其次，后校正方法的提出是基于在整個實(shí)驗(yàn)過程中電極的靈敏度保持不變，這就要求我們的電極在植入活體后，蛋白質(zhì)能夠迅速吸附并達(dá)到平衡。但， 腦內(nèi)蛋白質(zhì)環(huán)境復(fù)雜，且蛋白質(zhì)濃度在不同的生理和病理環(huán)境下可能發(fā)生變化。如干擾素和血小板衍生生長因子等在疾病中濃度會發(fā)生變化[72]，這使得后校正方法對獲取比較真實(shí)的活體檢測信號存在一些偏差。

為了解決蛋白質(zhì)吸附所造成的活體微電極的校準(zhǔn)問題，研究人員提出了一些新的策略。Roberts等[73]基于快速掃描伏安法（FSCV）建立了電極的原位校正方法，該方法借助電極背景中的非法拉第電流等參數(shù)建立模型，通過理論預(yù)測對電極進(jìn)行校正。但該方法僅局限于FSCV，并且影響模型參數(shù)的因素較多，不同的實(shí)驗(yàn)室在使用時(shí)均需要重新測量參數(shù)?？刮鄄牧闲揎楇姌O表面以減小蛋白質(zhì)的非特異性吸附是解決電極靈敏度降低、活體后需要再次校正的另一策略。目前，Nafion，堿處理的醋酸纖維，PEDOT/Nafion等材料在一定程度上可減少蛋白質(zhì)的非特異性吸附[44～48]。 Singh等[48]系統(tǒng)的研究了Nafion、 醋酸纖維、 牽連蛋白修飾碳纖維電極（CFE）對單胺類遞質(zhì)檢測結(jié)果的影響。他們發(fā)現(xiàn)不同材料修飾電極對電極的靈敏度、 選擇性及抗污染性能的影響也不同。有些材料有助于提高電極的選擇性和靈敏度（如Nafion），有些材料則能提高電極的抗污染性能（如醋酸纖維、牽連蛋白）。雖然這些材料可通過控制厚度來提高電極的抗污染性能，但電極在活體實(shí)驗(yàn)后靈敏度仍然有較大的變化，仍需對電極進(jìn)行活體后的校正。

為了克服微電極必須在活體后校準(zhǔn)的缺點(diǎn)，Liu等[10]提出了用BSA處理微電極的方法進(jìn)行活體原位分析，因他們發(fā)現(xiàn)微電極在BSA溶液中，電極的靈敏度會迅速降低，但BSA的濃度大于30 mg/mL時(shí)，電極的靈敏度不再下降， 即使電極在與BSA電荷相反的蛋白質(zhì)溶液中，電流響應(yīng)也很穩(wěn)定?；诖?，他們在活體檢測前用40 mg/mL BSA處理微電極，結(jié)果表明，活體前校準(zhǔn)曲線的靈敏度和活體后校準(zhǔn)曲線的靈敏度一致。 并且， 用BSA處理檢測多巴胺（DA）的CFE和檢測抗壞血酸（AA）的碳納米管修飾CFE，發(fā)現(xiàn)這兩種電極在活體前和活體后的校準(zhǔn)曲線都是一致的， 這說明了BSA處理的方法具有很好的普適性。該方法為活體電化學(xué)方法提供了可靠且簡單的電極前校準(zhǔn)的策略（圖6）。

在提高微電極的抗蛋白吸附能力的同時(shí)保持微電極的靈敏度對活體檢測極其重要，Liu等[17]進(jìn)一步設(shè)計(jì)了聚合物單體EDOT?PC（兩性離子磷酸膽堿官能化的乙烯二氧噻吩），并通過電化學(xué)聚合法將其可控地聚合在微電極表面，形成了具有類細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的PEDOT?PC超薄膜。其中由于PC端的電化學(xué)聚合自限制，形成了非常薄的PEDOT?PC膜，保證了待檢測物在膜內(nèi)的快速傳質(zhì)。因此，PEDOT?PC修飾的微電極不僅能夠有效地抗蛋白質(zhì)的非特異性吸附，而且能保持電極的檢測靈敏度。利用PEDOT?PC修飾的CFE準(zhǔn)確監(jiān)測了大鼠腦內(nèi)KCl刺激，以及電刺激過程中DA的釋放。該研究有效解決了微電極在活體原位分析中蛋白質(zhì)吸附的關(guān)鍵問題，為更好地研究腦神經(jīng)化學(xué)的分子機(jī)制奠定了重要基礎(chǔ)（圖7）。

在微電極的表面構(gòu)筑特殊結(jié)構(gòu)也是有效克服蛋白質(zhì)吸附造成分析性能下降的有效途徑。Zhou等[18]在CFE表面構(gòu)筑了一個高孔隙率的、有序的二氧化硅抗污染薄膜（SNM）。SNM能夠有效地防止蛋白質(zhì)進(jìn)入到通道中引起CFE電極表面的生物污染，同時(shí)對O2的擴(kuò)散具有高滲透性?；铙w實(shí)驗(yàn)表明：SNM/CFE可連續(xù)監(jiān)測O2且能夠保持對其高的分析靈敏度和快速響應(yīng)。為了能夠在構(gòu)筑多孔結(jié)構(gòu)的同時(shí)又具有高的親水性能，F(xiàn)eng等[74]報(bào)道了一種聚單寧酸（PTA）摻雜的納米多孔導(dǎo)電聚苯胺（PANI）膜涂層，其中PANI構(gòu)筑了多孔的結(jié)構(gòu)，PTA的摻雜不僅使得PANI在中性溶液中保持了導(dǎo)電能力，而且PTA的多羥基使得構(gòu)筑的PTA?PANI多孔膜親水性能更強(qiáng)，并對DA具有很強(qiáng)的富集能力。所制備的PTA?PANI修飾的CFE表現(xiàn)出高的抗蛋白吸附的能力，活體前和活體后DA的校準(zhǔn)曲線靈敏度基本一致，并且活體檢測DA的釋放具有高的穩(wěn)定性（圖8）。

在電化學(xué)分析中，蛋白質(zhì)吸附對不同信號輸出方式的影響不同，因此所使用的抗蛋白質(zhì)吸附的方法也不同。Hao等[75]發(fā)展了一種具有高抗蛋白質(zhì)吸附性能的電位型傳感器可用于直接監(jiān)測鼠腦中pH的變化。該電極通過使用H+選擇性膜（H+ISM）和含有增塑劑雙（2?乙基己基）癸二酸酯，H+離子載體三癸胺和離子交換劑鉀四（4?氯苯基）的聚氯乙烯聚合物基質(zhì)制備。體外和體內(nèi)研究均表明，CF?H+ISEs電極具有很強(qiáng)的抗蛋白質(zhì)吸附性能，CF?H+ISE能夠在活體檢測后保持和活體前相同的靈敏度和可逆性（圖9）。

此外，使用紅細(xì)胞膜修飾Ag/AgCl設(shè)計(jì)的參比電極也表現(xiàn)出優(yōu)異的抗蛋白質(zhì)吸附的性能[76]，在活體內(nèi)能提供穩(wěn)定的電位并減小對組織的損傷。

5?結(jié) 論

在活體電化學(xué)分析中，微電極抗蛋白質(zhì)吸附層的設(shè)計(jì)對提高活體檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度，以及正確理解大腦功能的分子機(jī)制，都具有十分重要的意義。雖然在宏觀電極上，目前有很多抗污染的方法可實(shí)現(xiàn)抗蛋白質(zhì)的吸附，并能實(shí)現(xiàn)部分復(fù)雜樣品，如血液等中的物質(zhì)的分析，活體內(nèi)通過電極界面設(shè)計(jì)也實(shí)現(xiàn)了部分物質(zhì)的短時(shí)間實(shí)時(shí)分析，但活體分析抗蛋白質(zhì)的吸附仍然存在很大的挑戰(zhàn)。這主要是因?yàn)椋海?）在宏觀電極上可實(shí)現(xiàn)的策略，很難在微電極上實(shí)現(xiàn)，如表面微結(jié)構(gòu)的調(diào)控，表面修飾等，因微電極表面需要更苛刻的合成條件和原位可控修飾技術(shù); （2）抗蛋白質(zhì)吸附策略物質(zhì)依賴性強(qiáng)，不同信號讀出方式，信號轉(zhuǎn)換方式的抗蛋白質(zhì)吸附策略也不一樣，需依據(jù)不同信號讀出方式（如電流法、電位法、電阻法等）和不同轉(zhuǎn)換方式（如酶、適配體等）設(shè)計(jì)不同的抗蛋白質(zhì)吸附的策略[77～80]; （3）活體長期檢測需要抗蛋白質(zhì)膜具有更高的生物相容性和化學(xué)穩(wěn)定性。相信，隨著各學(xué)科的發(fā)展，如材料科學(xué)、微納制備技術(shù)、信號轉(zhuǎn)換和讀出模式等，能更好地解決微電極的蛋白質(zhì)吸附的問題，實(shí)現(xiàn)腦內(nèi)化學(xué)物質(zhì)的準(zhǔn)確分析，更好地揭示腦神經(jīng)科學(xué)的化學(xué)本質(zhì)。

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Recent Advances on Antifouling of Microelectrode

for in Vivo Electrochemistry

FENG Tao?Tao， ?ZHANG Shuai， ?ZHANG Li， ?ZHANG Mei?Ning*

（Department of Chemistry， ?Renmin University of China， ?Beijing 100872， ?China）

Abstract?In vivo electrochemistry is one of the attractive approaches for tracking of the dynamic of neurochemicals in the brain. Carbon fiber electrodes （CFE） are usually implanted in specific brain regions for monitoring neurochemicals due to its high spatial and temporal resolution， ?high sensitivity and small brain tissue damage. However， ?the implantation of CFE can trigger a series of negative effects for in vivo analysis. On the one hand， ?protein nonspecific adsorption causes the decrease in electrodes sensitivity. On the other hand， ?protein?mediated cell adhesion on microelectrode surface can lead to microchemical environment changes around the microelectrode， ?which affects the accuracy and reliability of the detection results toward neurochemicals. In addition， ?the resulting fibrous capsule blocks electron transfer between electrode surface and electrolyte， ?resulting in failure in terms of sensing. In this paper， ?we briefly introduced the effect of protein adsorption on the electrochemical performance and reviewed the recent advances on antifouling of microelectrode for in vivo electrochemistry.

Keywords?In vivo electrochemistry; ?Microelectrode; ?Protein nonspecific adsorption; ?Antifouling; ?Review